基于核酸适配体技术检测赭曲酶毒素的方法

技术领域

本发明涉及一种基于核酸适配体技术检测赭曲酶毒素的方法，用于检测赭曲酶毒素，属于分析化学技术领域和食品安全技术领域。

背景技术

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是由多种曲霉属和青霉属真菌产生的一种次级代谢产物，OTA通过污染粮谷类农作物，人和动物进食被OTA污染的食物后，会导致体内OTA的蓄积，OTA主要危及人和动物肾脏，具有高度致癌、致畸、致突变的作用，并被认为与人类的巴尔干肾病和泌尿系统肿瘤有关。国际癌症研究机构已将其定位2B类致癌物。随着人们生活质量水平的提高，对食品安全的要求也越来越严格，而且我国也规定了其在谷物等粮食及制品中OTA的最高残留量，故它的检测限问题也越来越受到人们的重视，成为研究的热点。

目前，赭曲霉毒素的检测方法分为高效液相色谱法、时间分辨荧光法、电化学法等。上述方法虽然结果较为准确，但高效液相色谱法需要大型仪器设备，花费高，且操作复杂，耗时，特异性、灵敏度欠佳，所以一般都很难用于现场快速检测，基于此亟需开发一种新型的检测方法。

核酸适配体是通过指数富集技术得到的对靶目标有特异性亲和力的短链DNA或RNA序列，可以选择性地绑定到目标物如药物、蛋白质和小分子等，具有较高的特异性结合力。它是采用指数富集的配体系统进化技术从体外人工合成的单链核酸文库中筛选出与靶物质高特异性﹑高亲和力结合的寡核苷酸片段,其特定的三维结构可与靶标高特异性、高亲和力结合，与抗体相比,适配体具有生产方便、成本低﹑热稳定好﹑易化学合成、易与多种官能团修饰、高亲和合力和高特异性等优点,在食品安全检测、环境污染物监测以及临床诊断方面得到广泛的关注。目前基于适配体技术的均相检测方法有比色法、荧光法、电化学等。基于适配体的信号放大主要是核酸酶信号放大技术，包括限制性核酸内切酶,核酸外切酶和核酸酶等。

因此筛选高亲和力的适配体是开发高灵敏特异的霉菌毒素检测技术的关键。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于核酸适配体技术检测赭曲酶霉素的方法，实现赭曲霉毒素的简单、快速、高灵敏检测。

为解决上述技术问题，本发明基于核酸适配体技术检测赭曲酶霉素的方法，包括以下步骤：

(1)设计与合成相应的寡核苷酸片段：

设计一段能够对OTA特异性识别的DNA片段及其互补DNA片段，根据此序列来设计实时荧光定量PCR用的上下游引物；

模板DNA：5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTCCCCGTGGCGATGTTTCTTAGCGCCGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAG CATCGGACA-3’

互补DNA：5’-TGTCCGATGCTCCCTTTACGCCACCCACACCCGATCGGCGCTAAGAAACATCGCCACGGGGAAGGCGTACTCGC G-3’

上游引物：5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTC-3’

下游引物：5’-GTAAGGCGCTAAGAAACATCG-3’。

(2)核酸外切酶Ⅲ对DNA的剪切：

把模板DNA与互补DNA在pH为7.4的Tris-HCL缓冲液中混合混匀，二者浓度均为0.1nM，加入检测样品，然后混合液在恒温金属浴中37℃下处理30min，在核酸适配体的作用下，部分未与OTA反应的模板DNA与互补DNA通过核酸适配体特异性结合作用形成3'端闭合的双链DNA。加入适量的核酸外切酶Ⅲ后反应90s，核酸外切酶Ⅲ把与互补DNA互补配对的模板DNA沿着3'→5'的方向逐步切去单核苷酸片段切断；随后整个体系在恒温金属浴中98℃反应10min，让核酸外切酶Ⅲ失活，结束核酸外切酶Ⅲ对模板DNA的剪切。

(3)OTA浓度测定：

加入PCR混合液10μL、上下游引物各2μL、水6μL，做实时荧光定量PCR，测定检测样品OTA浓度下扩增曲线，根据线性方程确定OTA浓度，线性方程为y＝5.75+1.08lgC，C代表OTA浓度，其中一元线性回归判定系数R

所述线性方程通过以下方法建立：将模板DNA与互补DNA在pH为7.4的Tris-HCL缓冲液中混合混匀，二者浓度均为0.1nM，然后再依次加入OTA标准液,使其最终浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、50、100nM；在恒温金属浴中37℃下处理30min，加入适量的核酸外切酶Ⅲ反应90s，将模板DNA被逐步切掉；在恒温金属浴中98℃反应10min，让核酸外切酶Ⅲ失活，结束对模板DNA的剪切；最后依次加入PCR混合液10μL、上下游引物各2μL、水6μL，做实时荧光定量PCR；利用实时荧光定量PCR仪测定不同OTA浓度下扩增曲线曲线，通过扩增曲线图得到OTA浓度与Ct值的关系图，绘制OTA浓度的标准曲线，标准曲线的线性方程为y＝5.75+1.08lgC。

