一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白及其制备方法和应用

文献发布时间：2023-06-19 19:28:50

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

蛋白质是人体生命活动的主要承担者，是人体组织的重要组成部分，也是人体组织代谢更新和修补的主要原料，蛋白质在人体内的作用还包括运输物质、参与机体免疫、提供能量及调节激素等等。其中，胶原蛋白是人体内最丰富的蛋白质，约占体内蛋白质总量的25-33％。据统计，胶原蛋白约占人体重量的5％，约占皮肤重量的75％，占皮肤总体积的90％，而在结缔组织中胶原蛋白约占80％，可以说胶原蛋白存在于人体大部分组织，其功能是维持皮肤和组织器官的形态和结构，对于人体正常机能发挥具有不可或缺的作用。

胶原蛋白是一种细胞外蛋白质，由3条肽链拧成螺旋形的纤维状蛋白质。胶原蛋白中存在G-X-Y的重复序列，也叫胶原域，X和Y可以是Gly之外的任何氨基酸，其中，X常是脯氨酸，Y常是羟脯氨酸。羟脯氨酸残基可通过形成分子内氢键稳定胶原蛋白分子。三条α-肽链借范德化力、氢键及共价交联，以平行、右手螺旋形式缠绕成“草绳状”三股螺旋结构，因此具有很高的拉伸强度。

胶原蛋白作为人体最丰富的蛋白质之一，通过在细胞结构上形成支撑网来确保身体组织的稳定性和强度。随着时间的推移，纤维会被破坏，作为众多影响之一它会使皮肤生成不期望的皱纹。经过研究，已证实当受试者摄入胶原蛋白后，受损的纤维可以被新的纤维替代，因此胶原蛋白有助于恢复和改善组织结构。有文章证实，胶原蛋白已显示出抗氧化活性、降压活性、降脂活性以及对受损皮肤的修复活性。此外，胶原蛋白的这种性质在皮肤中具有双重作用：首先为弹性纤维和胶原纤维的形成提供基本要素，其次作为成纤维细胞的配体或结合受体刺激先前提到的成分和透明质酸。

与传统胶原蛋白的提取方法相比，重组人源胶原蛋白为基因工程构建的产物，人源蛋白避免了免疫排斥反应，极高地提高了生物相容性和生物安全性，缺少了动物来源的病原体微生物污染，在生产过程中也避免了强酸强碱高温等剧烈手段，既减少了生产过程中对环境的污染程度，更温和的生产方式也极大地保证了胶原蛋白的活性。

芋螺肽，也称精氨酸/赖氨酸多肽，是芋螺通过毒管分泌的一类特殊多肽类毒液，主要用于捕食和防御，目前已知的芋螺肽有2000多种，这些小肽类毒素一般由10-46个氨基酸组成，富含二硫键，具有特殊的结构，可以特异地作用于受体或离子通道，从而麻痹肌肉，并让肌肉松弛，在较短时间内帮助舒缓皱纹，并且保留肌肉5％神经肌肉电流传导，所以可以提供非常自然的去皱效果。

但芋螺肽的缺点是较为昂贵，因此如何在不影响功效的前提下降低芋螺肽的用量成为了一个课题。以下为几篇专利中芋螺肽的用量：《一种具有祛皱功效的化妆品组合物、面膜及制备方法》公开了一种含芋螺肽的组合物，其最优选的组合物中的芋螺肽含量为0.8％。《一种含胜肽的组合物及其应用》公开了一种含芋螺肽的组合物，其最优选的组合物中的芋螺肽含量为6％。《兼具即时和长效的多功效眼膜的配方及其制备方法》中的芋螺肽的含量范围为1％-5％。本发明将采用新技术使芋螺肽的使用量进一步降低。

多肽的合成主要有生物合成法和化学合成法，其中化学合成法广泛应用于数量较短(氨基酸数目≤10)的短肽合成。尽管化学合成法工艺成熟、易于工业化，但对于较长(氨基酸数目大于10)的多肽，化学合成法也面临着生产成本急剧上升的缺点，这种长肽往往很难在工业中大量生产。因此，提供一种成本低廉、能大规模生产的制备方法，以及生物活性高、同时具有即时抗皱和长效修复的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白具有重要的应用价值。

