一株能稳定分泌抗芋螺毒素μ-KIIIA-CTX单克隆抗体的杂交瘤细胞株

技术领域

本发明属于抗体工程与免疫检测领域，具体涉及一株能分泌抗芋螺毒素μ-KIIIA-CTX单克隆抗体的杂交瘤细胞株3E11。

背景技术

芋螺毒素（Conotoxin，CTX），由生活在热带海洋中的肉食性软体动物芋螺分泌，是用于麻醉猎物的小肽类毒素。它们是由10~41个氨基酸残基组成的，是富含半胱氨酸的动物神经肽毒素。具有特异性结合动物体内各种离子通道和受体的特殊功能。芋螺毒素种类繁多，结构新颖，选择性强，疗效确切，在成瘾、麻醉、镇痛和研究治疗精神疾病、癌症和心脏疾病等方面具有极好的应用前景，已成为神经科学研究和新药研发的新来源。

芋螺毒素μ-KIIIA- CTX是从木下芋螺（Asprella kinoshitai）中发现的新超家族芋螺毒素，属于M-基因超家族，μ家族。芋螺毒素μ-KIIIA- CTX含有16个氮基酸，可特异性作用于钠离子通道受体。含有六个半胱氨酸模式，其中自然状态下的二硫键连接方式主要是Cysl-Cys9，Cys2-Cys15和Cys4-Cys16。

芋螺毒素μ-KIIIA- CTX作为其家族中结构最简单的一员，其特异性作用的电压门控钠通道(NaVs)已被证明在动物和人类的疼痛中发挥重要作用，近年来的研究比较热门。但芋螺毒素μ-KIIIA- CTX的检测方法未有报道，也未有关于芋螺毒素μ-KIIIA- CTX单克隆抗体的开发和应用，因此开展关于芋螺毒素μ-KIIIA- CTX单克隆抗体的制备及建立基于单克隆抗体的免疫检测方法具有重要意义。

酶联免疫吸附（ELISA）技术是建立在免疫学基础上发展起来的，是将具有免疫活性的抗原或者抗体与酶结合成具有免疫活性和酶活性的酶标抗原或者酶标抗体，使之能够与待测样品结合形成复合产物，最后通过测定而能够对待测样品实现定量分析，具有灵敏性高，特异性强且操作简便，成本低的特点，在现代医学研究，食品化学分析，生物学等各大领域得到广泛应用，如今已发展有夹心法、间接法、直接法、竞争法四种技术方法。

芋螺毒素μ-KIIIA-CTX是小分子多肽，比较适合通过ELISA方法进行检测，目前还未有关于其基于单克隆抗体的ELISA免疫分析方法建立，因此，制备出能够稳定分泌抗芋螺毒素μ-KIIIA-CTX的单克隆抗体杂交瘤细胞株，为商品化开发生产高质量的酶联检测试剂盒奠定夯实基础。

发明内容

本发明目的在于提供一株能分泌抗芋螺毒素μ-KIIIA-CTX单克隆抗体的杂交瘤细胞株3E11。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明首先提供了一株杂交瘤细胞株3E11，所述杂交瘤细胞株3E11的分类命名为抗芋螺毒素μ-KIIIA-CTX单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2021年12月03日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏地址为：北京朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No. 45004。

本发明还提供了一种抗芋螺毒素μ-KIIIA-CTX单克隆抗体，所述的抗芋螺毒素μ-KIIIA-CTX单克隆抗体亚型为IgG1，V

本发明还提供了上述一种抗芋螺毒素μ-KIIIA-CTX单克隆抗体在检测芋螺毒素μ-KIIIA-CTX中的应用。

本发明还提供了一种芋螺毒素μ-KIIIA-CTX检测试剂盒，所述的芋螺毒素μ-KIIIA-CTX检测试剂盒包含上述的抗芋螺毒素μ-KIIIA-CTX单克隆抗体。

本发明的显著优点在于：

目前还未有开发出芋螺毒素μ-KIIIA-CTX的单克隆抗体（IgG）的报道，更未见有关于芋螺毒素μ-KIIIA-CTX的ELISA免疫检测方法。本发明使用的免疫分析方法相较于现有的检测方法来说，具有特异性好，灵敏度高，精确度强，操作简单，成本低等特点，适合大批量样品检测。

