抗SARS-CoV-2刺突蛋白S1的单克隆抗体及其应用

技术领域

本申请涉及针对SARS-CoV-2的单克隆抗体(mAb)技术领域，尤其涉及抗SARS-cov-2刺突蛋白S1的单克隆抗体及其应用。

背景技术

SARS-CoV-2利用包膜刺突(S)糖蛋白来介导以攻击和进入宿主细胞。S糖体蛋白结构上包括一个亚基S1，即SpikeS1蛋白或S1。S1促进SARS-CoV-2通过其受体结合域(RBD)附着在细胞表面受体，即血管紧张素转换酶2(ACE2)上。因此，可以通过阻断SARS-CoV-2与RBD-ACE2相互作用，进而阻断或破坏SARS-CoV-2对宿主细胞的攻击和进入，从而提供潜在的治疗方法和应用方法。

发明内容

本申请发明人创造性地发现了一种识别SARS-CoV-2的抗体及其应用。该抗体可用于SARS-CoV-2感染的快速检测或筛查。该抗体也可用于制备治疗或预防SARS-CoV-2感染相关疾病的药物中。

第1方面，本申请实施例公开了一种抗体，所述抗体结合SARS-CoV-2刺突蛋白S1，其中，所述抗体的V

第2方面，本申请实施例公开了一种抗体，所述抗体结合SARS-CoV-2刺突蛋白S1，其中，所述抗体的V

第3方面，本申请实施例公开了一种抗体，所述抗体结合SARS-CoV-2刺突蛋白S1，所述抗体包括具有重链和轻链的Fab段，所述重链氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。

第4方面，本申请实施例公开了一种用于诊断SARS-CoV-2或检测SARS-CoV-2刺突蛋白S1的ELISA试剂盒，其包含如第1～3任一方面所述的抗体、或者其组合。

第5方面，本申请实施例公开了一种于体外诊断SARS-CoV-2或检测SARS-CoV-2刺突蛋S1蛋白的方法，包括使用如第1～3任一方面所述的抗体、或者其组合。

附图说明

图1为本申请实施例提供的抗SARS-CoV-2刺突蛋白S1的兔单克隆抗体的结构示意图。

图2为本申请多个实施例提供的兔单克隆抗体基于直接抗原ELISA法检测的SARS-Co V-2刺突蛋白S1的结果，其中，多个实施例提供的兔单克隆抗体包括1H1和7G5。

图3为本申请多个实施例提供的兔单克隆抗体基于直接抗原ELISA法检测的SARS-Co V-2刺突蛋白S1 RBD结构域的结果，其中，多个实施例提供的兔单克隆抗体包括1H1和7G5。

图4为本申请多个实施例提供的兔单克隆抗体基于ELISA捕获法检测的SARS-CoV-2刺突蛋白S1的结果，其中，多个实施例提供的兔单克隆抗体包括1H1和7G5。

图5为本申请多个实施例提供的兔单克隆抗体基于ELISA捕获法检测的SARS-CoV-2刺突蛋白S1 RBD结构域的结果，其中，多个实施例提供的兔单克隆抗体包括1H1和7G5。

图6为本申请多个实施例提供的兔单克隆抗体7G5在假病毒感染试验中的中和能力结果，X轴表示示抗体浓度，Y轴表示假病毒感染到宿主细胞的感染的百分比。

图7为本申请多个实施例提供的兔单克隆抗体对ACE2-S1的阻断活性检测结果，其中，多个实施例提供的兔单克隆抗体包括1H1、9H1、5E1和7G5。

图8为本申请实施例提供的基于ELISA双抗夹心法检测结果，7G5作为捕获抗体，1H1作为检测抗体。

图9为本申请实施例提供的兔单克隆抗体与SARS-CoV-2刺突蛋白S1、SARS蛋白S1、SARS蛋白S2、MERS-CoV刺突蛋白、HKU1蛋白S1、HKU1蛋白S2、HCoV-NL63蛋白S、HCoV-OC43蛋白S和HCoV-229E蛋白S的特异性其中，多个实施例提供的兔单克隆抗体包括1H1和7G51。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