发明内容

本发明提供了一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白及其制备方法和应用。所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白(SEQ ID NO.1)为胶原蛋白片段(SEQ ID NO.2)与芋螺肽片段(SEQ IDNO.3)的氨基酸序列偶联后得到的产物。

针对现有技术存在的不足，本发明的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白(YLT-ColI)，为胶原蛋白片段与芋螺肽片段的氨基酸序列偶联后得到的产物，同时兼具胶原蛋白和芋螺肽的生物活性功能，并且可以广泛应用到药品和化妆品中。同时，本发明提供一种具有即时抗皱和长效修复的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法和组合物。

图2为使用本发明提供的组合物的皮肤抗皱测试的示例图，可见，使用了具有即时抗皱和长效修复效果的组合物后皱纹的面积占比减少，肌肤变得平滑，具有立竿见影的抗皱效果。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白从N端至C端包括依次连接的胶原蛋白片段和芋螺肽片段；

所述胶原蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述芋螺肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白兼具胶原蛋白和芋螺肽的优点，并且在短期去皱和长效修复上拥有更好的效果。

优选地，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白还包括HIS标签片段。

优选地，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

SEQ ID NO.1(胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列)：

EAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKG AAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGGGGGSCCRAHDRCW KSSCGKPGNCCGE。

SEQ ID NO.2(胶原蛋白片段的氨基酸序列)：

EAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKG AAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGER。

SEQ ID NO.3(芋螺肽片段的氨基酸序列)：

CCRAHDRCWKSSCGKPGNCCGE。

第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白。

优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO.4：

gaagctggtctgccgggtgctaaaggtctgaccggttctccgggttctccgggtccggacggtaaaaccggtccgccgggtccggctggtcaggacggtcgtccgggtccgccgggtccgccgggtgctcgtggtcaggctggtgttatgggtttcccgggtccgaaaggtgctgctggtgaaccgggtaaagctggtgaacgtggtgttccgggtccgccgggtgctgttggtccggctggtaaagacggtgaagctggtgctcagggtccgccgggtccggctggtccggctggtgaacgtggtggtggtggtggttcttgctgccgtgctcacgaccgatgctggaaatcttcttgcggtaaaccgggtaactgctgcggtgaataa。

第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的第二方面所述的核酸分子。

第四方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞表达第一方面所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白。

优选地，所述重组细胞的基因组中整合有第二方面所述的核酸分子；

优选地，所述重组细胞中含有第三方面所述的表达载体。

第五方面，本发明提供一种第一方面所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：构建含有编码第一方面所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的核酸分子的表达载体，将所述表达载体转入受体细胞中，筛选含有表达载体的阳性菌株；培养所述含有表达载体的阳性菌株，诱导表达，破碎菌体，并进行纯化，得到所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白。

本发明利用基因重组的方法，将胶原蛋白片段与芋螺肽片段的序列进行串联，经大肠杆菌宿主表达和纯化后，所得产物可以广泛应用在药品和化妆品行业。本发明中所述的制备方法适用于胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的生产，本方法可以有效降低融合蛋白的生产成本，提高生产效率，也给融合蛋白的生产方式提供了另外一种生物学途径。

本发明的制备方法表达的目的产物在大肠杆菌中常以可溶的形式存在，产量高，且产物经纯化后不需经过酶切步骤；产物同时兼具胶原蛋白功能和芋螺肽功能，而且在功能上弥补了胶原蛋白短时去皱效果不明显以及芋螺肽不具备长效修复功能的缺陷。

优选地，所述受体细胞包括大肠杆菌，所述受体细胞包括大肠杆菌，所述大肠杆菌包括DH5α、BL21(DE3)或BL21 STAR(DE3)。

采用本发明的制备方法培养所述含有表达载体的阳性菌株，诱导表达，破碎菌体，并进行纯化，就得到所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白。

优选地，所述诱导表达的方法包括IPTG诱导；

优选地，所述诱导表达的温度为36-38℃(例如可以是36℃、36.5℃、37℃、37.5℃或38℃等)。

本发明中所述诱导表达的转速为120-320rpm(例如可以是120rpm、140rpm、160rpm、180rpm、200rpm、220rpm、240rpm、260rpm、280rpm、300rpm、或320rpm等)，待生长OD长至0.6-0.8区间时，加入IPTG溶液对产物进行诱导，诱导表达的时间为4-6h(例如可以是4h、4.5h、5h、5.5h或6h等)。

