附桂骨痛制剂的指纹图谱的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及中药分析领域，具体而言，涉及一种附桂骨痛制剂的指纹图谱的构建方法及其应用。

背景技术

中药质量关系到临床疗效和安全，建立中药质控方法是中医药发展的关键问题之一。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的色谱鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，可以鉴别成品质量的均一性和稳定性。附桂骨痛制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。

与化学制剂相比，传统中医的整体观决定了需要对中药中多种成分进行综合评价，但中药及其制剂中化学成分的多样性、复杂性以及相互间的协同作用，决定了质量指标难以用单一成分或几个成分来准确、全面地表达中药的质量和疗效。指纹图谱技术是近年逐渐发展起来的一项质量控制技术，它具有信息量大，特征性强，能整体控制多种组分的特点。因此，建立附桂骨痛颗粒的指纹图谱以从药物物质整体的角度对附桂骨痛颗粒的药品质量进行控制是非常必要的。

附桂骨痛制剂的组方源自千年经典医著《金匮要略》之中的乌头汤，以大辛大热之附子补火助阳，散寒止痛，川乌祛风除湿，温经止痛，为君药。党参健脾益气，以资化源；当归补血养血，通脉止痛；白芍养血滋阴，柔筋止痛；淫羊藿益精气，强腰膝，共为臣药。乳香香窜通经，活血伸筋，消肿定痛；肉桂散寒止痛，活血通经，以增强附子、川乌的温阳散寒作用，共为佐药。诸药合用，共收温阳散寒，益气活络，消肿止痛之功。对颈椎及膝关节性关节炎治疗效果显著，能快速消除骨关节疼痛、屈伸不利、麻木肿胀、遇热则减、畏寒肢冷等临床症状。其有效成分的原料组成及其重量配比为附子(制)266g，制川乌133g，肉桂67g，党参200g，当归200g，炒白芍200g，淫羊藿200g，醋乳香133g。现有技术中尚无对附桂骨痛制剂的指纹图谱的探究。因此，建立能够反馈该药的整体化学特征指纹图谱，对在质量控制方面的具有较高应用价值。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种附桂骨痛制剂的指纹图谱的构建方法及其应用，以解决现有技术中对于附桂骨痛制剂的分析难以全面反映该制剂中各成分的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种附桂骨痛制剂的指纹图谱的构建方法，该构建方法包括：a)对照品溶液的制备：以淫羊藿苷为对照品，加溶液溶解，得到淫羊藿苷对照品溶液；b)供试品溶液的制备：向附桂骨痛制剂中加甲醇水溶液，超声，过滤得供试品溶液；c)将供试品溶液和淫羊藿苷对照品溶液置于高效液相色谱仪中，测定获得供试品溶液的高效液相色谱图和对照品溶液的高效液相色谱图，将供试品溶液的高效液相色谱图和对照品溶液的高效液相色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析，从而获得附桂骨痛制剂的指纹图谱；附桂骨痛制剂包括制附子、制川乌、肉桂、党参、当归、炒白芍、淫羊藿和醋乳香。

进一步地，高效液相色谱仪的色谱条件包括：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.01-0.15％无机酸的水溶液为流动相B，流速为0.6-1.2mL/min，柱温为25-35℃，检测波长200-400nm，梯度洗脱；洗脱条件为：0-10min，流动相A的体积分数由4％上升至6％，流动相B的体积分数由96％下降至94％；10-20min，流动相A的体积分数由6％上升至13％，流动相B的体积分数由94％下降至87％；20-35min，流动相A的体积分数由13％上升至22％，流动相B的体积分数由87％下降至78％；35-48min，流动相A的体积分数由22％上升至33％，流动相B的体积分数由78％下降至67％；48-62min，保持流动相A的体积分数为33％，流动相B的体积分数为67％；62-78min，流动相A的体积分数由33％上升至100％，流动相B的体积分数由67％下降至0％；78-85min，保持流动相A的体积分数为100％，流动相B的体积分数为0％；85-90min，流动相A的体积分数由100％下降至4％，流动相B的体积分数由0％上升至96％；90-94min，保持流动相A的体积分数为4％，流动相B的体积分数为96％。