术语“一”或“一个”涵盖单数和复数引用，除非上下文有其他方面。术语“包括”、“具有”、“拥有”和“包含”是开放式术语，表示“包括但不限于”，除非另有说明。

本申请主要公开了抗SARS-CoV-2的抗体。具体地说，本申请公开了涉及抗SARSCoV-2刺突蛋白S1的兔单克隆抗体(mAbs)及其应用。

在申请中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释，具有各种抗体结构，包括但不限于Y型抗体、所谓的全长抗体、Y型抗体的抗原结合部分，以及它们的遗传学或化学修饰。其中，“抗原结合部分”是指Y型抗体的一个或多个部分或片段，可以保留该抗体与SARS-CoV-2S1特异性结合的能力。

在本申请中，术语“单克隆抗体”(mAb)包括具有基本相同的抗原决定簇的高度同质的抗体群。即在该抗体群中，单个抗体基本上是相同的，除了可能自然发生的少量突变。单克隆抗体可以对抗原上的特定表位显示出单一的结合特异性和亲和力。与通常包含针对不同表位的多克隆抗体相比，每个单克隆抗体可以针对抗原上相同或基本相同的表位。修饰词“单克隆”表示抗体的特性是从一个基本同质的抗体群体中获得的，并且不能被解释为需要通过任何特定的方法制得的抗体。该抗体可以通过多种方法制备，包括但仅限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体抗体库以及类似的方法制得。

在本申请中，术语“抗SARS-CoV-2S1单抗”，“抗对SARS-CoV-2的刺突蛋白S1单抗”和“抗S1单抗”互换使用，指单克隆抗体具有特异性地结合SARS-CoV-2的S1蛋白有足够的亲和力，以致使其可以用于制备SARS-CoV-2的检测、诊断剂、治疗剂和/或药物中。术语“亲和力”是指单个分子(例如一个抗体)与其结合物(例如一个抗原)的单个结合位点之间的全部非共价分子间相互作用的结合强度。其中，“分子间相互作用”可以包括氢键作用、静电相互作用、疏水作用和范德华力。

在本申请中，术语“兔抗体”或“抗SARS-CoV-2Sl兔单克隆抗体”或者类似术语中的修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。在一个实施例中，抗SARS-CoV-2S1的兔单克隆抗体可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的抗体的CDR和骨架区(FR)。在一个实施例中，针对SARS-CoV-2的刺突蛋白S1的兔抗体或兔单克隆抗体可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的抗体的CDR。在一个实施例中，针对SARS-CoV-2S1的兔单克隆抗体可以为CDR区来源于兔源免疫球蛋白序列、而FR来自于其他哺乳动物的种系免疫球蛋白序列(如小鼠或人类)的一种抗体。术语“抗SARS-CoV-2S1的兔单克隆抗体”也可能包含具有非兔源免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基的抗体，例如，由体外随机突变或点特异性突变引入的、或体内体细胞突变引入的突变。然而，术语“抗SARS-CoV-2S1的兔单克隆抗体”并不包括CDR区来自其他哺乳动物的种系(如老鼠)的抗体。

在本申请实施例中，抗SARS-CoV-2S1的兔单克隆抗体可以具有Y型分子结构(如图1所示)。参阅图1，其详细示出了一个具体的抗SARS-CoV-2S1的兔单克隆抗体的Y型结构。在一个实施例中，抗SARS-CoV-2S1的兔单克隆抗体可以包括一对重链2和一对轻链3。重链2可以包括一个重链可变区(V

轻链3可以是一个相对于重链2更小的一个多肽亚基。轻链3可以包括一个轻链可变区(V

在一个实施例中，重链可变区V

上述图1中的一对重链2和一轻链3可以形成一个Y形结构。该“Y型结构”包括两个Fab段7(抗原结合片段)、一个Fc段8(可标记片段)和铰链区10。两个Fab段7类似于“Y”型结构的两个臂，而Fc段8类似于“Y”型结构的底部。铰链区域10将Fc段8与两个Fab段7连接起来。

每一Fab段7可以包含一个重链可变区V

每个可变区域(V

在一些实施例中，位于V

在一些实施例中，Fc段8可以由来自不同重链2的C

本申请实施例公开的抗SARS-CoV-2刺突蛋白S1的兔单克隆抗体的包括1H1和7G5。1H1和7G5的V

表1抗SARS-CoV-2刺突蛋白S1的兔单克隆抗体的相关区域的氨基酸序列

本申请实施例提供的抗SARS-CoV-2S1的兔单克隆抗体也可以是上述实施例所公开的Y型抗体的抗原结合部分。在一个实施例中，抗SARS-CoV-2S1的兔单克隆抗体可以是一个Fab段7形成，由V

