一种利用超高液相色谱法检测水和藻培养基中2-氨基-3,4-二氟苯甲醛的方法

技术领域

本发明属于有机化合物检测技术领域，具体涉及一种利用超高液相色谱法检测水和藻培养基中2-氨基-3,4-二氟苯甲醛的方法。

背景技术

2-氨基-3,4-二氟苯甲醛(FDFA)，其CAS号为1602097-79-9，分子式为C

2-氨基-3,4-二氟苯甲醛是重要的化学原料，常作农药中间体而被广泛应用。目前，2-氨基-3,4-二氟苯甲醛的相关报道较少，尚未有2-氨基-3,4-二氟苯甲醛相关的质量控制方法公开，因此，建立一种2-氨基-3,4-二氟苯甲醛的检测方法对其工业化应用和应用过程中的质量控制十分重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用超高液相色谱法检测水和藻培养基中2-氨基-3,4-二氟苯甲醛的方法，实现对2-氨基-3,4-二氟苯甲醛的质量控制。

本发明的目的通过如下技术方案达到：

一种利用超高液相色谱法检测水和藻培养基中2-氨基-3,4-二氟苯甲醛的方法，包括如下步骤：(1)标准曲线的绘制：精密称取0.05015g 2-氨基-3,4-二氟苯甲醛标准品于50mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀配制成浓度为1000mg/L的2-氨基-3,4-二氟苯甲醛标准储备液，取适量标准储备液，用乙腈稀释成浓度为0.500～10.0mg/L的系列标准工作溶液，以溶剂为空白对照，按超高液相色谱条件测定峰面积，绘制标准曲线，得到线性回归方程；(2)供试品溶液的配制：分别精密称取1.30371g 2-氨基-3,4-二氟苯甲醛试样于25mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，配制得到浓度为52003mg/L的2-氨基-3,4-二氟苯甲醛试样储备液；分别吸取适量试样储备液于两个100mL的容量瓶中，分别用试验水和藻培养基稀释，即得待测供试品溶液，待超高液相色谱测定；(3)供试品的测定：设置超高液相色谱的仪器操作条件，待仪器稳定后，将供试品溶液进行超高液相色谱测定，根据线性回归方程计算供试品溶液中2-氨基-3,4-二氟苯甲醛的含量。

步骤(1)中，系列标准工作溶液的浓度分别为0.500mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L、4.00mg/L、8.00mg/L、10.0mg/L。

本发明超高液相色谱采用Agilent Infinity II Prime 1260色谱仪，超高液相色谱的仪器操作条件为：色谱柱：Shim-pack GIST C18，250mm×4.6mm，5μm；进样体积：2.0～8.0μL；流速：0.4～0.80mL/min；检测波长：218～223nm；流动相：A为0.1％磷酸水溶液，B为乙腈；柱温：32～38℃。

优选为，进样体积为5.00μL。

优选为，流速为0.60mL/min。

优选为，检测波长为221nm。

优选为，流动相A和B的体积比为30:70。

优选为，柱温为35℃。

本发明的线性回归方程为y＝90.74x+1.16，线性相关系数R

本发明在试验水中的LOD为0.0108mg/L，LOQ为0.0359mg/L；在藻培养基中的LOD为0.0100mg/L，LOQ为0.0334mg/L。

本发明的有益效果是：

1、本发明首次提供了一种利用超高液相色谱检测2-氨基-3,4-二氟苯甲醛的方法，为2-氨基-3,4-二氟苯甲醛后续生产应用过程和相关研究中的质量控制提供了技术参考,本发明的检测方法专属性强，准确性高，出峰时间短，重现性好、操作简单。

2、本发明经线性试验考察，在0.500mg/L～10.0mg/L范围内线性关系良好，线性方程为y＝90.74x+1.16，线性相关系数R

3、本发明在专属性试验中，通过比较试验水和藻培养基空白样品和添加回收率样品的谱图，2-氨基-3,4-二氟苯甲醛在6.9min出峰，且空白样品在该时间点无干扰峰，专属性好。

