一株鼠李糖乳酪杆菌及其在预防或治疗龋齿和牙周病中的应用

技术领域

本发明属于益生菌筛选与应用技术领域，具体涉及一株鼠李糖乳酪杆菌及其在预防或治疗龋齿和牙周病中的应用。

背景技术

口腔内是一个复杂的生态系统，微生物群种类繁多，表面估计含有700多种细菌。这些口腔微生物分布在不同的口腔栖息地，例如舌头、牙齿、龈下沟、颊粘膜和扁桃体等。由于代谢活动、pH值、营养物质可用性、脱落/不脱落以及唾液和沟液等因素的影响，这些生境内特定微生物群的负荷有所不同。口腔微生物相互之间制衡，维持健康，一旦致病的微生物大量繁殖，就会导致各种口腔疾病，如龋病、牙周炎和口臭。

在口腔护理产品中，人们对益生菌的兴趣日益增加。通过摄取适当的量的益生菌，对食用者的身体健康能发挥有效作用。双歧杆菌属和乳酸菌属是最常见的益生菌，还有如芽孢杆菌、肠球菌和链球菌，以及酵母菌菌也被归类为益生菌。乳酸杆菌是天然的口腔微生物群，主要有干酪乳杆菌、拟干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳酪杆菌、发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌和唾液乳杆菌等。乳酸菌与变异链球菌相比，不会粘附在牙齿上和引起龋齿。乳酸菌还具有拮抗牙周病原菌的作用，如抑制放线菌聚集菌、中间普雷沃菌和牙龈卟啉单胞菌的生长。由此可见，乳酸菌在维持口腔健康中起重要作用，有助于维持口腔的微生态平衡。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一株鼠李糖乳酪杆菌及其在预防或治疗龋齿和牙周病中的应用。该菌株是从发酵奶酪中筛选到的，能够显著抑制变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌，半放线聚集杆菌等口腔病原菌的生长繁殖，并能在口腔内有效定植，有利于恢复菌群平衡，可广泛用于预防或治疗龋齿、牙周炎等口腔疾病。

本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌，为鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14(Lacticaseibacillus rhamnosus VHProbi M14)株，于2022年3月1日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2022171。

所述的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14株的16s rDNA序列为SEQ ID NO:1；其Riboprinter指纹图谱如图1所示，蛋白质谱如图2所示。

本发明的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14株在制备具有清除DPPH自由基或清除羟基自由基功能的制品中的应用。

本发明的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14株在制备具有抑制口腔致病菌功能的制品中的应用。

所述的口腔致病菌，包含变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌、粘性放线菌、具核梭状杆菌或伴放线聚集杆菌。

本发明还一个方面是提供一种用于抑制口腔病原菌的制品，所述的制品中包含有上述的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14株的活菌；

更进一步的，所述的用于抑制口腔病原菌的制品，其中还可以包含有鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14株的裂解液。

所述制品，可以是药品或保健品。

所述的制品，可以是口腔护理产品，例如牙用凝胶、牙粉、牙膏、口香糖、牙线、牙齿清洁液、漱口剂、口喷剂或牙齿清洁泡沫。

有益效果

本发明所述鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14是从发酵奶酪中筛选出的一株对变异链球菌抑制作用最显著的菌株，其发酵菌液产生的抑菌圈直径达到23mm。该菌株还能有高效抑制牙龈卟啉单胞菌、粘性放线菌、具核梭状杆菌和伴放线聚集杆菌等口腔致病菌，抗菌谱较广。

鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14可在口腔中有效定植，并通过与口腔致病菌有效结合，阻止其粘附到牙齿上，显著减少口腔内致病菌的数量，进而达到减少致病菌在口腔内荷载的效果。其中，该菌株6h时的自凝集率达到43.05％，且对变异链球菌和半放线聚集杆菌的共凝集效果最好，6h时的共凝集率高达42.27％-59.11％。

鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14能高效去除变异链球菌形成的生物膜，有效预防和治疗由龋齿。其中，菌悬液，即单纯的菌体对生物膜的去除率高达99.42％，而发酵液和裂解液的去除率达100％，取得了意料不到的技术效果。

鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14能够高效抑制变异链球菌的生长繁殖。对照组的变异链球菌在接种10h后开始快速增长，20h左右达到稳定期；而添加了鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14裂解液上清的实验组，变异链球菌在40h内几乎没有增长。

鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14对人正常牙龈上皮细胞没有毒性，且能够粘附在细胞上，在口腔内实现有效定植，有助于平衡口腔菌群。鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14能够显著抑制牙周致病菌(半放线聚集杆菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭状杆菌)在人正常牙龈上皮细胞上的粘附生长，有效预防和改善所述致病菌引起的牙周炎，牙龈出血等症状。

此外，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14还具有较强的胃肠液耐受性和抗氧化性，对羟基自由基和DPPH自由基的清除率分别为18.1％和16.8％。

附图说明

图1为鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14的Riboprinter指纹图谱；

图2为鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14的蛋白质谱图；

图3为鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14与四株致病菌的凝集试验；其中，A为鼠李糖乳酪杆菌对照，B为鼠李糖乳酪杆菌+变异链球菌；C为鼠李糖乳酪杆菌+牙龈单胞卟啉菌；D为鼠李糖乳酪杆菌+具核梭状杆菌；E为鼠李糖乳酪杆菌+半放线聚集杆菌；

图4为鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14对变异链球菌的抑制粘附试验；其中，A为对照组，B为实验组；

图5为鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14对变异链球菌的抑制生长曲线；

图6为鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14抑制牙龈卟啉单胞菌粘附到人正常牙龈上皮细胞图片；其中，A为对照组，B为实验组；

图7为鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14抑制具核梭状杆菌粘附到人正常牙龈上皮细胞图片；其中，A为对照组，B为实验组；

图8为鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14抑制半放线聚集杆菌粘附到牙龈上皮细胞图片；其中，A为对照组，B为实验组。

具体实施方式

本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14(Lacticaseibacillus rhamnosusVHProbi M14)经多相分类学鉴定为一新型的乳杆菌，且满足食品安全的规定，可以作为一种食品原料来长期服用，而不会产生副作用。本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14能有效抑制常见的口腔病原菌，具有重要的应用价值。

申请人于2022年3月1日将所筛选的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14株保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2022171。

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：菌株分离筛选

1、初筛：

从市场上购买发酵的奶酪，然后取10g奶酪加入样品均质袋中，加入90mL生理盐水，均质器上拍打10min，然后经过一系列稀释后，取10

2、抗变异链球菌菌株复筛

(1)准备底层琼脂平板

提前准备好底层1.5％琼脂平板，晾干。

(2)变异链球菌菌液制备

分别在BHI平板上划线活化变异链球菌ATCC 25175，CCTCC AB 99010，BNCC700610，然后挑取单菌落到BHI肉汤培养基中，37℃有氧培养24h，然后按照1％的比例转接到新的BHI肉汤培养基中，37℃有氧培养24h，得到新鲜菌液，新鲜菌液按照1：1：1等体积混匀，即得到变异链球菌菌液。

以下实施例中所述的变异链球菌菌液均与本实施例相同。

采用三株不同的变异链球菌作为指示菌株，更能体现筛选的乳酸菌对变异链球菌的抑菌能力。

(3)牛津杯抑菌实验

准备0.7％琼脂含量的BHI培养基，灭菌；等温度降到47℃以下，加入0.3％(体积比)混合好的变异链球菌菌液，摇匀；取7mL倾倒至底层琼脂平板上，等凝固后，放上牛津杯，在孔里分别加入150μL初筛乳酸杆菌的发酵菌液，37℃培养48h，观察有无抑菌圈。

结果显示，本发明初筛获得的12株乳酸杆菌中，只有1株菌对变异链球菌有抑制效果，出现明显的抑菌圈。其中，ZY7菌株对变异链球菌的抑制作用最显著，其发酵菌液产生的抑菌圈直径达到23mm。

实施例2：ZY7菌株的鉴定

1、菌落形态鉴定

将ZY7菌株接种于MRS琼脂培养基上，37℃厌氧培养24h后，可见单菌落呈乳白色有光泽，菌落表面平整湿润，边缘整齐，菌落直径在1-2mm。显微镜下呈弯曲杆状或短杆状。