本申请实施例提供的抗SARS-CoV-2S1的兔单克隆抗体还可以包括来自上述实施例提供的结构或通过基因修饰获得的其抗原结合部分。在一些实施例中，抗SARS-CoV-2S1的兔单克隆抗体可以具有不同的转基因抗体结构，包括但不限于人源化抗体和嵌合抗体。在一个实施例中，抗SARS-CoV-2S1的兔单克隆抗体可以是一种人源化抗体，该人源化抗体的蛋白序列具有与适应人体自然变异抗体的高度同源性。其中，“人源化抗体”的蛋白质序列可以与人类变异抗体的蛋白质序列基本相同，并同时使得其兔源的CDR区保持与SARS-CoV-2刺突蛋白S1的结合能力。在一个实施例中，可以通过插入非人源抗体的CDR区来创建所述的“人源化抗体”，例如，将一个兔抗体的CDR区插入一个人源抗体支架中以制得一种人源化抗体。在一个实施例中，抗SARS-CoV-2S1的兔单克隆抗体可以是一种嵌合抗体。在一个实施例中，该嵌合抗体可以是通过将不同来源的Y型抗体的重链和轻链的可变区移植到另一动物(比如人体)的恒定区而制成的抗体。在一个实施例中，该嵌合抗体是通过将本申请公开的抗SARS-CoV-2S1的兔单克隆抗体的Fab段与人源Fc段融合而形成。在一个实施例中，抗SARS-CoV-2S1的兔单克隆抗体可以是一个单链Fv(scFv)。尽管Fv段的两个结构域，即V

本申请实施例提供的抗SARS-CoV-2S1的兔单克隆抗体还可以具有从上述实施例提供的抗体衍生形成的结构及其通过化学修饰产生的抗原结合部分。在一个实施例中，所述化学修饰可以是化学交联。在一个实施例中，一个或多个缀合物可以共价连接到抗体或非共价连接到抗体上。在一个实施例中，该缀合物可以是共价附着到该抗体上的分子标记，以便于检测其抗原。该缀合物可以是任何合适的小分子。所述小分子可以包括但不限于，例如，生物素、链霉亲和素，和/或荧光染料。所述荧光染料可以是任何合适的荧光染料，包括但不限于Alexa Flour染料、氨基香豆素(AMCA)、Atto染料、花菁染料、DyLight染料、FITC、荧光探针647H、罗丹明和德克萨斯红。所述Alexa Flour染料包括但不限于AlexaFlour488、Alexa Flour 555、Alexa Flour568、Alexa Flour594、Alexa Flour647和AlexaFlour700。所述Atto染料可以包括但不限于Atto390、Atto488、Atto565、Atto633和Atto700。所述花菁染料可以包括但不限于Cy3、Cy5和Cy5.5。DyLight染料可以包括但不限于DyLight350、DyLight405、DyLight488、DyLight550、DyLight594、DyLight633、DyLight650、DyLight680、DyLight755和DyLight800。在一个实施例中，所述缀合物可以是具有两个共价连接的荧光分子的串联染料。在实施例中，一个荧光分子作为供体，另一个作为受体。在一个实施例中，所述供体具有供体激发特性，而所述受体具有受体发射特性，二者可以进行独特荧光激发和发射反应。所述串联染料可包括但不限于异藻蓝蛋白-Cy5.5、异藻蓝蛋白-Cy7、PE-Atto594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-德克萨斯红、PE-AlexaFluor647、PE-AlexaFluor700，PE-AlexaFluor750、APC-AlexaFluor750和PerCP-Cy5.5。

上述实施例中的缀合物也可以是大分子。在一个实施例中，该大分子可以是一种酶。该酶可包括但不限于碱性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶(Gox)、辣根过氧化酶(HRP)。在一个实施例中，该大分子可以是荧光蛋白。该荧光蛋白可包括但不限于异藻蓝蛋白(APC)、B-藻红蛋白(BPER-藻红蛋白(R-PE)、PerCP和R-藻蓝蛋白(RPC)。在一个实施例中，大分子也可以是一种具有不同抗SARS-CoV-2S1兔单克隆抗体特异性的抗体，形成一个具有多种特异性的多价抗体。

