一株假真菌样芽孢杆菌CNBG-PGPR-20及其在蔬菜疫病防治中的应用

技术领域

本发明涉及一株假真菌样芽孢杆菌CNBG-PGPR-20及其在蔬菜疫病防治中的应用，属于植物病害的生物防治领域。

背景技术

作物疫病是一种毁灭性病害，其病原菌借风、雨、灌溉水传播和再侵染，具有扩散速度快、易爆发成灾等特点。作物疫病的病原菌主要有致病疫霉、大豆疫霉、辣椒疫霉、寄生疫霉等，其中辣椒疫霉菌的寄主范围广泛，可侵染多种蔬菜，如辣椒、番茄、黄瓜、南瓜等，给农业生产造成严重的经济损失。

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)主要以卵孢子、厚桓孢子等形式在病残体、土壤及种子上越冬，其中土壤病残体带菌率高，是主要浸染源。条件适宜时，越冬后的病原菌经雨水飞溅或灌溉水传到茎基部或近地面植株上，引起蔬菜疫病。

目前对蔬菜疫病的防治主要还是依赖栽培抗病品种和使用化学药剂，但是由于疫病菌变异速度快，导致现有抗病品种易丧失；而化学防治容易造成环境污染和病原菌抗药性水平上升。生物防治对环境友好，对食品无害，无病原菌抗药性产生。因此，生物防治尤其是利用生防菌及其代谢产物防治病害，受到越来越多的关注，具有广阔的应用前景和市场潜力。

假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)是一类革兰氏阳性细菌，生长迅速，在营养琼脂平板上呈菌丝状生长，一定条件下能形成芽孢。但是，目前尚没有人研究和报道假真菌样芽孢杆菌对于蔬菜疫病的防治作用。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一株生长迅速，稳定性好的假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20。

本发明还提供了一种菌剂或制剂，其含有所述的假真菌样芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)CNBG-PGPR-20或其发酵液、无菌上清中的一种或几种。

本发明还提供了所述假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20或菌剂、制剂在蔬菜疫病防治中的应用，其具有较好的防治效果，可有效避免化学防治造成的环境污染和病原菌抗药性水平上升等问题。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一株假真菌样芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)CNBG-PGPR-20，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京，保藏编号为CGMCC No.24116，保藏日期为2021年12月16日，分类命名为假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)。

本发明还提供了一种菌剂或制剂，所述菌剂或制剂含有所述的假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20或其发酵液、无菌上清中的一种或几种。

其中，所述发酵液和/或无菌上清的制备包括如下步骤：

(1)挑取假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20单菌落并接种于NB培养基中，28～30℃、160～220rpm培养，得到菌液；

(2)将菌液接种于NB培养基中，28～30℃、160～220rpm震荡培养2～3d，即得假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20发酵液；

和/或

(3)将步骤(2)所得发酵液12000rpm离心20～30min，过滤除菌，即得假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20无菌上清。

其中，步骤(3)所述的过滤采用的是Ψ＝0.22μm的微孔滤膜。

本发明还提供了所述假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20或所述菌剂或制剂在蔬菜疫病防治中的应用。

其中，所述应用包括通过以下方式实现：给所述蔬菜浇灌所述假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20、菌剂或制剂中的一种或几种。

其中，当所述菌剂或制剂含有所述假真菌样芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)CNBG-PGPR-20发酵液时，所述菌剂或制剂在施用时，所述假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20发酵液的浓度为1×10

其中，当所述菌剂或制剂含有所述假真菌样芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)CNBG-PGPR-20无菌上清时，所述菌剂或制剂在施用时，所述假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20无菌上清的体积分数为1％～20％。

其中，所述蔬菜包括辣椒或番茄中的一种或两种。

其中，所述疫病由辣椒疫霉菌引起。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

1、本发明得到的假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20生长迅速，稳定性好；

2、在蔬菜疫病防治方面，假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20及其发酵液和无菌上清都具有较好的防治效果，都能够应用于蔬菜疫病的生物防控；