进一步地，高效液相色谱法的色谱条件包括：色谱柱为Agilent 5TC-C18色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.05％无机酸的水溶液为流动相B，检测波长为230nm，柱温为30℃，流速为0.8mL/min；优选地，无机酸的水溶液包括磷酸水溶液。

进一步地，供试品溶液的制备包括：1)取附桂骨痛制剂，研细，取约1.5g，精密称定，置于25mL容量瓶中；2)向25mL容量瓶加入50％甲醇水溶液，超声30min，冷却至室温后定容至刻度，摇匀；3)使用0.45μm微孔滤膜过滤25mL容量瓶中的溶液，得供试品溶液。

进一步地，附桂骨痛制剂的剂型选自颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服液或注射剂中的一种。

进一步地，附桂骨痛制剂包括附桂骨痛片、附桂骨痛颗粒或附桂骨痛胶囊。

为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种附桂骨痛制剂的质量检测方法，包括采用上述构建方法检测待测样品，获得待测样品指纹图谱，将得到的待测样品指纹图谱与相同指纹图谱检测条件下获得的标准指纹图谱进行相似度比较。

进一步地，标准指纹图谱中共有峰为13个，9号峰为淫羊藿苷的峰，以9号峰为定位峰，相对保留时间为1.000；其他12个共有峰的平均相对保留时间为：1号峰平均相对保留时间为0.190±0.005；2号峰平均相对保留时间为0.214±0.005；3号峰平均相对保留时间为0.593±0.005；4号峰平均相对保留时间为0.606±0.005；5号峰平均相对保留时间为0.642±0.005；6号峰平均相对保留时间为0.759±0.005；7号峰平均相对保留时间为0.809±0.005；8号峰平均相对保留时间为0.975±0.005；10号峰平均相对保留时间为1.072±0.005；11号峰平均相对保留时间为1.083±0.005；12号峰平均相对保留时间为1.263±0.005；13号峰平均相对保留时间为1.312±0.005。

为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种附桂骨痛制剂指纹图谱的筛选方法，包括下列步骤：1)单味药材样品溶液的制备：将制附子、制川乌、肉桂、党参、当归、炒白芍、淫羊藿或醋乳香中任一种或多种，按上述构建方法的步骤a)进行制备，分别获得至少一种单味药材样品溶液；2)测定：采用与上述构建方法的步骤c)中相同色谱条件的高效液相色谱法测定单味药材样品溶液，获得单味药材样品溶液的指纹图谱；3)标准指纹图谱的取得：采用与上述构建方法相同的步骤，得到附桂骨痛制剂指纹图谱；4)质量检测：将单味药材样品溶液的指纹图谱，与附桂骨痛制剂指纹图谱进行比较，通过相对保留时间，指认出单味药材样品溶液在附桂骨痛制剂指纹图谱中的相应特征峰，从而对单味药材样品溶液的指纹图谱中的特征峰进行归属定位；附桂骨痛制剂包括制附子、制川乌、肉桂、党参、当归、炒白芍、淫羊藿和醋乳香。

进一步地，甲醇水溶液每200-300mL中加入的制附子的量为3.99g、制川乌的量为1.99g、肉桂的量为1.00g、党参的量为3.00g、当归的量为3.00g、炒白芍的量为3.00g、淫羊藿的量为3.00g、醋乳香的量为1.99g。

应用本发明的技术方案，建立了附桂骨痛制剂的高效液相指纹图谱，从不同侧面突出反映不同类别化学成分对附桂骨痛制剂指纹图谱系统的贡献，从而实现对附桂骨痛制剂全方化学成分的检测。方法简单，稳定、可靠，精密度、重复性好，便于质量控制。相比直接检测制剂中几种化学成分，具有操作简便，信息量大的优点，能全面地控制附桂骨痛颗粒的质量，为更好地建立附桂骨痛制剂整体质量控制评价体系提供科学试验依据。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了根据本发明实施例4的各批附桂骨痛颗粒图谱与对照指纹图谱。