4、本发明经检出限和定量限试验，2-氨基-3,4-二氟苯甲醛在试验水中的LOD为0.0108mg/L，LOQ为0.0359mg/L；在藻培养基中的LOD为0.0100mg/L，LOQ为0.0334mg/L，能满足微量样品浓度的检测。

5、本发明回收率和重复性试验结果表明，2种不同浓度的2-氨基-3,4-二氟苯甲醛在试验水中的平均添加回收率分别为87.7％和97.1％，回收率相对标准偏差分别为4.28％和0.201％；2种不同浓度的2-氨基-3,4-二氟苯甲醛在藻培养基中的平均添加回收率分别为92.2％和102％，回收率相对标准偏差分别为3.89％和0.164％，本发明回收率高，重复性好。

附图说明

图1为2-氨基-3,4-二氟苯甲醛在乙腈中线性拟合曲线图；

图2为2-氨基-3,4-二氟苯甲醛典型图谱(4.00mg/L)；

图3为试验水空白图谱；

图4为藻培养基空白图谱；

图5为2-氨基-3,4-二氟苯甲醛试验水中低浓度回收率加标溶液典型图谱；

图6为2-氨基-3,4-二氟苯甲醛试验水中高浓度回收率加标溶液典型图谱；

图7为2-氨基-3,4-二氟苯甲醛藻培养基中低浓度回收率加标溶液典型图谱；

图8为2-氨基-3,4-二氟苯甲醛藻培养基中高浓度回收率加标溶液典型图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步的说明，但不用于限制本发明的保护范围。

除特别说明外，本发明所涉及的方法、原料、试剂或仪器均可由常规方法制备或市场购得。

以下实施例采用的试剂和仪器包括但不限于：

1、试剂和溶剂

(1)乙腈：HPLC级，上海安谱实验科技股份有限公司；

(2)磷酸：HPLC级，霍尼韦尔(中国)有限公司；

(3)UP水：电阻率，18.2MΩ×cm；

(4)试验水：实验室自制；

(5)藻培养基：实验室自制；

(6)2-氨基-3,4-二氟苯甲醛标准品，纯度为99.72194％：

2、主要仪器设备

(1)超高效液相色谱仪：Agilent Infinity II Prime 1260，VWD检测器；

(2)色谱柱：Shim-pack GIST C18，250mm×4.6mm，5μm；

(3)电子天平：METTLER TOLEDO,XS105,HFC0044；

实施例1：

(1)标准曲线的绘制：精密称取0.05015g 2-氨基-3,4-二氟苯甲醛标准品于50mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀配制成浓度为1000mg/L的2-氨基-3,4-二氟苯甲醛标准储备液，取适量标准储备液，用乙腈稀释成浓度分别为0.500mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L、4.00mg/L、8.00mg/L、10.0mg/L的系列标准工作溶液，以溶剂为空白对照，按超高液相色谱条件测定峰面积，绘制标准曲线，得到线性回归方程；

(2)供试品溶液的配制：分别精密称取1.30371g 2-氨基-3,4-二氟苯甲醛试样于25mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，配制得到浓度为52003mg/L的2-氨基-3,4-二氟苯甲醛试样储备液；分别吸取适量试样储备液于两个100mL的容量瓶中，分别用试验水和藻培养基稀释，即得待测供试品溶液，待超高液相色谱测定；

(3)供试品的测定：设置超高液相色谱的仪器操作条件，待仪器稳定后，将供试品溶液进行超高液相色谱测定，根据线性回归方程计算供试品溶液中2-氨基-3,4-二氟苯甲醛的含量。

本实施例超高液相色谱的仪器操作条件为：采用Agilent Infinity IIPrime1260色谱仪，色谱柱为Shim-pack GIST C18，规格为250mm×4.6mm，5μm；进样体积为5.0μL；流速为0.6mL/min；检测波长为221nm；流动相：A为0.1％磷酸水溶液，B为乙腈，流动相A和B的体积比为30:70；柱温为35℃。

