一种具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素及其制备方法和应用。

背景技术

胰高血糖素(GCG)是一种由胰脏胰岛α-细胞分泌的一种肽类激素，临床用药的主要缺点是在体内快速降解，这导致生物分布和药代动力学特征差，并且胰高血糖素通过胰高血糖素受体(GCGR)对相应细胞发挥作用。胰高血糖素受体属于GPCR的B类家族，是分泌素家族的肽激素受体，广泛用于许多人类疾病的药物靶点，包括糖尿病、癌症、神经变性、心血管疾病和其他疾病，但胰高血糖素单一疗法尚未在临床试验中直接测试。

结直肠癌是发生在结肠部位的恶性肿瘤，我国结直肠癌发病率、死亡率在全部恶性肿瘤中分别位居第三位及第五位，也是近年最常见的癌症死亡原因之一。目前治疗晚期结直肠癌的主要手段是手术切除结合化疗联合用药，但多种化疗药物的联用的疗效并不理想。

5FU(5-氟尿嘧啶)是嘧啶类的抗代谢类肿瘤药物，对增殖性癌细胞有杀伤性作用，是结直肠癌首选且疗效较高的化疗药物。但是5FU口服生物利用率低，毒副作用明显，半衰期短，易被酶代谢。临床上通过频繁和高剂量静注给药来达到有效浓度，但这样的给药方式顺应性差，极大限制了临床应用和治疗效果。

前期研究发现胰高血糖素通过与胰高血糖素受体(GCGR)结合可以增加5FU的敏感性。但是GCGR主要在肝脏中表达，全身其他部位也有分布，如肾脏、脂肪组织、胰腺、脾脏、成淋巴细胞、大脑、胃肠道和肾上腺。这就导致临床上直接用药的利用率较差，且临床上并没有优化GCG递送方式的案例。综上，如何提供一种具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素制备方法或药物组合疗法，在增加药物稳定性、降低毒副作用的同时更有效的治疗结直肠癌，具有重要的临床意义。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供一种具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素及其制备方法和应用，以对癌症、特别是结直肠癌进行有效治疗。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是，提供一种具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素，包括脂质体和包载于脂质体内的胰高血糖素或胰高血糖素与化疗药物的混合物；脂质体为中性脂质体、负电荷脂质体或正电荷脂质体。

本发明还公开了上述具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素的制备方法，制备方法包括但不限于薄膜水化法、滤膜挤出法、反复冻融法、有机溶剂注入法、反向蒸发法、超声分散法等。

进一步，本申请采用薄膜水化法来制备具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素，具体包括以下步骤：

S1：将氢化大豆卵磷脂、胆固醇和靶向物DSPE-PEG2000-靶头共溶于有机溶剂中，再蒸除溶剂，得到磷脂薄膜；或者是将氢化大豆卵磷脂、胆固醇、DSPE和靶向物GCG-PEG2000-靶头共溶于有机溶剂中，再蒸除溶剂，得到磷脂薄膜；

S2：将磷脂薄膜置于胰高血糖素水溶液中，再超声水化，得到脂质体溶液；

S3：对脂质体溶液进行透析，得到具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素GCG@LFA。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，氢化大豆卵磷脂、胆固醇和靶向物DSPE-PEG2000-靶头的摩尔比为80～90:5～15:3～6；氢化大豆卵磷脂、胆固醇、DSPE和靶向物GCG-PEG2000-靶头的摩尔比为80～90:5～15:5～10:3～6；胰高血糖素水溶液的浓度范围为0.3～1mg/mL。

进一步，有机溶剂为氯仿；蒸除溶剂的方式为旋蒸，旋蒸温度为35～40℃，旋蒸时间为30～60min。

进一步，超声水化的超声功率为200～500W，超声时间为10～15min；透析为用截留分子量为7000Da的透析袋透析5～8次，每次间隔时间2h；透析过程中所用透析液为PBS缓冲液。

进一步，靶向物为DSPE-PEG2000-FA或GCG-PEG2000-FA。其中，FA是具有增加肿瘤靶向的靶头，也可以是其他通用肿瘤靶向配体，或者针对特定肿瘤标志物的靶向分子。靶头与DSPE-PEG相连位于磷脂双分子层上，如以DSPE-PEG2000-靶向分子为原料形成磷脂双分子层，也可以与GCG直接通过PEG相连，如靶头-PEG-GCG。

本发明还公开了具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素在制备防治结直肠癌的药物或提升化疗药物敏感性的制剂中的应用。所制备的防治结直肠癌的药物为具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素和5-FU的联合药物；联合药物为注射剂，其中具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素的释放量为0.2～2μg/kg/天，5-FU的释放量为0.1～1mg/kg/两天。