本申请实施例提供的抗SARS-CoV-2S1的兔单克隆抗体具有于体内和于体外的用途。该用途包括但不限于制备免疫分析的试剂盒、制备免疫染色的试剂盒、制备免疫化学的试剂盒、制备SARS-CoV-2病毒感染的诊断试剂盒、制备免疫肿瘤治疗药物和制备SARS-CoV-2引起的一些感染性疾病的治疗药物，以及于体外进行免疫分析、免疫染色、免疫化学反应、SARS-CoV-2病毒感染诊断。其中，所述的免疫分析方法可以包括酶联免疫吸附剂分析方法(ELISA)，本申请实施例提供的抗SARS-CoV-2S1的单抗可用于不同形式的ELISA。在一个实施例中，所公开的抗SARS-CoV-2S1的兔单克隆抗体可用于直接ELISA。所述直接ELISA可以是一种基于平板的免疫吸附试验，用于检测和量化来自复杂生物样本或在复杂生物样本内的特定抗原，可以采用多种方法实现直接ELISA。在一个实施例中，所述抗原，例如，SARS-CoV-2的刺突蛋白S1可以被固定化或吸附在塑料板的表面上。在一个实施例中，所述塑料板可以是一个多孔微量滴定板。在一个实施例中，多孔微量滴定平面可以是96孔聚苯乙烯板。在实施例中，可以在表面添加过量的阻断蛋白以阻断所有其他结合位点。在一个实施例中，阻断蛋白是牛血清白蛋白。在一个实施例中，针对抗原(例如，SARS-CoV-2的刺突蛋白S1)的抗体，可以与偶联在表面上的抗原形成复合物。在一个实施例中，该抗体可以与一种酶偶联。在一个实施例中，该酶可以是HRP。在多余的缀合抗体被洗去后，与抗原结合的缀合抗体继续停留在表面上。在一个实施例中，共轭抗体催化与添加的底物的反应，以产生可由分光光度计或吸光度酶标仪测量的可见比色输出。直接ELISA检测由于仅使用了一种抗体，使得其相较于其他形式的ELISA检测具有更少的检测步骤和更高的检测效率。在一个实施例中，直接ELISA可以测试特异性抗体-抗原反应，并有助于消除与其他抗体之间的交叉反应。直接ELISA适用于目标样本的定性和定量应用于抗原检测、抗体筛选和抗原表位定位。

表2示出了本申请实施例提供的多个兔单克隆抗体分别与SARS-CoV-2S结合动力学参数，其中，多个兔单克隆抗体包括1H1和7G5。如表2所示，1H1和7G5对SARS-CoV-2S1表现出高度亲和性和特异性。

表2与SARS-CoV-2S结合动力学参数

参阅图2，其显示了多个实施例分别提供的抗SARS-CoV-2S1兔单克隆抗体基于直接ELISA检测SARS-CoV-2S1抗原的曲线，其中，多个兔单克隆抗体包括1H1和7G5。图中，X轴表示在ng/ml单位处的抗体浓度，Y轴表示在波长为450nm(OD450)处的光密度。如图2所示，所有兔单克隆抗体都能特异性地与SARS-CoV-2S1结合，其结合曲线在从约1ng/ml到约1000ng/ml的抗体浓度范围内表现出近似于“S”形状。检测过程设置了阴性对照组，在与抗SARS-CoV-2S1的兔单克隆抗体相同的检测步骤下，使用空白缓冲液代替抗SARS-CoV-2S1的兔单克隆抗体。空白缓冲液是用于稀释兔单克隆抗体的缓冲液。与几乎无OD450吸光值的阴性对照相比，1H1和7G5表现出良好的检测信号，即表明在OD450处的吸光值能够检测较宽浓度范围的SARS-CoV-2S1。

参阅图3，其示出了多个实施例分别提供的抗SARS-CoV-2S1兔单克隆抗体基于直接ELISA法对SARS-CoV-2S1的RBD的检测曲线，其中，多个兔单克隆抗体包括1H1和7G5。图中，X轴表示以ng/ml为单位的抗体浓度，Y轴表示450nm(OD450)处的光密度。阴性对照采用与兔抗SARS-CoV-2S1的单克隆抗体按照相同的步骤进行，使用空白缓冲液代替抗SARS-CoV-2S1的兔单克隆抗体。空白缓冲液是用于稀释兔单克隆抗体的缓冲液。阴性对照组的OD450值接近零，几乎没有检测信号。与阴性对照相比，1H1和7G5可产生显著的OD450值。由图3可知，1H1和7G5在0.5ng/ml到1000ng/ml的抗体浓度范围内形成的结合曲线呈现近似“S”形状，由此说明1H1和7G5可以特异性地结合SARS-CoV-2S1的RBD。