OTA适配体特异性测定方法：取5个PCR管，将模板DNA与互补DNA在pH为7.4的Tris-HCL缓冲液中混合混匀，二者浓度均为0.1nM，分装在不同的PCR管中，然后在PCR管中分别加入10ng/mL OTA、AFB

本发明反应中加入外切酶的作用，使反应的步骤简单很多步，没有核酸的生物素化，PCR管子的亲和素包裹等多个过程，相对于非均相反应，本发明属于均相反应。本发明主要两个步骤就可以实现：第一步，核酸和汞离子反应；第二步，继续和外切酶反应，然后就可以实现信号的检测了。没有了核酸的生物素化，PCR管子的亲和素包裹等以及多个过程。由于检测步骤的减少，特别是减少了本来每个反应步骤后的洗涤过程，洗涤过程会影响检测的效果，本专利连洗涤的过程也不需要的，故检测中的损失几乎没有。

本发明方法实现赭曲酶毒素的简单、快速、高灵敏检测，满足现实生活中对OTA的检测需求。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为通过扩增曲线图得到OTA浓度与Ct值的关系图。

具体实施方式

(1)设计与合成相应的寡核苷酸片段。

设计一段能够对OTA特异性识别的DNA片段及其互补DNA片段，根据此序列来设计实时荧光定量PCR用的上下游引物，序列通过DNA合成仪制备。

模板DNA：5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTCCCCGTGGCGATGTTTCTTAGCGCCGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAG CATCGGACA-3’

互补DNA：5’-TGTCCGATGCTCCCTTTACGCCACCCACACCCGATCGGCGCTAAGAAACATCGCCACGGGGAAGGCGTACTCGC G-3’

上游引物：5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTC-3’

下游引物：5’-GTAAGGCGCTAAGAAACATCG-3’

(2)核酸外切酶Ⅲ对DNA的剪切。

首先把模板DNA与互补DNA在pH为7.4的Tris-HCL缓冲液中混合混匀，二者浓度均为0.1nM，加入检测样品(OTA溶液)形成混合液，然后混合液在恒温金属浴中37℃下处理30min，在核酸适配体的作用下，部分未与OTA反应的模板DNA与互补DNA通过核酸适配体特异性结合作用形成3'端闭合的双链DNA。加入适量的核酸外切酶Ⅲ后反应90s，核酸外切酶Ⅲ把与互补DNA互补配对的模板DNA沿着3'→5'的方向逐步切去单核苷酸片段切断。随后整个体系在恒温金属浴中98℃反应10min，让核酸外切酶Ⅲ失活，结束核酸外切酶Ⅲ对模板DNA的剪切。

(3)核酸适配体杂交反应及标准曲线的建立。

核酸适配体杂交反应：将模板DNA与互补DNA在pH为7.4的Tris-HCL缓冲液中混合混匀，二者浓度均为0.1nM，然后再依次加入OTA标准液,使其最终浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、50、100nM。在恒温金属浴中37℃下处理30min，加入适量的核酸外切酶Ⅲ反应90s，将模板DNA被逐步切掉。在恒温金属浴中98℃反应10min，让核酸外切酶Ⅲ失活，结束对模板DNA的剪切。最后依次向PCR管中加入PCR混合液10μL、上下游引物各2μL、水6μL，做实时荧光定量PCR。OTA标准曲线的建立：利用实时荧光定量PCR仪测定不同OTA浓度下扩增曲线曲线，通过扩增曲线图得到OTA浓度与Ct值的关系图，如图1所示，绘制OTA浓度的标准曲线，标准曲线的线性方程为y＝5.75+1.08lgC，C代表OTA的浓度，其中R

(4)OTA适配体的特异性测定。

取5个PCR管，将模板DNA与互补DNA在pH为7.4的Tris-HCL缓冲液中混合混匀，二者浓度均为0.1nM，分装在不同的PCR管中，然后在PCR管中分别加入10ng/mL OTA、AFB

(5)实际添加样品的测定。

向自来水样品中分别添加0.1、1、5、10nM的OTA，获得不同浓度OTA的自来水样品，针对不同的自来水样品分别进行如下操作：将模板DNA与互补DNA在pH为7.4的Tris-HCL缓冲液中混合混匀，二者浓度均为0.1nM，分装在不同的PCR管中，然后在PCR管中分别加入上述自来水样品，在37℃反应30分钟，加入适量的核酸外切酶Ⅲ后反应90s，随后整个体系在恒温金属浴中98℃反应10min，让核酸外切酶Ⅲ失活，结束核酸外切酶Ⅲ对模板DNA的剪切；最后向PCR管中加入PCR混合液10μL、上下游引物各2μL、水6μL，做实时荧光定量PCR。测定结果如下表1所示：

表1自来水样品添加OTA的测定结

由表1可知，采用基于核酸适配体技术检测赭曲霉毒素OTA的方法测定实际样本中的OTA的添加回收率在95％-106.2％之间，标准差小于4.71％，能够完全满足现实生活中对OTA的检测需求。

上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。