一种检测淋病奈瑟菌的居家自检试剂盒

技术领域

本发明涉及试剂盒技术领域，具体涉及一种检测淋病奈瑟菌的居家自检试剂盒。

背景技术

淋病奈瑟菌是淋病的病原体，严重危害人群身心健康。从数据分析来看，淋病发病率下降。由于筛查的力度不足，仍然存在着淋病病例(特别是女性病例)发现不足的问题。

我国淋病的实验室常规检测方法包括直接显微镜检查、分离培养淋球菌及核酸检测。

关于核酸检测，目前国内大部分用的是荧光法。仁度生物的淋病奈瑟菌核酸检测试剂盒(RNA恒温扩增)市场份额较大。该试剂盒基于实时荧光等温核酸扩增技术(SAT)。首先，该试剂盒对阴道采样拭子来源的样品溶解于500ul生理盐水中，在取出400ul生理盐水进行核酸提取及纯化。通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸(RNA)的一个双链DNA拷贝，然后利用T7 RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个(100～1000个)RNA拷贝；每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，实时反映扩增循环情况。达安基因的淋球菌核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)用一对淋球菌特异性引物和一条淋球菌特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、核苷酸(dNTPs)等成分，用PCR体外扩增法检测淋球菌(NGH)DNA。

直接涂片法应用于眼部感染标本的敏感性可达95％，但用于泌尿生殖道感染的诊断时其敏感性和特异性均低。

细胞培养法被公认是检测的金标准，但该方法敏感性受标本采集、储存、运输以及污染的影响较大，不同样本类型的敏感性差异较大。目前细胞培养法在诊断实验室很少被使用。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是近年来发展起来的一种快速而强大的检测工具，广泛应用于病原微生物的鉴定，其检测原理是依据质荷比(m/z)的不同，提供微生物的蛋白质组指纹图谱，通过与已知微生物质谱峰比较，实现对微生物的快速鉴定。MALDI-TOF MS检测淋球菌单个反应成本较低、操作简单、检测迅速，但需要对培养后的菌落进行鉴定，检测的准确性依赖于数据库中菌种的信息量和可靠性，需要进一步完善其数据库并临床评估其准确性。

微生物的核酸检测(nucleic acid tests，NATs)技术包括两种类型，直接NATs检测和目标基因扩增技术(nucleic acid amplification tests，NAATs)。临床检测主要采用直接NATs技术，其准确性高于直接免疫学检测方法。但直接NATs技术的灵敏度远不如目标基因扩增技术(nucleic acid amplification tests，NAATs)，其包括实时荧光PCR、转录介导扩增技术(transcription mediated amplifica-tion，TMA)、链置换扩增(stranddisplacement amplifi-cation，SDA)等检测方法。NAATs敏感性高，对泌尿生殖道标本的检测是较好的选择。

因核酸提取过程对仪器设备有较高要求，目前针对淋病奈瑟菌核酸进行检测的产品多针对实验室使用场景，还没有一款从取样到检测完全可居家完成的淋病奈瑟菌检测产品。

发明内容

本发明的目的在于提出一种检测淋病奈瑟菌的居家自检试剂盒，具有高灵敏度、高特异性、高准确度、操作方法简单，用于淋病奈瑟菌的居家快速自检。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种检测淋病奈瑟菌的居家自检试剂盒，包括淋病奈瑟菌等温扩增引物对、淋病奈瑟菌扩增子特异性CrRNA、关键酶、样本保存液、含有特殊标记的单链DNA作为信号放大体系、特殊抗体包被的侧流试纸条、阳性和阴性对照品。

作为本发明的进一步改进，所述淋病奈瑟菌等温扩增引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQID NO2所示。

作为本发明的进一步改进，所述引物对的浓度分别为1-10μM，优选地，为5μM。

作为本发明的进一步改进，所述淋病奈瑟菌扩增子特异性CrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。

作为本发明的进一步改进，所述淋病奈瑟菌扩增子特异性CrRNA的浓度为1-5μM，优选地，为2μM。

作为本发明的进一步改进，所述关键酶包括DNA重组酶、单链结合蛋白、Bst DNA聚合酶，所述关键酶的三种组分以0.5-1.5:0.5-1.5:0.5-1.5的比例与所述淋病奈瑟菌等温扩增引物对制备成冻干粉。