2、碳源代谢试验鉴定

利用API 50CHL试剂条测定ZY7菌株对49种碳源的代谢作用。

在无菌条件下，取适量新鲜菌液，5000rpm离心5min，用pH7.0磷酸缓冲液洗涤2次，再用同体积缓冲液重悬后，制得菌悬液。新鲜菌悬液按照10％的添加量加到API试剂盒的培养基中，然后按照试剂盒的操作，把培养基加到试纸条的孔里面，石蜡封口，然后把试纸条放到一个盒子里面，盒子底物加大约10ml的无菌去离子水，盖上盖子，放置到37℃培养箱中培养24-48h，观察颜色变化，若菌生长则颜色由蓝色变成黄色，不生长颜色维持不变。记录试验结果，上传到鉴定软件API web。

结果显示，ZY7菌株能利用甘油、核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露糖醇、山梨糖醇、α-甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰氨基葡萄糖、苦杏仁苷、黄柏素、七叶苷、水杨苷、鼠李糖、卫矛醇、肌醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、龙胆二糖、D-塔格糖和葡萄糖酸盐；不能利用赤山梨糖、藓糖醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、D-侧金盏花醇、β-甲基-D-木糖苷、α-甲基-甘露糖苷、蜜二糖、土伦糖、菊粉、棉子糖、淀粉、糖原、木糖醇、D-来苏糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-阿拉伯糖醇、L-阿拉伯糖醇、2-酮葡萄糖酸盐和5-酮葡糖酸盐。

API鉴定结果为该菌株为鼠李糖乳酪杆菌，ID＝99.4％，T值＝0.69。

3、分子生物学鉴定

3.1 16s rDNA基因序列分析

3.1.1基因组DNA提取

挑取平板上ZY6菌株的单菌落于MRS培养基中，37℃培养24h，然后取500μL发酵菌液，参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP302)操作，得到该菌株的基因组。

3.1.2 16s rDNA基因扩增

(1)引物序列:

27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA；

1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。

(2)反应体系(50μL)

表1：16s rDNAPCR扩增体系表

(3)电泳验证PCR产物核酸电泳结果为1500bp左右时符合要求。

(4)PCR产物测序

通过测序获得ZY7菌株的16s rDNA序列SEQ ID NO:1，并将该序列在NCBI数据库中进行比对，初步确定ZY7菌株为鼠李糖乳酪杆菌。

3.2 Riboprinter指纹图谱

用一根取菌棒从琼脂培养基平板上沾取已纯化好的ZY7菌株单菌落，将其放入缓冲液的样品管中，用手持搅拌棒使其在缓冲液中悬浮，然后将样品放入加热器中灭活后放入Riboprinter系统中，样品经过DNA制备、转模、成像检测及数据处理后，得到细菌鉴定结果。

鉴定结果显示，ZY7菌株为鼠李糖乳酪杆菌，其指纹图谱见图1。

3.3蛋白质谱鉴定

用牙签沾取平板上的ZY7菌株单菌落于蛋白质谱板上，然后用牙签把菌泥涂布均匀在质谱板上的圆盘内，涂布菌泥时不需要太厚，然后按照蛋白质谱试剂盒说明书要求加入1μL质谱样本预处理盒中的基质溶液覆盖样品，室温下自然晾干。晾干后的质谱板放置到Motitof蛋白质谱仪上进行鉴定。

蛋白质谱鉴定结果如图2所示，经过鉴定ZY7菌株为鼠李糖乳酪杆菌，匹配率为61％。

3.4全基因组测序

把ZY7菌株的菌液按照1％的体积比例接种到500ml MRS肉汤培养基中，37℃培养22h，然后8000rpm离心10min，收集菌体。菌体送到测序中心，得到该菌的全基因序列。将全基因序列上传至NCBI基因数据库，GenBank号为CP095384。

将ZY7菌株的菌落形态以及生理生化特性进行比对，综合分子生物学的鉴定结果，确定ZY7菌株为一株新型的鼠李糖乳酪杆菌，将其命名为鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14(Lacticaseibacillus rhamnosus VHProbi M14)。