为验证本申请实施例提供的兔单克隆抗体能够在自然状态下与S1蛋白结合，本申请还进行了基于捕获ELISA的检测试验。该试验中，兔单克隆抗体被涂在平板上的Fc捕获，然后将处于自然状态的S1或RBD添加到平板中。

图4示出了1H1和7G5与S1结合的捕获ELISA结果。如图4所示，1H1和7G5都可以以自然状态与S1结合。图5其示出了1H1和7G5在自然状态下与RBD结合的捕获ELISA结果。如图5所示，1H1和7G5都可以以自然状态与RBD结合。

图9中，Y轴显示直接ELISA在450nm处的检测光密度。图9中，每组列包含7个组别，沿X轴方向依次为1A3、1D2、1H1、5E1、7G5、9A5和9H1，分别显示了对SARS-CoV-2S1、SARS S1、MERS S1和HCoV-NL63S1的特异性。如图9所示，本申请实施例提供的抗体对SARS-CoV-2S1表现出最高的特异性。其中，1H1和7G5对SARS-CoV-2S1具有独特的特异性，对SARS蛋白S1和SARS蛋白S2、MERS-CoV刺突蛋白、HKU1蛋白S1、HKU1蛋白S2、HCoV-NL63蛋白S、HCoV-OC43蛋白S和HCoV-229E蛋白S没有明显的特异性。相较而言，1D2、5E1和9H1对SARS-CoV-2蛋白S1、SARS蛋白S1、SARS蛋白S2、MERS-CoV刺突蛋白表现出较高的特异性，而对KU1蛋白S1、HKU1蛋白S2表现出较低的特异性。然而，1D2、5E1和9H1对HCoV-NL63蛋白S、HCoV-OC43蛋白S和HCoV-229E蛋白S无特异性。

为了评价7G5的中和能力，进行了假病毒中和试验和活病毒中和试验。假病毒中和试验结果如图6所示，7G5可以中和SARS-CoV-2野生型假病毒，并且对对SARS-CoV-2活病毒IC50(μg/mL)为0.261μg/mL。

为了评估1H1、9H1、5E1和7G5是否能阻断S1与ACE2的结合，本申请进一步进行了阻断实验。重组的ACE2被涂在ELISA平板上，本申请实施例提供的不同兔单抗与不同浓度的RBD结构域蛋白预孵育，形成抗体-RBD混合物，然后加载到ACE2包被的ELISA板上。结果如图7所示，7G5可以阻断RBD结构域与ACE2的结合。图8示出了一个使用7G5作为捕获抗体、1H1作为检测抗体进行双抗夹心ELISA的实施例检测结果。如图8所示，1H1可以结合或检测被7G5捕获的S1。

方法

1、制备、分离和纯化抗SARS-CoV-2S1的兔单抗

抗SARS-CoV-2S1的兔单抗可以通过多种技术手段制得，包括单克隆抗体制备方法，例如，体细胞杂交技术和其他技术，包括但不限于B淋巴细胞的杂交瘤技术。在一个实施例中，通过基于B细胞制得重组兔单克隆抗体。

在一个实施例中，将SARS-CoV-2(GenBank：MN908947.3)基因组位置22,553～23,312bp对应的RBD区，经过密码子优化后克隆至pcDNA3.4表达载体中，以构建表达载体；将该表达构建转入感受态大肠杆菌DH5a菌株中培养，筛选阳性克隆，并利用Qiagen PlasmidMega试剂盒(CatNO:10023)提取表达载体。将纳米金(AlphaAesar，Catalog NO:14817)用100mg/mL亚精胺(Sigma，Catalog NO:S2626)进行预包裹后，再取36μg纯化的表达载体对预包裹的100μL 100mg/ml金粉对包裹。将经表达载体包裹的纳米金用无水乙醇洗涤多次后，转载至子弹制造器(Scientz Scientific)的弹丸管中，向其中缓慢滴入200μL 2.5M CaCl