图2示出了根据本发明实施例4的对照指纹图谱。

图3示出了根据本发明实施例5的供试品及药材分析图谱。

图4示出了根据本发明实施例5的供试品及阴性样品分析图谱。

图5示出了根据本发明实施例5的供试品及对照品分析图谱。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

如背景技术所提到的，现有技术中对附桂骨痛制剂的分析停留在对于单一化合物的分析。因而，在本申请中发明人尝试开发一种新的对于附桂骨痛制剂的构建方法，采用高效液相色谱法建立附桂骨痛制剂的指纹图谱。因而提出了本申请的一系列保护方案。

在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种附桂骨痛制剂的指纹图谱的构建方法，该构建方法采用高效液相色谱法建立附桂骨痛制剂的指纹图谱，构建方法包括：a)对照品溶液的制备：以淫羊藿苷为对照品，加溶液溶解，得到淫羊藿苷对照品溶液；b)供试品溶液的制备：向附桂骨痛制剂中加甲醇水溶液，超声，过滤得供试品溶液；c)将供试品溶液和淫羊藿苷对照品溶液置于高效液相色谱仪中，测定获得供试品溶液的高效液相色谱图和对照品溶液的高效液相色谱图，将供试品溶液的高效液相色谱图和对照品溶液的高效液相色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析，从而获得附桂骨痛制剂的指纹图谱，附桂骨痛制剂包括制附子、制川乌、肉桂、党参、当归、炒白芍、淫羊藿和醋乳香。

本申请中，对于指纹图谱的相似度评价，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)。本申请的制附子在现有技术中也常写作附子(制)。

在一种优选的实施例中，高效液相色谱仪的色谱条件包括：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.01-0.15％无机酸的水溶液为流动相B，流速为0.6-1.2mL/min，柱温为25-35℃，检测波长200-400nm，梯度洗脱；洗脱条件为：0-10min，流动相A的体积分数由4％上升至6％，流动相B的体积分数由96％下降至94％；10-20min，流动相A的体积分数由6％上升至13％，流动相B的体积分数由94％下降至87％；20-35min，流动相A的体积分数由13％上升至22％，流动相B的体积分数由87％下降至78％；35-48min，流动相A的体积分数由22％上升至33％，流动相B的体积分数由78％下降至67％；48-62min，保持流动相A的体积分数为33％，流动相B的体积分数为67％；62-78min，流动相A的体积分数由33％上升至100％，流动相B的体积分数由67％下降至0％；78-85min，保持流动相A的体积分数为100％，流动相B的体积分数为0％；85-90min，流动相A的体积分数由100％下降至4％，流动相B的体积分数由0％上升至96％；90-94min，保持流动相A的体积分数为4％，流动相B的体积分数为96％。

上述采用高效液相色谱法建立附桂骨痛制剂的指纹图谱，通过优化色谱条件、供试品溶液的制备方法，使制剂中的各化学成分实现较好的分离，从而建立了针对该中药制剂的指纹图谱的方法，获得了较为全面的图谱信息。有利于附桂骨痛制剂质量的可控性和产品质量的稳定性的提升，对指纹图谱中多个目标成分尤其是有效成分进行准确定量，使中药质量控制更加准确，能从根本上保证中药材质量以及批与批之间产品质量的一致性。

在一种优选的实施例中，高效液相色谱法的色谱条件包括：色谱柱为Agilent5TC-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈为流动相A，以0.05％无机酸的水溶液为流动相B，检测波长为230nm，柱温为30℃，流速为0.8mL/min；优选地，无机酸的水溶液包括磷酸水溶液。

在一种优选的实施例中，供试品溶液的制备包括：1)取附桂骨痛制剂，研细，取约1.5g，精密称定，置于25mL容量瓶中；2)向25mL容量瓶加入50％甲醇水溶液，超声30min，冷却至室温后定容至刻度，摇匀；3)使用0.45μm微孔滤膜过滤25mL容量瓶中的溶液，得供试品溶液。