实施例3：鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14对人工胃液和人工肠液的耐受性

1、菌液制备：

将冷冻保存的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14菌株划线接种于MRS固体培养基中，37℃培养24～48h，再经MRS液体培养基传代培养1次后，以5％的接种量把鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14接种到新鲜的MRS液体培养基中40℃振荡培养24～48h，获得新鲜的菌液。

2、人工胃液的配制

分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g和NaCl 2g，加入1000ml蒸馏水，用稀盐酸调pH3.0，然后115℃灭菌20min。然后使用前加入3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床温浴1h，以模拟人体温度。

3、人工肠液的配制

分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g、KH2PO4 6.8g和牛胆盐3.0g，加入77mL 0.2mol/L的NaOH溶液，定容至1000ml，用稀盐酸或者氢氧化钠溶液调pH 6.8±0.1，115℃灭菌20min。然后使用前加入1g胰酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床温浴1h，以模拟人体温度。

4、试验方法

取2mL新鲜菌液，5000rpm离心5min收集菌体，菌体用生理盐水洗涤3次，再用2mL生理盐水重悬，作为接种液。取1mL接种液，加入到9mL已温浴1h的人工胃液中，置于37℃水浴摇床以200rpm转速振荡2h，分别于0h和2h时取样1mL，检测活菌量。然后取1mL消化2h后的人工胃液，加入到24mL人工肠液中，置于37℃水浴摇床(200rpm)3h，取样1mL，检测活菌量。

活菌计数方法按照国标《GB4789.35-2016-食品微生物检验乳酸菌检验》测定菌量，该菌株经过人工胃液和人工肠液后的活菌量的(LogCFU/mL)如表2所示。

表2：人工胃肠耐受液消化后的活菌量表

从表2中可以看出，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14经过人工胃液消化后菌量对数值没有下降；经过人工肠液后，菌量对数值下降0.84，说明鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14株对人工胃液和人工肠液的耐受性比较强，食用的时候会有足量的活菌到达肠道，可以作为口腔潜在益生菌使用。

实施例4：鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14的溶血性试验

1、血细胞培养基准备：

称取TBS基础培养基的各种组分，溶解，121℃高压灭菌15min，等培养基冷却到50℃的时候，加入5％的无菌脱纤维绵羊血，混匀，倒平板。

2、划线培养：

将M14菌株划线接种于准备好的血细胞平板，37℃培养箱培养，24～48h后观察是否有溶血现象。

3、实验结果：

血细胞平板没有变化，说明鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14不产生溶血素，不能够溶解血细胞。

实施例5：鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14抗氧化能力测定

1、菌悬液制备

将生长状态优良的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14单菌落接种于3mL的MRS液体培养基中，37℃条件下培养24h，以此培养液为接种液，按照2％的接种量接种于50mL的MRS液体培养基中，静置培养24h，获得菌株的培养液。吸取1mL菌液收集菌体后用1mL pH7.0磷酸缓冲液洗涤菌体2遍后再加入1mL缓冲液重悬菌体备用。

2、清除羟自由基能力测定

将100μL 5mM的水杨酸钠-乙醇溶液，100μL 5mM的硫酸亚铁，500μL去离子水和200μL乳酸菌菌悬液混匀后加入100μL 3％过氧化氢溶液，37℃水浴15min后，4000rpm离心10min收集上清在510nm波长处测量样品吸光度。羟自由基清除率按照下列公式进行计算。

清除率％＝(A样品-A控制)/(A空白-A控制)×100％。

其中：A控制为硫酸亚铁、过氧化氢和水杨酸钠混合溶液的吸光度，A空白为硫酸亚铁和水杨酸钠混合溶液的吸光度。

结果显示，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14对羟基自由基的清除率为18.1％。

3、清除DPPH自由基能力测定

取1mL待测菌株的菌悬液，加入1mL 0.4mM的现配的DPPH自由基溶液，混合均匀后然后置于室温温度下遮光反应30min，然后测定样品在波长517nm处的吸光度A样品，测3次平行。对照组样品以等体积PBS溶液和DPPH·乙醇混合液，并以等体积PBS菌悬液和乙醇混合液空白调零。清除率按下列公式计算：清除率％＝[1-(A样品-A空白)/A对照]×100％。