作为本发明的进一步改进，所述样本保存液包含：5-50mM pH值为7.0-9.0的Tris-HCl溶液、10-30mM KCl、1-10mM MgCl

作为本发明的进一步改进，所述含有特殊标记的单链DNA作为信号放大体系包含Cas12a酶及crRNA，两者制备成冻干粉，其中，含有特殊标记的单链DNA的核苷酸序列如SEQID NO.4所示，含有特殊标记的单链DNA的5’端标记FAM基团，3’端标记Biotin。

作为本发明的进一步改进，所述特殊抗体包被的侧流试纸条含有anti-Biotin、anti-FAM两条标记线。

作为本发明的进一步改进，所述阳性和阴性对照品中，阳性对照品为含有淋病奈瑟菌fumC基因区域特异性靶标DNA片段的质粒溶液；所述质粒溶液浓度为10

本发明具有如下有益效果：

样本保存液为自研产品，实现了样本直接裂解且保存液可直接用于后续的等温扩增。市面上现有的基于等温扩增的淋病奈瑟菌检测试剂盒均面向实验室，样本裂解后需进行复杂的核酸纯化过程，不能用于直接扩增。该样本保存液解决了这个问题。

在淋病奈瑟菌检测体系中创造性地引入信号放大系统。与常规检测体系相比，该放大系统可有效提升体系的最低检测能力。

创造性地将侧流试纸条引入淋病奈瑟菌的检测体系中，并对试纸条的生产工艺及结构进行了相应改进，提升了试纸条的检测灵敏度及特异度。

本试剂盒涉及的其他原材料均来源于第三方供应商，在对其性能进行充分验证、比对的基础上选择最适合本试剂盒的材料。

本发明试剂盒将是第一款真正意义上的“自采样-淋病奈瑟菌DNA检测”全流程居家自检的检测试剂盒。

(1)流程简单，检测时间短，整个过程不超过2小时。

(2)样本无需进入实验室检测，保护了患者的隐私，可以进一步提高人民群众的性病防治意识和参与程度。

(3)试剂盒在-20度保持1年有效。

(4)与临床使用的淋病奈瑟菌检测试剂相比，其准确性高于95％。

(5)最低检测限可达到10copies/反应。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为试纸条结构示意图；

图2为淋病奈瑟菌检测试剂盒最低检测限测试。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种检测淋病奈瑟菌的居家自检试剂盒，包括淋病奈瑟菌等温扩增引物对、淋病奈瑟菌扩增子特异性CrRNA、关键酶、样本保存液、含有特殊标记的单链DNA作为信号放大体系、特殊抗体包被的侧流试纸条、阳性和阴性对照品。

所述淋病奈瑟菌等温扩增引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。

所述引物对的浓度分别为1μM。

所述淋病奈瑟菌扩增子特异性CrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。

所述淋病奈瑟菌扩增子特异性CrRNA的浓度为1μM。

所述关键酶包括DNA重组酶、单链结合蛋白、Bst DNA聚合酶，所述关键酶的三种组分以1:1:1的比例与所述淋病奈瑟菌等温扩增引物对制备成冻干粉。

所述样本保存液包含：5mM pH值为7.0的Tris-HCl溶液、10mM KCl、1mM MgCl

所述含有特殊标记的单链DNA作为信号放大体系包含Cas12a酶及crRNA，两者制备成冻干粉，其中，含有特殊标记的单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，含有特殊标记的单链DNA的5’端标记FAM基团，3’端标记Biotin。

所述特殊抗体包被的侧流试纸条含有anti-Biotin、anti-FAM两条标记线。

所述阳性和阴性对照品中，阳性对照品为含有淋病奈瑟菌fumC基因区域特异性靶标DNA片段的质粒溶液；所述质粒溶液浓度为10

图1为试纸条结构示意图，标注了结合区、判读区及手持区，以及用于结果判读的C线(质控线)、T线。

实施例2

本实施例提供一种检测淋病奈瑟菌的居家自检试剂盒，包括淋病奈瑟菌等温扩增引物对、淋病奈瑟菌扩增子特异性CrRNA、关键酶、样本保存液、含有特殊标记的单链DNA作为信号放大体系、特殊抗体包被的侧流试纸条、阳性和阴性对照品。