附图说明

图1是本发明重组抗原的表达与纯化SDS-page电泳图。泳道M：蛋白Maker；泳道1：空载pET-32a总蛋白；泳道2：pET-32a-

图2是本发明免疫小鼠血清效价测定。

图3是本发明细胞融合结果。

图4是本发明抗体纯化结果鉴定。泳道M：Maker；泳道1：腹水总蛋白；泳道2：纯化的抗芋螺毒素μ-KIIIA-CTX单克隆抗体。

图5是本发明杂交瘤细胞株染色体分析。

图6是本发明单克隆抗体亲和力检测结果。

图7是本发明单克隆抗体间接ELISA特异性分析结果。

图8是本发明单克隆抗体间接竞争ELISA标准检测曲线图。

图9是本发明单克隆抗体间接竞争ELISA标准检测直线图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明的杂交瘤细胞株3E11，其分类命名为抗芋螺毒素μ-KIIIA-CTX单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2021年12月03日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏地址为：北京市朝阳区北层西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号是：CGMCC No. 45004。

实施例1单克隆抗体的制备与鉴定

1 抗原载体构建

（1）芋螺毒素μ-KIIIA-CTX（以下统一表述为μ-CTX）蛋白质序列及基因序列的获得

在文献（doi.org/10.1074/jbc.M704616200）中查找到μ-CTX的氨基酸序列为：

CCNCSSKWCRDHSRCC*

依据大肠杆菌BL21(DE3)的密码子偏好性，优化μ-CTX毒素的DNA序列（以下统一表述为

5’-TGCTGCAACTGCTCTAGCAAATGGTGCCGTGATCACAGCCGTAGCTGC-3’

2）

μ-ctx

μ- ctx

5’-

μ- ctx

5’-

两引物退火互补结合后即为插入片段，可直接与同样经过

3）重组质粒pET-32a-

使用

3）重组质粒pGEX-6p-1-

使用

4）重组质粒的筛选、检测

分别挑取上述平板上的多个单菌落，接种于700μL LB液体培养基，180 r/min摇床培养45min后, 将菌体送去测序鉴定，测序正确的菌株分别命名为pET-32a-

2 重组抗原的表达与纯化

1）菌株pET-32a-

取1 mL新鲜菌液接种于100 mL LB液体培养基（100 μg/mL Ampicillin），37℃、180 r/min摇床培养2~3 h。待菌液OD600 nm为0.6~0.8时，向其中加入100 μL浓度为1 mol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），置于25℃摇床中培养过夜。

将33 mL菌液收集至一个洁净的离心管中，置于4℃冷冻离心机中离心10 min，转速8000 r/min，离心之后弃掉上清，收集离心管内的菌体沉淀，然后向沉淀中加入7 mL事先配置好的Buffer A（70 mM NaH

2）菌株pGEX-6p-1-

取1 mL新鲜菌液接种于100 mL LB液体培养基（100 μg/mL Ampicillin），37℃、180 r/min摇床培养2~3 h。待菌液OD600 nm为0.6~0.8时，向其中加入100 μL浓度为1 mol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），体系终浓度1mmol/L，置于20℃摇床中培养过夜。

将33 mL菌液收集至一个洁净的离心管中，置于4℃冷冻离心机中离心10 min，转速8000 r/min，离心之后弃掉上清，收集离心管内的菌体沉淀，然后向沉淀中加入7 mL0.01M pH7.4的PBS缓冲液将菌体重悬。用超声破碎仪破碎，工作5 s，暂停10 s，直至菌液由浑浊变澄清。将超声破碎后的菌液置于4℃冷冻离心机离心10 min，转速10000 r/min，离心之后收集上清液。上柱：将上清液加入事先用0.01M pH7.4的PBS缓冲液平衡的GST亲和层析柱中，反复上柱结合2 h左右，循环8次。洗杂：上柱结束后穿流200 mL 0.01M pH7.4的PBS缓冲液洗去杂蛋白分子。洗脱：最后用GSH溶液（10mmol/mL GSH+50mmol/mLTris-HCl，pH8.0）将目的蛋白洗脱并收集。