结果显示，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14对DPPH自由基的清除率为16.8％。

实施例6：鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14对口腔致病菌的抑菌效果试验

1、裂解液制备

按照1％的接种量(体积比)把鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14接种到MRS肉汤培养基，37℃培养24h后停止培养，即得新鲜菌液。将部分菌液用超声破碎仪超声破碎20min，超声条件：功率30％，超声2s，停止2s；80℃灭活60min，得到无活菌的裂解液。

参照实施例1中所述牛津杯法抑菌实验步骤，分别测定鼠李糖乳酪杆菌VHProbiM14菌液和裂解液对变异链球菌(三株)、牙龈卟啉单胞菌BNCC353909、粘性放线菌ATCC27044、具核梭状杆菌BNCC 336949和伴放线聚集杆菌BNCC336945这五种口腔常见致病菌的抑菌效果，抑菌圈直径见表3。

表3：鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14对口腔致病菌的抑菌效果表

从表3的结果可知，本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14对变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌、粘性放线菌、具核梭状杆菌和伴放线聚集杆菌这五种口腔致病菌都有明显的抑制效果，抑菌谱较广。其中，该菌株对变异链球菌的抑菌效果最强，抑菌圈直径达23mm。

实施例7：鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14对口腔致病菌的凝集效果试验

共聚集是细胞和细胞蛋白质之间的相互作用。益生菌可以通过与致病菌凝集，防止其在口腔中定植和粘附，从而预防龋齿。凝集试验分为两种，一种是根据乳酸杆菌在一定条件下是否与致病菌结合形成可见的絮状沉淀及沉淀的大小来判断凝集作用，另一种是通过测定凝集率来确定共凝集效果。

1、菌悬液制备

按照1％的接种量(体积比)把鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14接种到MRS肉汤培养基，37℃培养24h后停止培养，得新鲜菌液；将新鲜菌液8000rpm转速离心10min，收集菌体；将菌体用pH7.0磷酸缓冲液洗涤两次，然后用pH7.0磷酸缓冲液重悬菌体，至菌悬液的初始吸光度OD600为0.5-0.6之间，备用。

2、致病菌菌悬液制备：

按照1％的接种量(体积比)把变异链球菌菌液接种到BHI肉汤培养基，37℃有氧培养24h后停止培养，得新鲜菌液；按照1％的接种量(体积比)把牙龈单胞卟啉菌，半放线聚集杆菌和具核梭状杆菌菌液接种到BHI肉汤培养基(添加5％的牛血清)，37℃厌氧培养48h后停止培养，得新鲜菌液；

将新鲜菌液8000rpm转速离心10min，收集菌体；将菌体用pH7.0磷酸缓冲液洗涤两次，然后用pH7.0磷酸缓冲液重悬菌体，调整菌悬液的初始吸光度OD600为0.5-0.6之间，备用。

3、凝集点试验

取鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14菌悬液300μL加入24孔板，再加入300μL病原菌菌悬液作为反应样本，另取等量的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14菌悬液和缓冲液混合作为对照，每个对照及样本设2平行。将24孔板置于微孔板恒温振荡器，400rpm，室温，振荡孵育。每振荡30min，停机30min，拍照记录初始孔板状态及每次停机时的孔板状态。

从图3的结果可知，2h内鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14与变异链球菌、具核梭状杆菌、牙龈卟啉单胞菌和半放线聚集杆菌四种致病菌均有凝集点出现。其中，与变异链球菌和具核梭状杆菌的凝集是多个凝集点，对牙龈卟啉单胞菌和半放线聚集杆菌是一个大的凝集点。从而说明鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14能够和常见口腔致病菌有效结合，显著抑制其粘附到牙齿或者牙龈上。

4、自凝集率和共凝集率的测定

(1)自凝集率测定

将制备的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14悬液取1ml加入24孔板内，室温静置。取100μL在波长600nm条件测定初始吸光值A0，在随后的6h内每隔2h吸取菌悬液上层，测量吸光度At，计算自聚力(R自)。结果见表4。

自聚力(R自)的计算公式：R

式中：R自为自聚力，％；At为t时间的吸光度，t＝2、4和6h；A0为鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14菌悬液初始吸光度。

表4 鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14的自凝集率表

从表4的结果可以看出，本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbiM14 6h时的自凝集率达到43.05％。从而说明，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14能够在口腔中有效定植。