本发明中所述IPTG诱导采用的IPTG的终浓度为0.5-1.5mM，例如可以是0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM或1.5mM等。

优选地，所述破碎菌体采用如下步骤进行：用破菌缓冲液将菌体重悬，进行高压均质，直至菌液澄清透明，将菌液离心，取上清液并过滤。

优选地，所述破菌缓冲液按摩尔浓度计包括：10-50mM PB、100-300mM NaCl，溶剂为水。

本发明中所述破菌缓冲液中PB的浓度为10-50mM，例如可以是10mM、20mM、30mM、40mM或50mM等；所述NaCl的浓度为100-300mM，例如可以是100mM、120mM、140mM、160mM、180mM、200mM、220mM、240mM、260mM、280mM或300mM等。

本发明中所述破菌缓冲液与菌体的体积比为(1-50):1，例如可以是1:1、5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1或50:1等。

本发明中所述高压均质的压力为600-1000bar，例如可以是600bar、700bar、800bar、900bar或1000bar等。

本发明中所述离心的转速为12000-16000rpm，例如可以是12000rpm、13000rpm、14000rpm、15000rpm或16000rpm等，所述离心的时间为40-60min，例如可以是40min、45min、50min、55min或60min等。

优选地，所述纯化的方法包括镍离子柱亲和层析。

优选地，所述镍离子柱亲和层析包括如下步骤：将过滤的菌液上清经镍离子柱吸附后，依次使用咪唑浓度递增的镍离子柱亲和层析预洗脱缓冲液进行一次洗杂和二次洗杂，再用咪唑浓度递增的洗脱缓冲液进行一次洗脱和二次洗脱。

优选地，所述一次洗杂采用的预洗脱缓冲液中咪唑浓度为40-60mM，例如可以是40mM、45mM、50mM、55mM或60mM等。

本发明中所述一次洗杂采用的预洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括：10-50mM PB(例如可以是10mM、20mM、30mM、40mM或50mM等)；100-300mM NaCl(例如可以是100mM、120mM、140mM、160mM、180mM、200mM、220mM、240mM、260mM、280mM或300mM等)；40-60mM咪唑(例如可以是40mM、45mM、50mM、55mM或60mM等)；溶剂为水。

优选地，所述二次洗杂采用的预洗脱缓冲液中咪唑浓度为90-110mM，例如可以是90mM、95mM、100mM、105mM或110mM等。

本发明中所述二次洗杂采用的预洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括：10-50mM PB(例如可以是10mM、20mM、30mM、40mM或50mM等)；100-300mM NaCl(例如可以是100mM、120mM、140mM、160mM、180mM、200mM、220mM、240mM、260mM、280mM或300mM等)；90-110mM咪唑(例如可以是90mM、95mM、100mM、105mM或110mM等)；溶剂为水。

优选地，所述一次洗脱采用的洗脱缓冲液中咪唑浓度为150-250mM，例如可以是150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM、210mM、220mM、230mM、240mM或250mM等。

本发明中所述一次洗脱采用的洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括：10-50mM PB(例如可以是10mM、20mM、30mM、40mM或50mM等)；100-300mM NaCl(例如可以是100mM、120mM、140mM、160mM、180mM、200mM、220mM、240mM、260mM、280mM或300mM等)；150-250mM咪唑(例如可以是150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM、210mM、220mM、230mM、240mM或250mM等)；溶剂为水。

优选地，所述二次洗脱采用的洗脱缓冲液中咪唑浓度为450-550mM，例如可以是450mM、460mM、470mM、480mM、490mM、500mM、510mM、520mM、530mM、540mM或550mM等。

本发明中所述二次洗脱采用的洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括：10-50mM PB(例如可以是10mM、20mM、30mM、40mM或50mM等)；100-300mM NaCl(例如可以是100mM、120mM、140mM、160mM、180mM、200mM、220mM、240mM、260mM、280mM或300mM等)；450-550mM咪唑(例如可以是450mM、460mM、470mM、480mM、490mM、500mM、510mM、520mM、530mM、540mM或550mM等)；溶剂为水。