3）蛋白的验证

取20 μL纯化所得蛋白溶液，向其中加入10 μL 5×SDS-PAGE loading buffer，用移液枪充分混匀，沸水浴10min，离心后吸取10 μL上清进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图1所示。

3 单克隆抗体的制备

1）小鼠免疫

以上述制备的完全抗原GST-μ-CTX免疫6-8周龄雌性

首次免疫时将Freund’s完全佐剂等体积与完全抗原GST-μ-CTX混合，用乳化仪将混合物乳化至油包水状态，乳化的结果以滴到水中不会立即散开为判断标准，乳化后对Balb/c小鼠进行皮下多点注射，抗原注射剂量为100μg/只，注射体积为200μL/只。后续每间隔14天进行一次免疫，第一次免疫之后将Freund’s完全佐剂替换成Freund’s不完全佐剂，抗原注射剂量调整为50μg/只，其他步骤同首次免疫。免疫三次后尾部取血，以TRX-μ-CTX融合蛋白作为检查抗原包被酶标条，iELISA检测血清效价。直至小鼠抗血清效价在1:8000稀释度下OD

2）免疫血清效价测定

在小鼠第三次免疫后的5~7 d内，用间接酶联免疫吸附测定法（Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，iELISA）检测小鼠抗血清效价，操作步骤如下：

（1）抗血清采集：从小鼠尾部静脉取血，所获得血液在37℃水浴锅内静置30 min，后在4℃条件下12000 r/min离心20 min，吸取上层血清，备用。

（2）包被：用包被缓冲液CBS（1.59 g Na

（3）封闭（Block）：配制PBSM溶液（5wt%脱脂奶粉+0.01 M pH7.4的PBS缓冲液），按200μL/孔加入到酶标孔中，置于4℃冰箱里封闭一天后，用0.01M pH7.4的PBS缓冲液洗板3次，洗完拍干。

（4）一抗：用PBSM溶液将步骤（1）采集得到的抗血清以1:500为起始稀释度作倍比稀释，依次加入酶标孔，每孔100 μL，放置37℃恒温箱孵育1 h，同时用PBSM溶液作阴性对照。后将孔内液体倒出，用PBS（0.01M pH7.4）和PBST（Vtween20/VPBS =0.05%）各洗板3次，洗完拍干。

（5）二抗：用PBSM溶液以1:8000的稀释比稀释酶标二抗（羊抗鼠-偶联辣根过氧化物酶，HAMA-HRP），每孔加入100 μL二抗，于37℃恒温箱孵育45min。后将孔内液体倒出，用PBS（0.01M pH7.4）和PBST各洗板3次，洗完拍干。

（6）显色：量取TMB A液（17 mM C

（7）终止：取出显色后的酶标板，随即向酶标孔中加入2M H

3）细胞融合

在第五次免疫一周后，进行加强免疫，第三天取小鼠的脾脏，经研磨过滤获得脾细胞。以SP2/0细胞：脾细胞=3:1的数量比例混合两者，室温1100 r/min离心7 min，弃掉上清液，轻弹离心管至细胞沉淀弹松散。将含有细胞沉淀的离心管置于37℃温水中水浴，向其中缓缓滴加1 mL预热的50%（w/v）PEG 1450溶液，滴加过程按照先慢后快的原则，在1 min钟内加完，之后静置1 min。静置之后，缓慢加入40 mL预热的1640不完全培养基终止融合，按照先慢后快的滴加原则，头一分钟内缓慢滴加1 mL培养基，第二分钟内加完3 mL培养基，第三分钟内加完5 mL培养基，以此类推，直至加完40 mL 1640不完全培养基，之后将细胞混合液放置CO