实施例2：

(1)标准曲线的绘制：精密称取0.05015g 2-氨基-3,4-二氟苯甲醛标准品于50mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀配制成浓度为1000mg/L的2-氨基-3,4-二氟苯甲醛标准储备液，取适量标准储备液，用乙腈稀释成浓度分别为0.500mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L、4.00mg/L、8.00mg/L、10.0mg/L的系列标准工作溶液，以溶剂为空白对照，按超高液相色谱条件测定峰面积，绘制标准曲线，得到线性回归方程；

(2)供试品溶液的配制：分别精密称取1.30371g 2-氨基-3,4-二氟苯甲醛试样于25mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，配制得到浓度为52003mg/L的2-氨基-3,4-二氟苯甲醛试样储备液；分别吸取适量试样储备液于两个100mL的容量瓶中，分别用试验水和藻培养基稀释，即得待测供试品溶液，待超高液相色谱测定；

(3)供试品的测定：设置超高液相色谱的仪器操作条件，待仪器稳定后，将供试品溶液进行超高液相色谱测定，根据线性回归方程计算供试品溶液中2-氨基-3,4-二氟苯甲醛的含量。

本实施例超高液相色谱的仪器操作条件为：采用Agilent Infinity IIPrime1260色谱仪，色谱柱为Shim-pack GIST C18，规格为250mm×4.6mm，5μm；进样体积为2.0μL；流速为0.4mL/min；检测波长为218nm；流动相：A为0.1％磷酸水溶液，B为乙腈，流动相A和B的体积比为30:70；柱温为32℃。

实施例3：

(1)标准曲线的绘制：精密称取0.05015g 2-氨基-3,4-二氟苯甲醛标准品于50mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀配制成浓度为1000mg/L的2-氨基-3,4-二氟苯甲醛标准储备液，取适量标准储备液，用乙腈稀释成浓度分别为0.500mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L、4.00mg/L、8.00mg/L、10.0mg/L的系列标准工作溶液，以溶剂为空白对照，按超高液相色谱条件测定峰面积，绘制标准曲线，得到线性回归方程；

(2)供试品溶液的配制：分别精密称取1.30371g 2-氨基-3,4-二氟苯甲醛试样于25mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，配制得到浓度为52003mg/L的2-氨基-3,4-二氟苯甲醛试样储备液；分别吸取适量试样储备液于两个100mL的容量瓶中，分别用试验水和藻培养基稀释，即得待测供试品溶液，待超高液相色谱测定；

(3)供试品的测定：设置超高液相色谱的仪器操作条件，待仪器稳定后，将供试品溶液进行超高液相色谱测定，根据线性回归方程计算供试品溶液中2-氨基-3,4-二氟苯甲醛的含量。

本实施例超高液相色谱的仪器操作条件为：采用Agilent Infinity IIPrime1260色谱仪，色谱柱为Shim-pack GIST C18，规格为250mm×4.6mm，5μm；进样体积为8.0μL；流速为0.8mL/min；检测波长为223nm；流动相：A为0.1％磷酸水溶液，B为乙腈，流动相A和B的体积比为30:70；柱温为38℃。

为了进一步验证本发明的可行性，发明人开展了一系列的方法学验证试验研究，部分试验内容摘录如下：

1、线性考察试验

吸取实施例1中的系列标准工作溶液，按本发明的超高液相色谱条件进行测定，每个浓度平行进样2次，结果见表1；以目标物浓度的平均值为横坐标，目标物峰面积的平均值为纵坐标，绘制标准曲线。

表1：2-氨基-3,4-二氟苯甲醛(FDFA)标准工作溶液分析结果

结果显示，当2-氨基-3,4-二氟苯甲醛浓度在0.500mg/L～10.0mg/L范围时，y与x之间呈线性关系。对曲线进行线性回归得到被试物在乙腈中的方程为y＝90.74x+1.16，线线性相关系数R