优选地，所述纯化后还包括采用G25凝胶柱进行脱盐的步骤。

作为本发明的优选技术方案，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将编码所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的核酸分子连入质粒载体中，构建表达载体，将所述表达载体转入大肠杆菌中，筛选含有表达载体的阳性菌株，得到大肠杆菌基因工程菌株；

(2)发酵培养所述大肠杆菌基因工程菌株，采用IPTG诱导蛋白表达后，离心收集菌体，所述诱导表达的温度为36-38℃；

(3)将破菌缓冲液与菌体重悬，所述破菌缓冲液包括：10-50mM PB、100-300mMNaCl，溶剂为水；进行高压均质，直至菌液澄清透明，将菌液离心，取上清液并过滤；

(4)将过滤的菌液上清经镍离子柱吸附后，依次使用咪唑浓度递增的镍离子柱亲和层析预洗脱缓冲液进行一次洗杂和二次洗杂；一次洗杂采用的预洗脱缓冲液中咪唑浓度为40-60mM咪唑；二次洗杂采用的预洗脱缓冲液中咪唑浓度为90-110mM咪唑；再用咪唑浓度递增的洗脱缓冲液进行一次洗脱和二次洗脱；一次洗脱采用的洗脱缓冲液中咪唑浓度为150-250mM咪唑；二次洗脱采用的洗脱缓冲液中咪唑浓度为450-550mM咪唑；纯化后采用G25凝胶柱进行脱盐，得到所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白。

第六方面，本发明提供一种具有即时抗皱和长效修复效果的组合物，所述组合物含有第一方面所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白。

优选地，所述组合物按重量份数计包括：胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白0.01-1份、肌肽0.01-1份、苯氧乙醇0.01-1份、乙基己基甘油0.01-0.1份、甘油2-10份、甜菜碱0.3-3份和水80-100份。

本发明中所述组合物中胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的重量份数为0.01-1份，例如可以是0.01份、0.02份、0.04份、0.06份、0.08份、0.1份、0.2份、0.4份、0.6份、0.8份或1份等；肌肽的重量份数为0.01-1份，0.01份、0.02份、0.04份、0.06份、0.08份、0.1份、0.2份、0.4份、0.6份、0.8份或1份等；苯氧乙醇的重量份数为0.01-1份，例如可以是0.01份、0.05份、0.1份、0.15份、0.2份、0.3份、0.4份、0.5份、0.6份、0.7份、0.8份、0.9份或1份等；乙基己基甘油的重量份数为0.01-0.1份，例如可以是0.01份、0.02份、0.03份、0.04份、0.05份、0.06份、0.07份、0.08份、0.09份或0.1份等；甘油的重量份数为2-10份，例如可以是2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份或10份等；甜菜碱的重量份数为0.3-3份，0.3份、0.5份、0.8份、1份、1.3份、1.5份、1.8份、2份、2.3份、2.5份或3份等；水的重量份数为80-100份，例如可以是80份、82份、85份、88份、90份、92份、95份、98份或100份等。

本发明所述具有即时抗皱和长效修复效果的组合物中，胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白在功能上弥补了重组胶原蛋白短时去皱效果不明显以及芋螺肽不具备长效修复功能的缺陷。其中胶原蛋白可以通过整合素促进细胞黏附、增殖；芋螺肽可以通过阻断神经肌肉的电流传导进而淡化皱纹，特别是针对肌肉的NAV1.4通道，以达到去皱的效果。肌肽作为抗氧化剂，可以避免胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白被氧化；同时肌肽有很好的抗糖化、抗衰的效果，可以促进皮肤胶原蛋白的合成，和胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白起到协同增效的作用。苯氧乙醇作为防腐剂，可以抑制微生物生长，有效减少微生物对蛋白的降解，保证体系的长期稳定性，进而有助于提高对蛋白的保存效果。乙基己基甘油和甘油均作为体系增稠剂，增加体系粘度，保持体系稳定，可以在被保存的蛋白质的周边起保护作用，减少蛋白降解的可能性，从而防止胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的析出；甜菜碱作为保湿剂，可以在皮肤表面保持润湿，形成一层水化膜，协同胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白和肌肽被皮肤吸收。