(2)共凝集率测定

取100μL鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14菌悬液和致病菌菌悬液测定初始吸光值OD600，然后将等量的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14菌悬液和致病菌菌悬液混合，摇匀，室温静置，每个样品三个平行，每隔2h取上层悬浮液100μL测定吸光值OD600。计算共聚力(R

R

式中：R共为共聚力％；At为t时间的吸光度，t＝2h、4h和6h；A0为鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14菌悬液初始吸光度；B0为致病菌菌悬液初始吸光度。

表5：鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14对口腔致病菌的共凝集效果表

从表5的结果可以看出，本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbiM14可与变异链球菌、具核梭状杆菌、牙龈卟啉单胞菌和半放线聚集杆菌四种常见的口腔致病菌有效结合，2-6h时内共凝集率达到10.93％-51.83％。其中，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14对变异链球菌和半放线聚集杆菌的共凝集效果最好，6h时的共凝集率高达42.27％-59.11％。

鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14通过与致病菌有效结合，可以随着唾液流动和口腔清洁等行为，显著减少口腔内致病菌的数量，进而达到减少致病菌在口腔内荷载的效果。

实施例8：鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14对变异链球菌的拮抗粘附试验

变形链球菌是目前公认的龋病主要致病菌，其在口腔内的定植和粘附是龋齿形成的主要原因。口腔益生菌通过与致病菌形成凝集，抑制其生长和粘附，从而有效减少龋齿发生。

1、菌悬液制备

按照1％的接种量(体积比)把鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14接种到MRS肉汤培养基，37℃培养24h后停止培养，得新鲜菌液；将新鲜菌液8000rpm转速离心10min，收集菌体；将菌体用pH7.0磷酸缓冲液洗涤两次，然后用同体积pH7.0磷酸缓冲液重悬。

2、变异链球菌菌悬液制备：

参照实施例1所述方法制备变异链球菌菌液；将新鲜菌液8000rpm转速离心10min，收集菌体；将菌体用pH7.0磷酸缓冲液洗涤两次，然后用同体积pH7.0磷酸缓冲液重悬。

将500μL鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14菌悬液及500μL变异链球菌菌悬液混合均匀，静置5min后，取500μL上层溶液添加至已置入无菌细胞爬片的24孔板中，于37℃的温度下培养2h，再移除该上层溶液，以pH7.0磷酸盐缓冲液清洗后，加入0.5mL甲醇固定10min，然后弃去。最后加入300μL吉姆萨染液染色10min，然后弃去染液，用pH7.0磷酸缓冲液冲洗一遍，将细胞爬片置于载玻片上观察细胞爬片上的菌量。

结果如图4所示，对照组细胞爬片上粘附满了变异链球菌，而添加了鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14的实验组细胞爬片上有很少的变异链球菌，说明了鼠李糖乳酪杆菌VHProbiM14抑制变异链球菌粘附到细胞爬片上。从而说明，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14能够有效阻止口腔致病菌粘附到牙齿上，有助于预防龋齿的发生。

实施例9：鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14对变异链球菌的生物膜消除作用

变异链球菌在牙齿表面粘附和聚集会形成一层生物膜，进而产酸性导致龋齿。因此，去除变异链球菌形成的生物膜，对预防龋齿非常重要。

1、参照实施例1所述方法制备新鲜的变异链球菌菌液。

2、按照1％的接种量(体积比)把鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14接种到MRS肉汤培养基，37℃培养24h后停止培养，得新鲜发酵液。将发酵液分三部分进行如下处理：

(1)将部分发酵液8000rpm离心10min，收集菌体；将菌体用pH7.0磷酸缓冲液洗涤两次，然后用同体积pH7.0磷酸缓冲液重悬，制备得到活菌菌悬液；

(2)将部分发酵液用超声破碎仪超声破碎20min，超声条件：功率30％，超声2s，停止2s；80℃灭活60min，得到无活菌的裂解液；

(3)部分发酵液不进行任何处理。

3、准备无菌的带细胞爬片的24孔板

每孔加入600μL变异链球菌的菌液，培养24h后，变异链球菌在细胞爬片上粘附形成一层生物膜，然后弃除孔内培养液和未粘附的菌体，用pH7.0磷酸缓冲液洗涤两次；孔内分别加入600μL鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14发酵液、菌悬液和无活菌裂解液，其中每组做3个平行，并以等量MRS肉汤培养基作对照。