在一种优选的实施例中，附桂骨痛制剂的剂型选自颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服液或注射剂中的一种。

在一种优选的实施例中，附桂骨痛制剂包括附桂骨痛片、附桂骨痛颗粒或附桂骨痛胶囊。

在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种附桂骨痛制剂的质量检测方法，包括采用上述构建方法检测待测样品，获得待测样品指纹图谱，将得到的待测样品指纹图谱与相同指纹图谱检测条件下获得的标准指纹图谱进行相似度比较。

通过比较待测样品指纹图谱与标准指纹图谱，能够鉴别待测样品中的多种化合物的种类和含量，并通过单味药材特征峰的归属，从而确定待测样品以及样品中单味药材的质量。

在一种优选的实施例中，标准指纹图谱中共有峰为13个，9号峰为淫羊藿苷的峰，以9号峰为定位峰，相对保留时间为1.000；其他12个共有峰的平均相对保留时间为：1号峰平均相对保留时间为0.190±0.005；2号峰平均相对保留时间为0.214±0.005；3号峰平均相对保留时间为0.593±0.005；4号峰平均相对保留时间为0.606±0.005；5号峰平均相对保留时间为0.642±0.005；6号峰平均相对保留时间为0.759±0.005；7号峰平均相对保留时间为0.809±0.005；8号峰平均相对保留时间为0.975±0.005；10号峰平均相对保留时间为1.072±0.005；11号峰平均相对保留时间为1.083±0.005；12号峰平均相对保留时间为1.263±0.005；13号峰平均相对保留时间为1.312±0.005。

在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种附桂骨痛制剂指纹图谱的筛选方法，包括下列步骤：1)单味药材样品溶液的制备：将制附子、制川乌、肉桂、党参、当归、炒白芍、淫羊藿或醋乳香中任一种或多种，按上述构建方法的步骤a)进行制备，分别获得至少一种单味药材样品溶液；2)测定：采用与上述构建方法的步骤c)中相同色谱条件的高效液相色谱法测定单味药材样品溶液，获得单味药材样品溶液的指纹图谱；3)标准指纹图谱的取得：采用与上述构建方法相同的步骤，得到附桂骨痛制剂指纹图谱；4)质量检测：将单味药材样品溶液的指纹图谱，与附桂骨痛制剂指纹图谱进行比较，通过相对保留时间，指认出单味药材样品溶液在附桂骨痛制剂指纹图谱中的相应特征峰，从而对单味药材样品溶液的指纹图谱中的特征峰进行归属定位；附桂骨痛制剂包括制附子、制川乌、肉桂、党参、当归、炒白芍、淫羊藿和醋乳香。

在一种优选的实施例中，甲醇水溶液每200-300mL中加入的制附子的量为3.99g、制川乌的量为1.99g、肉桂的量为1.00g、党参的量为3.00g、当归的量为3.00g、炒白芍的量为3.00g、淫羊藿的量为3.00g、醋乳香的量为1.99g。

下面将结合具体的实施例来进一步详细解释本申请的有益效果。

实施例1色谱条件与系统适用性试验

采用Agilent 5TC-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸溶液为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为230nm；柱温为30℃；流速为每分钟0.8mL。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于3000。

表1

实施例2

1.参照物溶液的制备

对照品溶液的制备：取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含40μg的溶液，即得。

其他对照品的配置方法与淫羊藿苷对照品相同，芍药苷对照品的浓度为40μg/mL，阿魏酸对照品的浓度为20μg/mL，桂皮醛对照品的浓度为10μg/mL。

2.供试品溶液的制备

取本品适量，研细，取约1.5g，精密称定，置于25mL容量瓶中，加入50％甲醇适量，超声30min，至室温后定容至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