4）阳性杂交瘤细胞的筛选

在细胞融合之后的第8 d，利用iELISA法对融合后的细胞进行筛选。事先用包被缓冲液CBS（1.59g Na

5）腹水的制备与纯化

将杂交瘤细胞株3E11以1×10

4 单克隆抗体的特性鉴定

1）染色体分析：用0.1wt%秋水仙素（0.5 μg/L）处理处于生长对数期的杂交瘤细胞3E11，培养6 h后细胞周期同步于有丝分裂中期，悬起细胞，将细胞重悬液收集至15 mL离心管内，室温离心8 min，转速1200 r/min，离心后轻轻倒掉上清，向每管的细胞沉淀中加入10mL 0.075 mol/L氯化钾溶液，用移液枪轻柔地将细胞吹起，细胞悬液置于37℃培养箱继续孵育30 min。在细胞悬液中加入1 mL新鲜配置的甲醇-冰醋酸固定液（甲醇：冰醋酸的体积比为3:1），摇匀之后室温静置5 min，室温下1200 r/min离心8 min，向离心后的沉淀中再次加入5mL新鲜配置的甲醇-冰醋酸固定液，用移液枪轻轻吹起细胞沉淀，室温静置30min，之后在室温下1200 r/min离心8 min，向离心后的沉淀中加入5mL新鲜配置的甲醇-冰醋酸固定液，用移液枪吹起摇匀，置于4℃冰箱过夜。隔天取出在室温下1200 r/min离心8 min，将离心后的细胞沉淀用300μL新鲜配置的甲醇-冰醋酸固定液吹起摇匀。在冰冻的载玻片上滴加10μL细胞悬液，立即吹散，自然干燥，用新配制1:10 Giemsa磷酸缓冲液染色10-15 min，蒸馏水冲洗，晾干后镜检，显微照相与核型分析。如图5所示，用0.1wt%秋水仙素对阳性杂交瘤细胞3E11进行处理后，染色并显微镜下观测，计算处于分裂中期的杂交瘤细胞的染色体数目为103±5条，杂交瘤细胞的染色体数目接近于两个亲本的染色体数目之和，证明该阳性杂交瘤细胞为骨髓瘤细胞与脾细胞融合而成。

2）单克隆抗体亲和力测定

根据Beatty的方法（doi.org/10.1016/0022-1759(87)90187-6），用iELISA进行单克隆抗体亲和力常数Kaff的测定。用包被缓冲液CBS将TRX-μ-CTX融合蛋白分别稀释成10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL包被在ELISA酶标板中。用5% PBSM对纯化后的单克隆抗体倍比稀释作一抗，将抗体分别稀释成59.6ng/mL、29.8ng/mL、14.9ng/mL、7.45ng/mL、3.73ng/mL、1.863ng/mL、0.933ng/mL、0.466ng/mL。取出事先包被好的酶标板，每种稀释度的酶标条由上至下依次加入不同稀释度的抗体形成正交棋盘，每孔加100μL，其余步骤同前述iELISA检测。