3、使用假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20及其菌剂、制剂可有效避免化学防治造成的环境污染和病原菌抗药性水平上升等问题，具有良好的开发应用前景，值得大力推广。

附图说明

图1为假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20在NB培养基中的细菌形态图；

图2为假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20在NA培养基上的菌落形态图；

图3为假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20的系统进化树；

图4为假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20对辣椒疫霉的抑制作用(NA medium为对照组，CNBG-PGPR-20为处理组)；

图5为假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20无菌上清对辣椒疫霉的抑制作用(NB medium为对照组，CNBG-PGPR-20为处理组)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20的分离、纯化及鉴定

取常年种植蔬菜地土壤样品(句容，江苏)10g，与100mL无菌水混合振荡制成悬浮液，然后依次进行梯度稀释，吸取分别稀释了10倍、100倍和1000倍的土壤悬浮液100μL涂布于NA(Nutrient Agar)培养基平板上，于30℃培养箱中培养，待长出菌落。然后，分别挑取单菌落在新的NA平板上和NB培养基中。其中，NB培养基配方：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1L，pH7.2～7.5，121℃高温高压灭菌15min。NA培养基配方：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15g，蒸馏水1L，pH7.2～7.5，121℃高温高压灭菌15min。

将挑取的单菌落在NA平板上进行分区纯化，重复纯化直至单菌落出现，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对菌株进行形态学测定。

将挑取的单菌落于NB培养基中，30℃200rpm振荡培养过夜，然后用细菌基因组DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取细菌基因组DNA，以DNA为模板，用引物27F和1492R分别进行16SrRNA基因序列扩增。PCR扩增反应体系为50μL：25μL EasyTaq Mix、2μL正向引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)、2μL反向引物1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)、1μLDNA模板、20μL无菌水。扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳无误后，再纯化送至南京擎科生物科技有限公司进行测序。

实验结果如图1和图2所示，获得的菌株在NB液体培养基中30℃200rpm下培养2天后，镜检下菌体细胞呈短杆状，可相连成短链，具芽孢；在NA平板上30℃培养1天后，菌落为丝状，呈不规则放射性生长，不透明。

对测序结果进行拼接处理，得到菌株的16S rRNA基因近全长序列(如SEQ ID NO.1所示)，长度为1451bp。将菌株的16S rRNA基因序列在GenBank数据库(NCBI)进行同源序列检索，并利用BLAST分析找到相似度最高的菌株。结果如图3所示，该菌株与一株假真菌样芽孢杆菌典型菌株(type strain)的相似度达到了99.65％。同时，利用MEGA 7软件并采用最大可能性法(Maximum Likelihood methods)构建系统进化树，发现该菌株与一株假真菌样芽孢杆菌(NBRC 101232)聚成一簇，可确定所得菌株是假真菌样芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)CNBG-PGPR-20。然后，将所获的假真菌样芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)CNBG-PGPR-20保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2021年12月16日，保藏编号是CGMCC No.24116，分类命名为假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)。

实施例2假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20对辣椒疫霉的抑制作用

采用平板对峙培养法，测定假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)

CNBG-PGPR-20对辣椒疫霉的抑制作用。将假真菌样芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)CNBG-PGPR-20划线于NA平板上30℃培养1～2天备用。将实验室保存的辣椒疫霉菌株(菌株号：LT263)活化，用无菌打孔器(5mm)打孔，再用无菌接种针挑取含病原菌的琼脂块置于V8固体培养基中央。所述V8培养基具体配制方法：每100mL的V8蔬菜汁(美国进口V8原味混合蔬菜汁饮料)中加入1g CaCO

抑菌率(％)＝(Rc-Rt)/Rc×100％

其中，Rc表示对照组菌丝生长半径，Rt表示处理组菌丝生长半径(靠拮抗菌一侧)。

实验结果显示，如表1和图4，假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20对辣椒疫霉的菌丝生长有显著的抑制作用，抑制率为42.11％(表1)。