让待测样品和变异链球菌形成的生物膜37℃共培养24h，然后弃去孔内的液体后，加入600μL pH7.0磷酸缓冲液清洗，将每孔清洗3次，清洗时需不断强烈振动以除去未粘附的细菌，然后通过细胞爬片上变异链球菌的数量对比来判断待测样品生物膜去除率。

将细胞爬片置于无菌均质袋内，超声清洗10min，使菌体扩散到缓冲液中；将缓冲液进行梯度稀释，取100μL稀释缓冲液涂布添加了200U/L杆菌肽的轻质唾液链球菌培养基上37℃有氧培养24h，检测变异链球菌的菌量。通过以下公式计算变异链球菌生物膜的去除率。

去除率(％)＝(1-实验组菌量/对照组菌量)×100％。

表6：鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14对变异链球菌生物膜的去除效果表

从表6的数据可知，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14能高效去除变异链球菌形成的生物膜。其中，菌悬液即单纯的菌体对生物膜的去除率高达99.42％，说明菌体细胞膜上有变异链球菌的结合位点，单纯的菌体自身也能够与变异链球菌高效结合，短时间内几乎全部去除部分生物膜；而发酵液和裂解液中除了含有菌体自身外，还含有较多的代谢物质，能够更高效去除变异链球菌形成的生物膜，去除率达100％。

因此，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14能有效预防和治疗由变异链球菌引起的龋齿，其裂解液可广泛用于牙膏、漱口水等口腔护理用品中。

实施例10：鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14对变异链球菌的抑制生长试验

1、裂解液制备

将鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14新鲜菌液用超声细胞破碎仪破碎细胞壁，然后80℃处理60min，用0.22μL微孔滤膜过滤除去不溶物，制备得到裂解液上清。

2、接种液制备

将新鲜变异链球菌菌液用pH7.0磷酸缓冲液洗涤两次，同体积重悬。然后稀释5倍，作为接种液。

3、96孔板培养

每孔加入50μL BHI肉汤培养基和10μL变异链球菌菌液，其中实验组再加入20μL裂解液上清，对照组加入20μL无菌水；然后每孔用无菌水补充体积到200μL，加入50μL液体石蜡。每组设置4个平行。将96孔板放置于37℃酶标仪中，每间隔10min测定一次OD600，测定40h，得到变异链球菌的生长曲线，如图5所示。

从图5可以看出，对照组的变异链球菌在接种10h后开始快速增长，20h左右达到稳定期；而添加了鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14裂解液上清的实验组，变异链球菌在40h内几乎没有增长，从而说明鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14能够高效抑制变异链球菌的生长繁殖。

实施例11：鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14对人正常牙龈上皮细胞的毒性试验

1、细胞预培养

将人正常牙龈上皮细胞液氮中复苏，二氧化碳培养箱培养至所需量，待细胞密度生长至80％左右时，胰酶消化成单细胞悬液，血球计数板计数，细胞数为5×10

2、灭活菌液制备

鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14的新鲜菌液置于80℃水浴锅中灭活20min，然后用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤三次，用细胞培养液重悬菌体，并调整菌体浓度OD600＝0.4-0.5之间。

3、细胞培养

实验组：将灭活菌液按MOI(Multiplicity of Infection,感染复数)值为10的比例加入24孔板的细胞中；

空白对照组：加入与灭活菌液等体积的细胞培养液。

二氧化碳培养箱中继续培养24h。

在待检测的每个细胞培养孔中加入MTT溶液，使其终浓度为0.3g/L；将24孔板放置于二氧化碳培养箱中孵育3h，小心弃掉上清；每个24孔板细胞培养孔中加入500μL DMSO，37℃下孵育30min，使紫色结晶充分溶解；在波长490nm下检测吸光度值。

结果显示，空白对照组的吸光值是0.668，而实验组的吸光值是0.668。结果表明鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14对人正常牙龈上皮细胞的增殖活性无显著影响，安全性良好，无细胞毒性。