2、专属性试验

按本发明的超高液相色谱条件测定试验水空白样品、试验水回收率样品、藻培养基空白样品、藻培养基回收率样品，比较空白样品和回收率样品的色谱图。2-氨基-3,4-二氟苯甲醛的保留时间为6.9min，且空白样品在该时间点无干扰峰，结果表明该方法对2-氨基-3,4-二氟苯甲醛(FDFA)的专属性好。

3、回收率和重复性试验

(1)试验水回收率浓度配制

配制并吸取浓度为100mg/L的2-氨基-3,4-二氟苯甲醛标准储备液0.800ml于100mL容量瓶中，用试验水溶解并定容至刻度，摇匀，得到浓度为0.800mg/L的试验水低浓度回收率试验溶液。重复以上操作，配制5个平行。

配制并吸取浓度为52003mg/L的2-氨基-3,4-二氟苯甲醛标准储备液0.230mL于100mL容量瓶中，用试验水溶解并定容至刻度，摇匀，得到浓度为120mg/L的试验水高浓度回收率试验溶液，重复以上操作，配制5个平行。

取空白基质与试验水高、低浓度的回收率试验溶液，高浓度回收率试验液用乙腈稀释20倍，低浓度回收率试验液直接取样，过0.45μm滤膜，按本发明的超高液相色谱仪器操作条件进行测试，按公式(1)计算回收率，按公式(2)和公式(3)计算回收率相对标准偏差(RSD)。

(2)藻培养基回收率浓度配制

配制并吸取浓度为100mg/L的2-氨基-3,4-二氟苯甲醛标准储备液0.800ml于100mL容量瓶中，用藻培养基溶解并定容至刻度，摇匀，得到浓度为0.800mg/L的藻培养基高浓度回收率试验溶液。重复以上操作，配制5个平行。

配制并吸取浓度为52003mg/L的2-氨基-3,4-二氟苯甲醛标准储备液1.000mL于100mL容量瓶中，用藻培养基溶解并定容至刻度，摇匀，得到浓度为520mg/L的藻培养基低浓度回收率试验液，重复以上操作，配制5个平行。

取空白基质与藻培养基高、低浓度的回收率试验溶液，高浓度回收率试验液用乙腈稀释100倍，低浓度回收率试验液直接取样，过0.45μm滤膜，按本发明的超高液相色谱仪器操作条件进行测试，按公式(1)计算回收率，按公式(2)和公式(3)计算回收率相对标准偏差(RSD)。

分析方法精密度以重复性体现，用相对标准偏差RSD表示。

重复性采用回收率试验溶液进行分析，计算高、低浓度各5个水平的RSD。

分析结果见表2、表3，2种不同浓度的2-氨基-3,4-二氟苯甲醛(FDFA)在试验水中的平均添加回收率分别为87.7％和97.1％，回收率相对标准偏差分别为4.28％和0.201％；2种不同浓度的2-氨基-3,4-二氟苯甲醛(FDFA)在藻培养基中的平均添加回收率分别为92.2％和102％，回收率相对标准偏差分别为3.89％和0.164％。

式中：

R——回收率，％；

Cd——目标物的实测浓度，mg/L；

Ca——目标物理论添加浓度，mg/L。

式中：

S——标准偏差；

Xi——第i次测量得到的回收率，％；

——回收率的平均值，％；

N——参与计算的回收率个数。

式中：

RSD——相对标准偏差，％。

表2：试验水中回收率试验结果

表3：藻培养基中的回收率

4、检出限和定量限

对本发明低浓度回收率样品得到的图谱进行分析，结果见表4和表5。在该浓度下，试验水中目标峰的平均信噪比(S/N)＝223，藻培养基中目标峰的平均信噪比(S/N)＝239；根据LOD＝3×分析浓度/(S/N)，LOQ＝10×分析浓度/(S/N)。得本方法在试验水中的LOD为0.0108mg/L；LOQ为0.0359mg/L，在藻培养基中的LOD为0.0100mg/L；LOQ为0.0334mg/L。

表4：LOD、LOQ试验结果—试验水

表5：LOD、LOQ试验结果—藻培养基

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。