将上述制得的SARS-CoV-2RBD DNA弹丸用SJ-500基因枪(Scientz Scientific)的弹夹装载。用4MPa氦气发射SJ-500基因枪中的DNA弹丸，以注射于新西兰大白兔(4-6周龄)腹部皮肤(36μg/每次免疫)，分别在第0、7、21天对每只家兔进行3次DNA免疫。并分别在第35天和第49天，用不完全弗氏佐剂制得的SARSCoV-2S1蛋白的乳化制剂肌肉注射2次，进行加强免疫。两周后，再次向兔皮下注射200μg S1蛋白，以进行加强免疫。分别于第0、14、28、42和69天收集免疫前和免疫后的血清。

取经过上述免疫后的兔脾脏，分离新鲜的单个脾细胞，并在B细胞培养基(例如，优睿赛思生物科技)中培养过夜。用含2％胎牛血清和1mM EDTA的PBS溶氧稀释脾细胞制得新鲜的单细胞悬液。

利用

在本申请实施例中，将所选克隆的可变区PCR片段克隆到pcDNA3.4载体中，在HEK293F细胞中表达抗体。

在本申请实施例中，兔单克隆抗体可以通过本领域技术人员所熟知的常规方法进行分离和纯化。

在一个实施例中，兔单克隆抗体可以从转染了兔抗体基因的哺乳动物细胞的培养上清中分离出来，通过蛋白A亲和层析充分纯化，纯化的兔单克隆抗体的纯度和功能可分别通过SDS-PAGE和ELISA进行验证。

2、抗SARS-CoV-2S1的兔单克隆偶联抗体的制备

兔单克隆偶联抗体使用PierceEZ-Link Sulfo-NHS-生物素按照制造商手册进行生物素化。简单而言，即将本申请实施例提供的抗SARS-CoV-2S1兔源单克隆抗体在1倍稀释体积的PBS中与磺基-NHS生物素混合，在室温下孵育30min。

3、ELISA鉴定免疫兔血清和抗SARS-CoV-2S1的单克隆抗体

(1)将SARS-CoV-2蛋白S1或来自其他病毒的S1蛋白作为抗原包被至ELISA板上(例如，Corning，Cat.NO:4018)，于4℃、pH7.4的1×PBS中过夜。

(2)包被后的孔板用洗涤缓冲液(添加0.5％(V/V)Tween-20(Sigma，Cat.NO:P96416)的1×PBS)洗涤3次后，用封闭缓冲液(1×PBS添加5％(W/V)脱脂牛奶)封闭。

(3)封闭后，向孔板中加入连续稀释的兔血清样品或单克隆抗体在室温下孵育1h，然后用洗涤缓冲液洗涤5次，然后与经过1:5000封闭缓冲液稀释的偶联有HRP(例如，Jackson Immuno Research公司的HRP，Cat.NO：111-035-045)的山羊抗兔IgG抗体孵育。

(4)用洗涤缓冲液洗涤孔板5次后，加入25μL TMB底物(MossINS，Cat.NO：TMBHK-1000)，在室温黑暗中放置3min。

(5)随后用20μL 1M硫酸停止TMB底物的比色反应。用Epoch微孔板分光光度计(Biotek，USA)测定了在450nm和630nm处的光密度(OD)值，最终值用OD450减去OD630得到。血清滴度计算为稀释后血清OD450读数为对照样品2倍或以上的最大稀释度。

4、兔单克隆抗体应用于捕获ELISA法检测SARS-CoV-2S1

本申请涉及的抗SARS-CoV-2S1的兔单克隆抗体捕获ELISA法检测步骤大致包括：

包被：于4℃将抗兔IgGFc抗体添加至高结合ELISA的孔板中，于1倍稀释体积的pH7.4 PBS中包被过夜。

封闭：将包被后的孔板用洗涤缓冲液(添加0.5％(V/V)Tween-20的1×PBS)洗涤，并用封闭缓冲液(添加5％(W/V)脱脂牛奶1×PBS中)封闭。

孵育：向封闭后的孔板中加入抗SARS-CoV-2蛋白S1的兔抗体，于室温下孵育1h，洗涤，再用稀释3倍的生物素化SARS-CoV-2的S1蛋白孵育。最后再加入结合HRP的链霉亲和素孵育。