第七方面，本发明提供第一方面所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白和/或第六方面所述的具有即时抗皱和长效修复效果的组合物在在药品和化妆品中的应用。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)对于胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，本方法可以有效降低融合蛋白的生产成本，提高生产效率，也给融合蛋白的生产方式提供了另外一种生物学途径。

(2)本发明所述制备方法表达的目的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶的形式存在，产量高，产物经纯化后不需经过酶切步骤，产物同时兼具胶原蛋白功能和芋螺肽功能，而且在功能上弥补了重组胶原蛋白短时去皱效果不明显以及芋螺肽不具备长效修复功能的缺陷。

(3)本发明所述具有即时抗皱和长效修复效果的组合物，其中的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白可以通过整合素促进细胞黏附、增殖，芋螺肽片段可以通过阻断神经肌肉的电流传导进而淡化皱纹，特别是针对肌肉的NAV1.4通道，以达到去皱的效果。肌肽作为抗氧化剂，可以避免胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白被氧化，同时肌肽有很强的抗糖化、抗衰的效果，可以促进皮肤胶原蛋白的合成，和胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白起到协同增效的作用。

(4)本发明所述的具有即时抗皱和长效修复效果的组合物，其中与芋螺肽融合的胶原蛋白为人源胶原蛋白。因人源胶原蛋白与人体的相容性更好，使得含有芋螺肽片段的融合蛋白更容易被人体吸收，降低了芋螺肽的最低起效量，因此可以使用更少的芋螺肽以达到相同的功效。

附图说明：

图1是实施例1中胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白SDS-PAGE凝胶电泳结果(图1中框线内为目的蛋白及其对应的蛋白分子量标准)。

图2为应用例1中组合物的皮肤抗皱测试的示例图。

具体实施方式：

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道获得的常规产品。

本发明中的实施例、对比例、应用例和对比应用例中所用到的实验材料的来源如表1所示：

表1

实施例1

本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)宿主菌构建

将胶原蛋白片段和芋螺肽片段的序列按1:1的方式进行串联，串联后的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，N端加上6×HIS标签，氨基酸序列经大肠杆菌密码子优化后构建至pET28a载体上，构建好的载体导入大肠杆菌宿主BL21 STAR(DE3)细胞中。

(2)菌株表达

挑取单个重组大肠杆菌的克隆，转接到50mL LB培养基，加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素，在37℃、220rpm条件下过夜培养。第二天，从种子液中吸取菌液，按1:100的比例接种到新鲜LB培养基中，在37℃、220rpm条件下培养，待生长OD长至0.6-0.8区间时，加入终浓度为1mM的IPTG溶液对产物进行诱导，诱导处理的温度为37℃，诱导处理的转速为220rpm，大肠杆菌诱导表达5h后离心收取菌体。

(3)菌体破碎

取适量菌体，按体积比10:1将破菌缓冲液与菌体重悬，所述破菌缓冲液为20mM PB+200mM NaCl、pH 7.4的水溶液，使用高压均质机在800bar条件下将菌体破碎三次，直至菌液澄清透明，在镜检下可观察到菌体被破碎完毕；将菌液在14000rpm条件下离心50min，收取上清液体作为菌体破碎上清液，并用0.45μm滤膜对菌液进行过滤。

(4)纯化

菌液上清经镍离子柱(NI柱)吸附后，依次用20mM PB+200mM NaCl+50mM咪唑，pH7.4的水溶液和20mM PB+200mM NaCl+100mM咪唑，pH 7.4的水溶液进行洗杂，再用20mM PB+200mM NaCl+200mM咪唑，pH 7.4的水溶液和20mM PB+200mM NaCl+500mM咪唑，pH 7.4的水溶液进行洗脱。洗脱液进一步用G25凝胶柱进行脱盐，得到胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