本发明的有益效果是：

1.本发明中的用于肿瘤治疗的纳米粒以氢化大豆卵磷脂(HSPC)、胆固醇和DSPE-PEG2000-FA为基本原料，其中，HSPC所形成的脂质体提供了具有高渗透性和低稳定性的双层结构，而胆固醇可以防止脂质体聚集，调节膜流动性和通透性，使膜的内聚力增加，磷脂双层的稳定性提高。PEG具有高柔韧性、良好的亲水性和生物相容性，PEG末端修饰的脂质体作为治疗癌症和感染性疾病的被动靶向给药载体，在增加药物的体循环时间、将活性分子输送到作用部位以及防止健康组织受到毒性作用的损害方面优于其他载体。叶酸偶联的化合物能够将纳米颗粒递送给病理细胞而不对正常组织造成伤害，特异性的将胰高血糖素递送至肿瘤细胞微环境部位，抑制肿瘤的增殖，达到抗肿瘤的目的。

2.本发明中的纳米粒为脂质体药物递送系统，可通过改变封装药物的药代动力学和生物分布模式将抗癌药物选择性递送至实体瘤，安全性和有效性得以保障。

3.本发明中脂质体化后的胰高血糖素稳定性得到提升，可延长胰高血糖素活性。

4.本发明中将GCG@LFA纳米粒与5-FU联合使用，GCG@LFA纳米粒中的胰高血糖素可以对5-FU起到增敏效果，能够显著抑制肿瘤的发展，有效抑制小鼠肿瘤的生长，并使肿瘤内部血管生成拟态减少，提高结直肠癌的治疗效果，且不会出现化疗抵抗的现象。

5.与目前常用于治疗结直肠癌的药物相比，本发明提供的用于治疗结直肠癌的化疗药物的剂量较小(例如，用于小鼠的5-FU给药剂量为5～25mg/kg，按照小鼠使用的剂量是人使用的剂量的25倍或者50倍计算，用于人体的5-FU给药剂量低至0.1～1mg/kg)，副作用较小。

附图说明

图1为GCG@LFA的制备流程图；

图2为不同细胞中GCGR的表达情况；

图3为不同组织中GCGR的表达情况；

图4为LFA、GCG和GCG@LFA的紫外吸收光谱图；

图5为LFA、GCG和GCG@LFA的红外吸收光谱图；

图6为LFA、GCG和GCG@LFA的western blot检测结果；

图7为实施例1制得的GCG@LFA的TEM图；

图8为实施例1制得的GCG@LFA的粒径分布图；

图9为肿瘤细胞对GCG@LFA的摄取情况；

图10为5-FU与GCG和GCG@LFA单独或联合用药对小鼠CT26细胞的影响；

图11为5-FU与GCG和GCG@LFA纳米粒单独或联合用药对小鼠CT26细胞成血管拟态的影响；

图12为不同药物对小鼠肿瘤尺寸大小的影响；

图13为不同药物处理后小鼠肿瘤大小的变化；

图14为不同药物对小鼠肿瘤重量的影响；

图15为不同药物处理后小鼠肿瘤组织中血管生成拟态的变化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

实施例1

一种具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素(GCG@LFA)，包括磷脂脂质体和包载于磷脂脂质体内的胰高血糖素，其经过以下步骤制得：

(1)将HSPC、胆固醇和DSPE-PEG2000-FA分别用氯仿溶解配成10mg/mL的溶液，然后按照HSPC:胆固醇:DSPE-PEG2000-FA＝85:10:5的摩尔比将三种溶液混匀，在真空条件下以37℃的温度旋蒸45min，去掉溶剂，得到磷脂薄膜。

(2)将磷脂薄膜置于浓度为0.5mg/mL的胰高血糖素水溶液中，再以300W的超声功率超声水化10min，得到脂质体溶液；

(3)用7000Da的透析袋对脂质体溶液进行透析，所用透析液为PBS缓冲液，每两小时换一次透析液，总共进行6次，得到具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素GCG@LFA。

实施例2

一种具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素(GCG@LFA)，包括磷脂脂质体和包载于磷脂脂质体内的胰高血糖素，其经过以下步骤制得：

(1)将HSPC、胆固醇和DSPE-PEG2000-FA分别用氯仿溶解配成10mg/mL的溶液，然后按照HSPC:胆固醇:DSPE-PEG2000-FA＝80:5:3的摩尔比将三种溶液混匀，在真空条件下以35℃的温度旋蒸60min，去掉溶剂，得到磷脂薄膜。

(2)将磷脂薄膜置于浓度为0.3mg/mL的胰高血糖素水溶液中，再以200W的超声功率超声水化15min，得到脂质体溶液；

(3)用7000Da的透析袋对脂质体溶液进行透析，所用透析液为PBS缓冲液，每两小时换一次透析液，总共进行6次，得到具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素GCG@LFA。

实施例3

一种具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素，包括磷脂脂质体和包载于磷脂脂质体内的胰高血糖素，其经过以下步骤制得：