记录数据并分析计算不同浓度梯度的TRX-μ-CTX融合蛋白抗原在IC

上述公式中：[Ab]的值为抗原浓度在[Ag]时，其IC50时的抗体浓度；

[Ab]t的值则为抗原浓度在[Ag]t时，其IC50时的抗体浓度；

n则为为[Ag]与[Ag]t的比值

测定结果如图6所示，利用Origin8.0软件进行拟合曲线的制作，根据各曲线中的IC

1）单克隆抗体特异性iELISA特异性分析

用iElISA检测方法测定单克隆抗体的特异性。用包被缓冲液CBS稀释不同的完全抗原（TRX-μ-CTX融合蛋白、GST-μ-CTX融合蛋白、TRX-αB-CTX融合蛋白、GST-αB -CTX融合蛋白、TRX-ω-CTX融合蛋白、青环海蛇毒素SN311、短链神经毒素SN285）至浓度为10μg/mL，用移液枪以每孔100 μL的量包被到96孔酶标板中，用5% PBSM溶液将抗体稀释至浓度为14.9ng/mL，然后以每孔100μL的量加进包被好的酶标板内，同时做阴性对照组，实验具体操作步骤同iELISA法，最终测定其OD450 nm值并记录数据，结果显示抗体特异性良好，如图7所示。其中，TRX-αB -CTX融合蛋白、GST-αB -CTX融合蛋白、TRX-ω-CTX融合蛋白由福建省病原真菌与真菌毒素重点实验室提供，青环海蛇毒素SN311、短链神经毒素SN285由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

2）单克隆抗体的可变区氨基酸序列测定

①杂交瘤细胞总RNA提取及cDNA获取

采用商业化RNA提取试剂盒，提取杂交瘤细胞的总RNA。试剂盒为MolPure

cDNA的获取采用商业化RNA反转录试剂盒，获取杂交瘤细胞的cDNA。试剂盒为Hiscript

②V

(a)用于扩增V

注： M=A/C，R=A/G，S=C/G，W=A/T

(b)以cDNA为模板，使用V

PCR反应体系如下：

结束后用DNA回收试剂盒回收PCR产物，试剂盒为GeneJET Gel Extraction kit(产品货号：#K0692)。

(c) 采用商业化TA克隆试剂盒将V

5）单克隆抗体竞争曲线与标准曲线

首先要确定最佳的抗原包被和一抗体稀释的工作浓度，用包被缓冲液CBS将TRX-μ-CTX融合蛋白抗原分别稀释成10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL。用5%PBSM对纯化后的抗体进行溶液稀释，最终将抗体稀释成59.6ng/mL、29.8ng/mL、14.9ng/mL、7.45ng/mL、3.73ng/mL、1.863ng/mL、0.933ng/mL、0.466ng/mL，用棋盘法做iELISA实验，选择OD450nm接近1的点，其对应的抗原包被浓度和一抗体稀释浓度即为最佳工作浓度，抗原包被的最佳浓度为5 μg/mL，一抗体稀释的最佳浓度为14.9 ng/mL。

用已经确定的包被抗原浓度和一抗工作浓度作icELISA，从而建立CTX的标准竞争曲线。包被TRX-μ-CTX融合蛋白抗原（5 μg/mL），用5%PBSM溶液稀释μ-KIIIA-CTX标准品（以下简称μ-CTX标品）（由生工生物工程（上海）股份有限公司提供），浓度依次为10000 ng/mL，5000 ng/mL，2500 ng/mL，1250 ng/mL，625 ng/mL，312.5 ng/mL，156.25 ng/mL，9.7656ng/mL，2.4414 ng/mL，0.305175 ng/mL，0.152588 ng/mL，0.076294 ng/mL ，0.038147 ng/mL ，0.019073 ng/mL ，0.009537 ng/mL ，0.004768 ng/mL ，0.002384 ng/mL ，0.001192ng/mL，将稀释好的μ-CTX标品溶液与稀释成14.9 ng/mL的抗μ-CTX单克隆抗体等体积混匀（抗体终浓度较混合前的抗体浓度减半），置于37℃恒温培养箱孵育1h，后从每管混合液中吸取100μL加入至酶标孔中（抗原包被的浓度为5 μg/mL，包被步骤同上），同时做阳性对照和阴性对照，阳性对照为抗体溶液与PBSM等体积混合孵育后取100 μL加入酶标孔中，阴性对照为PBSM 100 μL加入酶标孔中，后按iELISA法操作。对获得的数据进行处理，横坐标为μ-CTX标品浓度的对数值，纵坐标为B/B0，其中B为试验孔测得的OD450 nm值，B0为阳性孔测得的OD450 nm值，用Origin 8.0拟合竞争曲线以及标准曲线如图8，曲线方程为y=0.06043+[(1.0175-0.06043)/(1+x/3.45591)

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。