(5)蛋白的鉴定和保存

取适量蛋白液进行SDS-PAGE检测，用灰度扫描法判断YLT-ColI蛋白(胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白)占整个泳道的比例即为纯度。胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白凝胶电泳结果如图1所示：泳道M：蛋白分子量标志物，上样量5μL；泳道1：上样混合液，上样量10μL；泳道2：流穿液，上样量10μL；泳道3：洗脱液1(一次洗杂的洗脱液)，上样量10μL；泳道4：洗脱液2(二次洗杂的洗脱液)，上样量10μL；泳道5：洗脱液3(一次洗脱的洗脱液)，上样量10μL；泳道6：洗脱液4(二次洗脱的洗脱液)，上样量10μL。泳道1-6展示了YLT-ColI蛋白的纯化过程，泳道5-6为纯化后的蛋白，纯度为90％。将融合蛋白长期冻存于低温(-20～-80℃)，或将融合蛋白冻干成粉。

实施例2

本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)宿主菌构建

同实施例1。

(2)菌株表达

挑取单个重组大肠杆菌的克隆，转接到50mL LB培养基，加入终浓度为45μg/mL的卡那霉素，在37℃、170rpm条件下过夜培养。第二天，从种子液中吸取菌液，按1:100的比例接种到新鲜LB培养基中，在37℃、170rpm条件下同样条件下培养，待生长OD长至0.6-0.8区间时，加入终浓度为0.7mM的IPTG溶液对产物进行诱导，诱导处理的温度为37℃，诱导处理的转速为170rpm，大肠杆菌诱导表达4.5h后离心收取菌体。

(3)菌体破碎

取适量菌体，按体积比为10:1将破菌缓冲液与菌体重悬，所述破菌缓冲液为30mMPB+150mM NaCl、pH 7.4的水溶液，使用高压均质机在700bar条件下将菌体破碎三次，直至菌液澄清透明，在镜检下可观察到菌体被破碎完毕；将菌液在13000rpm条件下离心45min，收取上清液体作为菌体破碎上清液，并用0.45μm滤膜对菌液进行过滤。

(4)纯化

菌液上清经NI柱吸附后，依次用30mM PB+150mM NaCl+55mM咪唑，pH 7.4的水溶液和30mM PB+150mM NaCl+105mM咪唑，pH 7.4的水溶液进行洗杂，再用30mM PB+150mM NaCl+220mM咪唑，pH 7.4的水溶液和30mM PB+150mM NaCl+520mM咪唑，pH 7.4的水溶液进行洗脱。洗脱液进一步用G25凝胶柱进行脱盐，得到胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

(5)蛋白的鉴定和保存

同实施例1。

实施例3

本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)宿主菌构建

同实施例1。

(2)菌株表达

挑取单个重组大肠杆菌的克隆，转接到50mL LB培养基，加入终浓度为55μg/mL的卡那霉素，在37℃、270rpm条件下过夜培养。第二天，从种子液中吸取菌液，按1:100的比例接种到新鲜LB培养基中，在37℃、270rpm条件下同样条件下培养，待生长OD长至0.6-0.8区间时，加入终浓度为1.3mM的IPTG溶液对产物进行诱导，诱导处理的温度为37℃，诱导处理的转速为270rpm，大肠杆菌诱导表达5.5h后离心收取菌体。

(3)菌体破碎

取适量菌体，按体积比为10:1将破菌缓冲液与菌体重悬，所述破菌缓冲液为10mMPB+250mM NaCl、pH 7.4的水溶液，使用高压均质机在900bar条件下将菌体破碎三次，直至菌液澄清透明，在镜检下可观察到菌体被破碎完毕；将菌液在15000rpm条件下离心55min，收取上清液体作为菌体破碎上清液，并用0.45μm滤膜对菌液进行过滤。

(4)纯化

菌液上清经NI柱吸附后，依次用10mM PB+250mM NaCl+45mM咪唑，pH 7.4的水溶液和10mM PB+250mM NaCl+95mM咪唑，pH 7.4的水溶液进行洗杂，再用10mM PB+250mM NaCl+180mM咪唑，pH 7.4的水溶液和10mM PB+250mM NaCl+480mM咪唑，pH 7.4的水溶液进行洗脱。洗脱液进一步用G25凝胶柱进行脱盐，得到胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