比色：将上述孵育后的孔板清洗后，使用HRP催化的比色反应，以检测单克隆抗体是否能够捕获S1。

本领域技术人员应当理解的是，可以采用与上述不同的步骤、试剂、实验参数来执行上述的捕获ELISA步骤。

5、兔单克隆抗体应用于双抗夹心ELISA法检测SARS-CoV-2S1

本申请涉及的抗SARS-CoV-2S1的兔单克隆抗体的双抗夹心ELISA法检测步骤大致包括：

包被：于4℃将捕获抗体添加至至高结合ELISA的孔板中，于pH9.4的0.02M碳酸氢盐缓冲液中包被过夜。

封闭：将包被后的孔板用洗涤缓冲液(添加0.5％(V/V)Tween-20的1×PBS)洗涤，并用封闭缓冲液(添加5％(W/V)脱脂牛奶1×PBS中)封闭。

孵育：向封闭后的孔板中加入SARS-CoV-2蛋白S1，于室温下孵育1h，洗涤，再加入抗SARS-CoV-2S1的生物素化单克隆抗体。将平板再加入结合HRP的链霉亲和素孵育。

比色：将上述孵育后的孔板清洗后，使用HRP催化的比色反应，以观察用于捕获和用于检测的单克隆抗体是否能够同时或不能同时与SARS-CoV-2S1结合。

本领域技术人员应当理解的是，可以采用与上述不同的步骤、试剂、实验参数来执行上述的捕获ELISA步骤。

6、抗SARS-CoV-2蛋白S1的兔单克隆抗体结合动力学

使用具有蛋白A传感器芯片的Biacore仪器(GE Health，USA)，通过表面等离子体共振(SPR)法分析兔mAbs对抗SARS-CoV-2S1的结合动力学。所有实验均在25℃条件下进行，流速为40μL/min。用含0.005％Tween-20脱气的PBS作为运行缓冲液。通道1装载与SARS-CoV-2蛋白S1没有特异性结合的参考抗体，通道2、3和4分别装载候选抗体。

一般而言，检测过程中，采用2μg/mL的抗体并进行20～30秒的快速注射至通道内进行上样，如此获得检测结果能够产生150～250反应单位(RU)，并且具有高度重现性。因此，将2μg/mL的抗体以20～30s的速度快速注射至通道内后，再次将抗原注射到所有通道表面5min以便于抗体进行结合，然后将注入缓冲液冲10min以进入解离阶段。

使用1.2～100nM范围内的抗原稀释梯度以及空白缓冲液进行多次结合/解离循环。在每个周期结束时，通过30s注射甘氨酸缓冲液(pH2.0、10mM)再生通道，以便在每个通道再次装载抗体。动力学曲线采用BIA evaluation 3.2软件和1:1Langmuir模型进行双系数曲线进行分析，并计算结合合速率常数、解离速率常数和亲和常数。

7、抗SARS-CoV-2S1的兔单抗的中和试验

抗SARS-CoV-2的中和活性在认证的生物安全III级实验室进行。活SARS-CoV-2毒株分离子从中国江苏省一名感染患者的鼻咽拭子中分离出来。中和试验步骤包括：将Vero细胞接种于24孔板(200000个细胞/孔)，孵育约16h，直到90～100％融合；用含有2％胎牛血清的DMEM分别稀释1H1和9H13倍，然后分别与病毒以1:1(vol/vol)的比例混合，生成含有100个聚焦形成单位(PFU)/ml病毒的混合物，然后在37℃孵育1h；将单抗和病毒复合物重复加入到Vero细胞单层24孔板孔中，然后在37℃孵育1h。去除混合物，并在细胞上覆盖含1％低熔点琼脂糖(Promega)和2％胎牛血清的DMEM，于37℃下孵育3d后，细胞用4％甲醛固定，并用0.2％结晶紫溶液(Sigma)染色。通过斑块数量可见感染SARS-CoV-2的细胞灶。单抗的50％抑制浓度(半抑制浓度)定义为相对于无抗体的50％总斑块总数对应的抗体浓度(g/mL)。

8、ACE2受体阻断的ELISA试验

以1μg/mL重组ACE2(KactusBiosystems公司，Cat.NO:ACE-HM501)包被ELISA孔板。将抗体分别与不同浓度稀释的RBD结构域蛋白在室温下预孵育1h。然后将抗体-RBD复合物沉积在ACE2包覆的ELISA孔板上，在室温下放置1h。

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，对于使用不超过常规实验的普通技能的人，可能会发生本领域披露的披露的进一步修改和等价物。本申请的这些修改和等效内容包括编码所公开的氨基酸序列的核酸序列。