预测索拉非尼不良反应的SNP位点及试剂盒

技术领域

本申请属于分子生物学检测、癌症治疗、高血压领域。具体地，本申请提供了预测索拉非尼不良反应的SNP位点及试剂盒。

背景技术

索拉非尼(Sorafenib)为RAF/MEK/ERK通路的多激酶抑制剂，目前已经批准的主要用途为治疗缺乏手术机会的肝癌和肾癌，在临床上属于此类患者的最常见的靶向用药种类。索拉非尼已知的副作用包括高血压、肠胃不适、手足综合征、皮肤损伤和造血系统问题等；其中高血压发生概率较高(不同报道在20％-40％左右)，而且对以中老年人为主的用药人群威胁较大。

目前已经有多种索拉非尼疗效预测的试剂盒和方法，但对于索拉非尼不良反应的预测，特别是高血压不良反应的预测，尚无相关研究和产品提供。

发明内容

针对上述问题，申请人选取了较大量的样本不良反应和对照样本构建DNA池，从中筛选到LPL基因上rs328、CYP2C19基因上rs4244285、CYP2C19基因上rs4986893、CYP3A5基因上rs776746、CORIN基因上rs2271037与索拉非尼高血压不良反应显著相关。

一方面，本申请提供了预测索拉非尼不良反应的SNP位点，所述SNP位点选自rs328、rs4244285、rs4986893、rs776746以及rs2271037中的一个或多个。

另一方面，本申请提供了检测选自rs328、rs4244285、rs4986893、rs776746以及rs2271037中的一个或多个的SNP位点处核苷酸的试剂在制备预测索拉非尼不良反应的试剂盒中的应用。

另一方面，本申请提供了预测索拉非尼不良反应的方法，所述方法包括检测选自rs328、rs4244285、rs4986893、rs776746以及rs2271037中的一个或多个的SNP位点处的核苷酸。

另一方面，本申请提供了预测索拉非尼不良反应的SNP位点的检测试剂盒，所述试剂盒包括检测选自rs328、rs4244285、rs4986893、rs776746以及rs2271037中的一个或多个的SNP位点处核苷酸的试剂。

进一步地，所述索拉非尼不良反应为高血压。

进一步地，所述位点为rs328、rs4244285、rs4986893、rs776746以及rs2271037。

进一步地，所述试剂选自扩增后直接测序，Taqman检测、SNPshot检测、PCR-RFLP、PCR-SSCP、基因芯片、质谱分型用试剂。优选序列为SEQ ID NO.1-10的引物。

进一步地，所述索拉非尼不良反应发生于使用索拉非尼治疗肝细胞的过程中。

本申请的不良反应可以是使用索拉非尼治疗肝癌、如肝细胞癌，肾癌以及其他癌症的患者中发明的不良反应。本申请中的不良反应包括高血压、肠胃不适、手足综合征、皮肤损伤等。

本申请的方法可以与其他预测索拉非尼不良反应的方法和试剂盒联用。

本申请的方法和试剂盒可以采用本领域已知的和开发中的各种SNP检测方法，如扩增后直接测序，Taqman方法检测、SNPshot检测、PCR-RFLP、PCR-SSCP、基因芯片检测、质谱分型方法等。

试剂的具体类型包括但不限于引物、探针、基因芯片、电泳芯片、荧光标记物、聚合酶等；芯片、探针、引物等的设计本领域技术人员可以依据《分子克隆》等本领域技术书籍、设计网站/工具、专业公司技术服务来实现。

实施例1病例情况与治疗方案

研究病例来自海军971医院以及其他两所合作医院，共147名未进行手术或者介入治疗的中晚期肝细胞癌患者。其中男80名，女67名，平均年龄53.2±11.2岁。所选择的患者以往病例和自述中均无明显高血压情况，日常不服用降压药物。

所有病例经合格医师诊断评估后开具处方使用索拉非尼(拜耳，多吉美，200mg/片)，使用方法均为每次2片，每日两次的标准使用方法；服药期间，除正常对症治疗外，不使用其他有影响血压效果的药物。

血压监测期为开始服药后1个月，每日早中晚记录血压数据，中途如有不适单独测量血压并记录。根据临床实践，记为高血压不良反应的情况包括：

出现收缩压>150mmHg或舒张压>95mmHg记录4次以上；

出现收缩压>180mmHg或舒张压>110mmHg记录2次以上；

出现由于高血压带来的眩晕等不适情况终止用药。

147名患者中，1个月监测器内有1名患者由于其他原因死亡，4名患者由于高血压发生过于频繁或眩晕呕吐等副作用终止用药，1名患者由于严重手足综合征停止用药；完成监测期的141名患者中，共监测到上述高血压不良反应39例。即共记录到上述高血压不良反应43例，其中男29例，女14例。

实施例2 SNP筛查

对实施例1中所述研究病例的全血样本提取DNA(OD260/OD280大于1.7，小于1.9)；构建3个高血压不良反应组和2个无高血压不良反应组的DNA混合池；按照Affymetrix SNPArray 6.0芯片的操作说明处理样品、杂交、染色、扫描、质控。使用SNPMaP软件包处理从芯片获得的CEL文件，计算各位点的RAS，t检验分析高血压不良反应组和无高血压不良反应组之间的基因频率差异，Bonferroni矫正；统计软件使用SPSS 20.0，双侧p<0.05。

GWAS分析发现以下有意义的差异SNP位点：LPL基因上rs328、CYP2C19基因上rs4244285、CYP2C19基因上rs4986893、CYP3A5基因上rs776746、CORIN基因上rs2271037。

实施例3相关SNP位点基因型在病例中的分布

取各病例静脉血，提取基因组DNA，扩增相应片段后使用ABI 3730xl测序仪检测SNP基因型。所用引物序列部分参照现有技术，部分自行设计，如下表1所示：

表1检测SNP位点所用引物序列

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相关SNP位点基因型在病例中的分布如下表2-6所示：

表2 rs328基因型在病例中的分布

表3 rs4244285基因型在病例中的分布

表4 rs4986893基因型在病例中的分布

表5 rs77674基因型在病例中的分布

表6 rs2271037基因型在病例中的分布

以上数据证明了LPL基因上rs328(C>G)、CYP2C19基因上rs4244285(G>A)、CYP2C19基因上rs4986893(G>A)、CYP3A5基因上rs776746(A>G)、CORIN基因上rs2271037(G>T)与索拉非尼高血压不良反应显著相关，即rs328上G、rs4244285上A、rs4986893上A、rs776746上G、rs2271037上T等位基因存在时患者使用索拉非尼有较高的高血压不良反应发生率。这些位点均有单独或联合预测索拉非尼高血压不良反应的能力。这些位点所在的基因—细胞色素P450酶、脂蛋白酯酶、跨膜丝氨酸蛋白酶中的其他位点也有用于索拉非尼和其他RAF/MEK/ERK通路药物高血压不良反应预测的潜力。

由于样本量和多样性丰富程度所限，筛选研究中未纳入性别、体脂、吸烟等因素及其相互影响，这些因素的分析留待进一步大样本研究中进行。