(5)蛋白的鉴定和保存

同实施例1。

实施例4

本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)宿主菌构建

同实施例1。

(2)菌株表达

挑取单个重组大肠杆菌的克隆，转接到50mL LB培养基，加入终浓度为40μg/mL的卡那霉素，在36℃、120rpm条件下过夜培养。第二天，从种子液中吸取菌液，按1:100的比例接种到新鲜LB培养基中，在36℃、120rpm条件下培养，待生长OD长至0.6-0.8区间时，加入终浓度为0.5mM的IPTG溶液对产物进行诱导，诱导处理的温度为36℃，诱导处理的转速为120rpm，大肠杆菌诱导表达4h后离心收取菌体。

(3)菌体破碎

取适量菌体，按体积比为10:1将破菌缓冲液与菌体重悬，所述破菌缓冲液为40mMPB+100mM NaCl、pH 7.4的水溶液，使用高压均质机在600bar条件下将菌体破碎三次，直至菌液澄清透明，在镜检下可观察到菌体被破碎完毕；将菌液在12000rpm条件下离心40min，收取上清液体作为菌体破碎上清液，并用0.45μm滤膜对菌液进行过滤。

(4)纯化

菌液上清经NI柱吸附后，依次用40mM PB+100mM NaCl+40mM咪唑，pH 7.4的水溶液和40mM PB+100mM NaCl+90mM咪唑，pH 7.4的水溶液进行洗杂，再用40mM PB+100mM NaCl+150mM咪唑，pH 7.4的水溶液和40mM PB+100mM NaCl+450mM咪唑，pH 7.4的水溶液进行洗脱。洗脱液进一步用G25凝胶柱进行脱盐，得到胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

(5)蛋白的鉴定和保存

同实施例1。

实施例5

本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)宿主菌构建

同实施例1。

(2)菌株表达

挑取单个重组大肠杆菌的克隆，转接到50mL LB培养基，加入终浓度为60μg/mL的卡那霉素，在38℃、320rpm条件下过夜培养。第二天，从种子液中吸取菌液，按1:100的比例接种到新鲜LB培养基中，在38℃、320rpm条件下培养，待生长OD长至0.6-0.8区间时，加入终浓度为1.5mM的IPTG溶液对产物进行诱导，诱导处理的温度为38℃，诱导处理的转速为320rpm，大肠杆菌诱导表达6h后离心收取菌体。

(3)菌体破碎

取适量菌体，按体积比为10:1将破菌缓冲液与菌体重悬，所述破菌缓冲液为50mMPB+300mM NaCl、pH 7.4的水溶液，使用高压均质机在1000bar条件下将菌体破碎三次，直至菌液澄清透明，在镜检下可观察到菌体被破碎完毕；将菌液在16000rpm条件下离心60min，收取上清液体作为菌体破碎上清液，并用0.45μm滤膜对菌液进行过滤。

(4)纯化

菌液上清经NI柱吸附后，依次用50mM PB+300mM NaCl+60mM咪唑，pH 7.4的水溶液和50mM PB+300mM NaCl+110mM咪唑，pH 7.4的水溶液进行洗杂，再用50mM PB+300mM NaCl+250mM咪唑，pH 7.4的水溶液和50mM PB+300mM NaCl+550mM咪唑，pH 7.4的水溶液进行洗脱。洗脱液进一步用G25凝胶柱进行脱盐，得到胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

(5)蛋白的鉴定和保存

同实施例1。

实施例6

本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列与实施例1中一致，本实施例与实施例1的区别仅在于，所述重组人源胶原蛋白的制备方法中，步骤(2)菌株表达中，诱导表达的条件中：诱导处理的温度为35℃。

实施例7

本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列与实施例1中一致，本实施例与实施例1的区别仅在于，所述重组人源胶原蛋白的制备方法中，步骤(2)菌株表达中，诱导表达的条件中：诱导处理的温度为39℃。

实施例8

本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列与实施例1中一致，本实施例与实施例1的区别仅在于，所述重组人源胶原蛋白的制备方法中，步骤(3)菌体破碎中，所述破菌缓冲液中PB的摩尔浓度为5mM。

实施例9

本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列与实施例1中一致，本实施例与实施例1的区别仅在于，所述重组人源胶原蛋白的制备方法中，步骤(3)菌体破碎中，所述破菌缓冲液中PB的摩尔浓度为60mM。