实施例12：鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14对人正常牙龈上皮细胞的粘附性

粘附性是益生菌在口腔中定植的重要先决条件，粘附性高在这个生态系统中有竞争优势。

1、细胞预培养

将人正常牙龈上皮细胞液氮中复苏，培养至所需量，待细胞密度生长至80％左右时，胰酶消化成单细胞悬液，血球计数板计数，细胞数为5×10

2、菌悬液制备

将鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14新鲜菌液用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤两次，然后用含10％小牛血清的1640培养液同体积重悬，调整吸光度，使OD600＝0.4-0.5之间。

3、细胞培养

在已准备好的含人原代牙龈上皮细胞的24孔板内加入菌悬液500μL，于二氧化碳培养箱中共生培养2h；用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤3次，去除未粘附的菌。

4、镜检

将细胞爬片用甲醇固定15min，然后吉姆萨染液染色5min，pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤冲洗干净后，取出细胞爬片到载玻片上。在显微镜下观察并计数，随机选择50个细胞，并计算其可视性细胞表面的鼠李糖乳酪杆菌数量，运用统计学方法计算粘附指数的均数和标准差。

粘附指数＝粘附细菌数/细胞数。

结果显示，5个细胞上大约才能看到粘附1个菌体，粘附指数是0.17，从而说明，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14对牙龈上皮细胞粘附力良好，能够在口腔中有效定植。

实施例13：鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14在细胞水平上对牙周病原菌的拮抗粘附试验

1、细胞预培养

将人正常牙龈上皮细胞液氮中复苏，培养至所需量，待细胞密度生长至80％左右时，胰酶消化成单细胞悬液，血球计数板计数，细胞数为5×10

2、菌悬液制备

将鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14新鲜菌液用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤两次，然后用含10％小牛血清的1640培养液同体积重悬，调整吸光度，使OD600＝0.4-0.5之间。

采样同样方法分别制备得到牙龈卟啉单胞菌、具核梭状杆菌和半放线聚集杆菌的菌悬液。

3、细胞培养

实验组：将鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14菌悬液和致病菌菌悬液按照体积比1:1的比例混匀，然后取500μL加入到上述准备好的24孔板内；

对照组：将致病菌菌悬液和磷酸盐缓冲液按照体积比1:1的比例混匀，然后取500μL加入到上述准备好的24孔板内。

将24孔板置于二氧化碳培养箱中共生培养2h，终止培养，用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤3次，去除未粘附的菌。

4、镜检

每个孔加入500μL甲醇固定15min，然后吉姆萨染液染色5min，pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤冲洗干净后，取出孔内的细胞爬片到载玻片上。在显微镜下观察并计数，随机选择50个细胞，并计算其可视细胞表面的致病菌数量，运用统计学方法计算粘附指数的均数和标准差。具体结果见表7，镜检结果如图6-8所示，

其中粘附指数＝粘附细菌数/细胞数。

表7：鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14对牙周致病菌的拮抗粘附效果表

从图6-8以及表7的数据可以看出，与对照组相比，添加鼠李糖乳酪杆菌VHProbiM14菌悬液的实验组半放线聚集杆菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭状杆菌对牙龈上皮细胞的粘附指数普遍下降了43％-96％，其中对半放线聚集杆菌的粘附抑制效果最强，粘附指数最低，仅有1.38。从而说明，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14能显著抑制常见牙周致病菌对牙龈上皮细胞的粘附作用，取得了意料不到的技术效果。

上述细胞实验结果表明，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14对人正常牙龈上皮细胞没有毒性，且能够粘附在细胞上，在口腔内实现有效定植，有助于平衡口腔菌群。鼠李糖乳酪杆菌VHProbi M14能够显著抑制牙周致病菌(半放线聚集杆菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭状杆菌)在人正常牙龈上皮细胞上的粘附生长，有效预防和改善所述致病菌引起的牙周炎，牙龈出血等症状。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物股份有限公司

青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一株鼠李糖乳酪杆菌及其在预防或治疗龋齿和牙周病中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1351

<212> DNA

<213> 鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)

<400> 1

ccggcttcgg gtgttacaaa ctctcatggt gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa 60

cgtattcacc gcggcgtgct gatccgcgat tactagcgat tccgacttcg tgtaggcgag 120

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