实施例3方法学考察

1.精密度考察

取同一批附桂骨痛颗粒供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图，以9号峰为参照峰(S)，结果各共有峰的相对保留时间的RSD均<3％，相对峰面积的RSD均<5％，表明仪器精密度较好。结果见表2、表3。

表2

表3

2.稳定性考察

取同一批附桂骨痛颗粒供试品，分别在0，2，4，6，8，10，12，24h进样，记录色谱图，以9号峰为参照峰(S)，结果各共有峰的相对保留时间的RSD均<3％，相对峰面积的RSD均<5％，表明在24h内供试品溶液稳定性良好。结果见表4、表5。

表4

表5

3.重复性考察

用同一批号附桂骨痛颗粒同时制备6份供试品溶液，分别进样，记录色谱图，以9号峰为参照峰(S)，结果各共有峰的相对保留时间的RSD均<3％，相对峰面积的RSD<5％，表明该方法重复性较好。结果见表6、表7。

表6

表7

实施例4指纹图谱的建立与相似度分析

取10批附桂骨痛颗粒和对照品按上述方法制备，按色谱条件测定。采用“中药指纹图谱相似度评价系统”(2012.0版)进行评价，如图1以S1为参照图谱，生成图2所示的对照图谱R，共有13个共有峰，其中9号峰(淫羊藿苷)为参照峰(S)，各批附桂骨痛颗粒与对照指纹图谱比较相似度在0.9～1.0，见表8。

表8 10批样品相似度

实施例5专属性考察

按供试品制备方法同时制备8味药材样品(分别为附子(制)、制川乌、肉桂、党参、当归、炒白芍、淫羊藿和醋乳香)、阴性样供试品、附桂骨痛颗粒(供试品)、对照品(淫羊藿苷、芍药苷、阿魏酸、桂皮醛)的溶液，分别进样，记录色谱图，依据所得图谱，确定各特征峰的归属。结果见图3、图4、图5，表9。

阴性样供试品(阴性样品)，指不含某种药材的样品，如制附子阴性样品(即空附子)，指该样品中不含制附子药材。

本申请所用试剂均为市售产品，其中对照品来源于中国食品药品检定研究院。

表9

如上所述，本发明提供的一种附桂骨痛制剂的构建方法及其应用，采用优化反应条件的前处理及高效液相色谱方法，建立了附桂骨痛制剂的高效液相指纹图谱，从不同侧面突出反映不同类别化学成分对附桂骨痛制剂指纹图谱系统的贡献，从而实现对附桂骨痛制剂全方化学成分的检测，为附桂骨痛制剂的质量标准提供参考依据。本发明首次建立的附桂骨痛制剂指纹图谱的构建方法，其精密度和重复性良好，确定了13个共有峰，13个共有峰分别归属于附桂骨痛颗粒的8种药材中，全面反映附桂骨痛颗粒各种成分的分布和比例关系。各共有峰的相对保留时间的RSD<5％，多批次杞菊地黄丸样品的相似度评价结果均大于0.99，并能保持供试品溶液在24h内稳定性良好。

本发明提供的方法还能够对附桂骨痛制剂中各单味药材色谱峰进行了归属确证，指纹图谱体现了制附子、制川乌、肉桂、党参、当归、炒白芍、淫羊藿、醋乳香的特征峰。该方法能实现从原料源头进行有效监测，严格控制原药材的质量，保证附桂骨痛制剂中有效成分量的相对稳定，从而保证临床用药的安全有效性。本发明建立的高效液相指纹图谱方法首次实现了对附桂骨痛制剂的质量控制，不是对单一化合物或药材进行鉴别，且方法简单，稳定、可靠，精密度、重复性好，便于质量控制。相比直接检测制剂中几种化学，具有操作简便，信息量大的优点，能全面地控制附桂骨痛颗粒的质量，为更好地建立附桂骨痛制剂整体质量控制评价体系提供科学试验依据。本发明建立的附桂骨痛制剂指纹图谱方法基于药材的药效物质基础，分波段检测，实现一张图谱涵盖多个药材的药效物质。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。