实施例10

本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列与实施例1中一致，本实施例与实施例1的区别仅在于，所述重组人源胶原蛋白的制备方法中，步骤(3)菌体破碎中，所述破菌缓冲液中NaCl的摩尔浓度为50mM。

实施例11

本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列与实施例1中一致，本实施例与实施例1的区别仅在于，所述重组人源胶原蛋白的制备方法中，步骤(3)菌体破碎中，所述破菌缓冲液中NaCl的摩尔浓度为350mM。

实施例12

本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列与实施例1中一致，本实施例与实施例1的区别仅在于，在步骤(4)纯化过程中，一次和二次洗杂采用的预洗脱缓冲液中咪唑的摩尔浓度分别为20mM、70mM。

实施例13

本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列与实施例1中一致，本实施例与实施例1的区别仅在于，在步骤(4)纯化过程中，一次和二次洗杂采用的预洗脱缓冲液中咪唑的摩尔浓度分别为80mM、130mM。

实施例14

本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列与实施例1中一致，本实施例与实施例1的区别仅在于，在步骤(4)纯化过程中，一次和二次洗脱采用的洗脱缓冲液中咪唑的摩尔浓度分别为100mM、400mM。

实施例15

本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列与实施例1中一致，本实施例与实施例1的区别仅在于，在步骤(4)纯化过程中，一次和二次洗脱采用的洗脱缓冲液中咪唑的摩尔浓度分别为300mM、600mM。

对实施例1-15中的制备方法制备得到的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白进行质量检测，检测结果如表2所示。

表2

通过表2可知，实施例1-15中的制备方法所得的重组人源胶原蛋白的纯度高低不一，实施例1所得的重组人源胶原蛋白的纯度最高。

通过实施例1和实施例6-7的对比可知，当诱导的温度超出原定范围时，会导致所得产品的纯度的下降。

通过实施例1和实施例8-11的对比可知，当缓冲体系中PB和NaCl的浓度发生改变时，会影响所得产品的纯度。

通过实施例1和实施例12-15的对比可知，当洗杂过程中的咪唑浓度过低时，不能有效洗脱杂质；当洗杂过程中的咪唑浓度过高时，又会导致产品流失。当洗脱过程中的咪唑浓度过低时，部分产品因没被洗脱而浪费；当洗脱过程中的咪唑浓度过高时，大量杂质也同时被洗脱，导致纯度的下降。

对比例1

本对比例提供一种人源胶原蛋白ColI，所述胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

对比例2

本对比例提供一种市售胶原蛋白Ctrl-Col，其氨基酸序列与SEQ ID NO.2不同。

对比例3

本对比例提供一种芋螺肽，所述芋螺肽(YLT)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

对比例4

本对比例提供另一种芋螺肽，所述芋螺肽(YLT2)的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

SEQ ID NO.5：GDCKPCMHPDCRFNPGRCR。

对比例5

本对比例提供另一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白(YLT2-ColI)，所述芋螺肽(YLT2)的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述胶原蛋白(ColI)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本对比例与实施例1的区别在于，用芋螺肽(YLT2)替换了实施例1融合蛋白中的芋螺肽(YLT)。

对比例6

本对比例提供一种胶原蛋白ColI和芋螺肽(YLT)的混合物，所述胶原蛋白ColI的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，芋螺肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

应用例1

本应用例提供一种具有即时抗皱效果且能长效修复肌肤的组合物，所述组合物中含有实施例1所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，所述组合物按重量分数计包括：胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白0.1份、肌肽0.1份、苯氧乙醇0.4份、乙基己基甘油0.05份、甘油5份、甜菜碱1份和水93.35份。

所述具有即时抗皱效果且能长效修复肌肤的组合物的制备方法如下：依次将胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白、肌肽、苯氧乙醇、乙基己基甘油、甘油、甜菜碱和水混合，得到所述具有即时抗皱效果且能长效修复肌肤的组合物。

应用例2

本应用例提供一种具有即时抗皱效果且能长效修复肌肤的组合物，所述组合物中含有实施例1所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，所述组合物按重量分数计包括：胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白0.05份、肌肽0.05份、苯氧乙醇0.2份、乙基己基甘油0.03份、甘油3份、甜菜碱0.7份和水95.97份。