所述淋病奈瑟菌等温扩增引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。

所述引物对的浓度分别为10μM。

所述淋病奈瑟菌扩增子特异性CrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。

所述淋病奈瑟菌扩增子特异性CrRNA的浓度为5μM。

所述关键酶包括DNA重组酶、单链结合蛋白、Bst DNA聚合酶，所述关键酶的三种组分以1:1:1的比例与所述淋病奈瑟菌等温扩增引物对制备成冻干粉。

所述样本保存液包含：50mM pH值为9.0的Tris-HCl溶液、30mM KCl、10mM MgCl

所述含有特殊标记的单链DNA作为信号放大体系包含Cas12a酶及crRNA，两者制备成冻干粉，其中，含有特殊标记的单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，含有特殊标记的单链DNA的5’端标记FAM基团，3’端标记Biotin。

所述特殊抗体包被的侧流试纸条含有anti-Biotin、anti-FAM两条标记线。

所述阳性和阴性对照品中，阳性对照品为含有淋病奈瑟菌fumC基因区域特异性靶标DNA片段的质粒溶液；所述质粒溶液浓度为10

实施例3

本实施例提供一种检测淋病奈瑟菌的居家自检试剂盒，包括淋病奈瑟菌等温扩增引物对、淋病奈瑟菌扩增子特异性CrRNA、关键酶、样本保存液、含有特殊标记的单链DNA作为信号放大体系、特殊抗体包被的侧流试纸条、阳性和阴性对照品。

所述淋病奈瑟菌等温扩增引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。

所述引物对的浓度分别为5μM。

所述淋病奈瑟菌扩增子特异性CrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。

所述淋病奈瑟菌扩增子特异性CrRNA的浓度为2μM。

所述关键酶包括DNA重组酶、单链结合蛋白、Bst DNA聚合酶，所述关键酶的三种组分以1:1:1的比例与所述淋病奈瑟菌等温扩增引物对制备成冻干粉。

所述样本保存液包含：30mM pH值为8.0的Tris-HCl溶液、10-30mM KCl、2mMMgCl

所述含有特殊标记的单链DNA作为信号放大体系包含Cas12a酶及crRNA，两者制备成冻干粉，其中，含有特殊标记的单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，含有特殊标记的单链DNA的5’端标记FAM基团，3’端标记Biotin。

所述特殊抗体包被的侧流试纸条含有anti-Biotin、anti-FAM两条标记线。

所述阳性和阴性对照品中，阳性对照品为含有淋病奈瑟菌fumC基因区域特异性靶标DNA片段的质粒溶液；所述质粒溶液浓度为10

实施例4 本试剂盒淋病奈瑟菌检试剂盒的检测流程

(1)自采样：按照说明将采样刷送入阴道，旋转10-30s取样。

(2)核酸快速提取：将刷头浸入含500uL样品保存液的样品保存管，将细胞涮入样品保存液。上下颠倒保存液管5次，使样本裂解。

(3)等温扩增：取50ul上述样本保存液复溶反应干粉，在39℃反应30min。。

(4)Crispr-cas12a反应：将等温扩增产物置于Cas12a-crRNA干粉，混匀后37℃反应15min，65℃，15min终止反应。

(5)信号检测：RPA反应结束后，打开PCR反应管，将试纸条结合垫端插入PCR反应管，液面不得超过结合垫最上端，待判读区全部浸润,待质控线(C线)显色后，可以将试纸条拿出。根据试纸条显色情况直接读取检测结果。有T线出现即为阳性结果；有C线，同时无T线，则为阴性结果。

实施例5 特异性实验

(1)收集200例临床样本，以仁度生物淋病奈瑟菌检测试剂盒及本试剂盒分别按相应的检测流程同时进行检测。

(2)数据显示两试剂盒的一致性(阳性及阴性一致性)为97％.

(3)不一致样本选用第三方试剂盒进行复核，检测结果均与本试剂盒一致。

实施例6 最低检测限实验

在50ul保存液体系中投入阳性质粒：E4、E3、E2、E1、1copies。

按试剂盒检测流程进行全流程检测过程；

图2为淋病奈瑟菌阳性质粒最低检测限的测试结果，横坐标表示每个反应中所投入的阳性质粒的数量。结果显示10copies/反应可检出。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。