表1

实施例3假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20无菌上清对辣椒疫霉的抑制作用

将假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20在NA平板上划线培养2天后，挑取生长良好的单菌落接种于2mL的NB液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养过夜，得到菌液。而后吸取1mL菌液接种于100mL NB液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养3d，得到发酵液。取发酵液于50mL离心管中，12000rpm离心20min，得上清液，将上清液过滤(Ψ＝0.22μm的微孔滤膜)除菌得到无菌上清，-20℃保存备用。

将无菌上清与冷却至50℃的V8固体培养基按照1：9的比例混合均匀作为处理组，同时以同等比例混合的NB培养基和V8固体培养基为对照组，倒平板。将实验室保存的辣椒疫霉菌株(菌株号：LT263)活化，用无菌打孔器(5mm)打孔，用无菌接种针分别挑取含有辣椒疫霉菌的琼脂块置于对照组和处理组的平板中央，25℃培养至对照组病原菌长至平板边缘，观察抑菌效果，并计算抑菌率。

抑菌率＝(对照组病原菌生长半径-处理组病原菌生长半径)/对照病原菌生长半径×100％

实验结果如表2和图5所示，假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)

CNBG-PGPR-20无菌上清对辣椒疫霉的菌丝生长有显著的抑制作用，抑制率为45.2％。

表2

实施例4假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20发酵液及无菌上清对辣椒疫病的防治效果

将保存于10％ V8固体培养基上的辣椒疫霉菌株用5mm的打孔器获取菌碟，并将一个菌碟接种于一个新的V8平板中央，25℃培养箱中黑暗培养3天备用。将上述培养好的病原菌平板(20个)用刀片切成0.5cm见方的菌丝小块，与4kg土混合均匀，装入栽培盆，将之前培养好的辣椒幼苗分别移栽到上述盆中，每盆移栽20棵，每组3盆，放于日光温室培养。

挑取生长良好的假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20单菌落接种于2mL的NB液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养过夜。而后吸取2mL假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20菌液接种于200mL的NB培养基中，30℃、200rpm培养3d。之后用50mL离心管，4000rpm离心10min收菌，待菌液收取完毕后，用适当体积NB培养基重悬，分别调整菌浓度为1×10

同时，按照上述方法获取假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20无菌上清，分别用无菌蒸馏水稀释至1％、5％、10％、20％(体积分数)，-20℃保存备用。

移栽后的第4天，将上述准备好的不同浓度的假真菌样芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)CNBG-PGPR-20发酵液和无菌上清分别均匀充分浇灌于上述栽种辣椒幼苗的盆中，同时以相同体积的NB培养基为对照。处理20天后，统计死亡率，计算防治效果。

防治效果＝(对照组死亡率-处理组死亡率)/对照组死亡率×100％

表3

由表3可知，假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20发酵液和无菌上清也具有显著的防治效果；当其发酵液的浓度为2×10

实施例5假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20发酵液及无菌上清对番茄疫病的防治效果

将保存于10％ V8固体培养基上的辣椒疫霉菌株用5mm的打孔器获取菌碟，并将一个菌碟接种于一个新的V8平板中央，25℃培养箱中黑暗培养3天备用。将上述培养好的病原菌平板(20个)用刀片切成0.5cm见方的菌丝小块，与5kg土混合均匀，装入栽培盆，将之前培养好的番茄幼苗分别移栽到上述盆中，每盆移栽20棵，每组3盆，放于日光温室培养。

按照上述方法获得菌浓度分别为1×10

同时，按照上述方法获取体积分数分别为1％、5％、10％、20％的假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20无菌上清，-20℃保存备用。

移栽后的第5天，将上述准备好的不同浓度的假真菌样芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)CNBG-PGPR-20发酵液和无菌上清分别均匀充分浇灌于上述栽种番茄幼苗的盆中，同时以相同体积的NB培养基为对照。处理20天后，统计死亡率，计算防治效果。

防治效果＝(对照组死亡率-处理组死亡率)/对照组死亡率×100％

表4

表4显示，假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20发酵液及其无菌上清均有显著的防治效果，当其发酵液的浓度为2×10

综上所述，假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)CNBG-PGPR-20及其发酵液、无菌上清在蔬菜疫病防治中均有显著效果。