(1)将HSPC、胆固醇和DSPE-PEG2000-FA分别用氯仿溶解配成10mg/mL的溶液，然后按照HSPC:胆固醇:DSPE-PEG2000-FA＝90:15:6的摩尔比将三种溶液混匀，在真空条件下以40℃的温度旋蒸30min，去掉溶剂，得到磷脂薄膜。

(2)将磷脂薄膜置于浓度为1mg/mL的胰高血糖素水溶液中，再以500W的超声功率超声水化10min，得到脂质体溶液；

(3)用7000Da的透析袋对脂质体溶液进行透析，所用透析液为PBS缓冲液，每两小时换一次透析液，总共进行8次，得到具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素GCG@LFA。

实施例4

一种具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素，包括磷脂脂质体和包载于磷脂脂质体内的胰高血糖素，其经过以下步骤制得：

(1)将HSPC、胆固醇、DSPE和GCG-PEG2000-FA分别用氯仿溶解配成10mg/mL的溶液，然后按照HSPC:胆固醇:DSPE:GCG-PEG2000-FA＝85:10:6:5的摩尔比将四种溶液混匀，在真空条件下以37℃的温度旋蒸45min，去掉溶剂，得到磷脂薄膜。

(2)将磷脂薄膜置于浓度为0.5mg/mL的胰高血糖素水溶液中，再以300W的超声功率超声水化10min，得到脂质体溶液；

(3)用7000Da的透析袋对脂质体溶液进行透析，所用透析液为PBS缓冲液，每两小时换一次透析液，总共进行6次，得到具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素GCG@LFA。

实施例5

一种具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素(GCG@LFA)，包括磷脂脂质体和包载于磷脂脂质体内的胰高血糖素，其经过以下步骤制得：

(1)将HSPC、胆固醇、DSPE和GCG-PEG2000-FA分别用氯仿溶解配成10mg/mL的溶液，然后按照HSPC:胆固醇:DSPE:GCG-PEG2000-FA＝80:5:5:3的摩尔比将四种溶液混匀，在真空条件下以35℃的温度旋蒸60min，去掉溶剂，得到磷脂薄膜。

(2)将磷脂薄膜置于浓度为0.3mg/mL的胰高血糖素水溶液中，再以200W的超声功率超声水化15min，得到脂质体溶液；

(3)用7000Da的透析袋对脂质体溶液进行透析，所用透析液为PBS缓冲液，每两小时换一次透析液，总共进行6次，得到具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素GCG@LFA。

实施例6

一种具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素，包括磷脂脂质体和包载于磷脂脂质体内的胰高血糖素，其经过以下步骤制得：

(1)将HSPC、胆固醇、DSPE和GCG-PEG2000-FA分别用氯仿溶解配成10mg/mL的溶液，然后按照HSPC:胆固醇:DSPE:GCG-PEG2000-FA＝90:15:10:6的摩尔比将四种溶液混匀，在真空条件下以40℃的温度旋蒸30min，去掉溶剂，得到磷脂薄膜。

(2)将磷脂薄膜置于浓度为1mg/mL的胰高血糖素水溶液中，再以500W的超声功率超声水化10min，得到脂质体溶液；

(3)用7000Da的透析袋对脂质体溶液进行透析，所用透析液为PBS缓冲液，每两小时换一次透析液，总共进行8次，得到具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素GCG@LFA。

结果分析

本发明中具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素(GCG@LFA)制备流程如图1所示。由于实施例1～6所制得的具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素性能相似，因此以实施例1制得的具有肿瘤靶向功能的脂质体化胰高血糖素为例，详细说其性能。

一、GCG副作用

对多种细胞或组织进行GCGR的Western Blot检测发现，GCGR除在结直肠细胞或组织中存在异常高表达(图2图3)之外，许多细胞中也存在GCGR的表达(HepG2：人肝癌细胞；αcell：正常胰岛α细胞；hREC：人视网膜内皮细胞；c166：小鼠血管内皮细胞；hpde6-c7：人胰导管上皮细胞)，并且在肠组织各处都有分布。GCG的主要缺点是在体内快速降解，这导致生物分布和药代动力学特征差，GCGR的全身分布使GCG药物的利用率较差。因此需要优化药物的递送方式，以保证药物特异性靶向作用于肿瘤细胞。

二、形貌结构分析

分别对空载脂质体(LFA，未负载GCG的纳米粒)、胰高血糖素(GCG)和实施例1中制得的GCG@LFA进行紫外和红外吸收检测，光谱图如图4和5所示。紫外特征吸收峰(约277nm)来自于GCG；傅里叶红外光谱图中GCG@LFA出现了一个特征峰(1531cm

三、GCG@LFA的肿瘤靶向能力分析

将实施例1中制得的GCG@LFA与肿瘤细胞一起培养，观察肿瘤细胞对GCG@LFA的摄取情况。具体包括以下步骤：

(1)肿瘤细胞的培养

将购自ATCC公司的CT26肠癌细胞，以4×10

(2)肿瘤细胞对纳米粒的摄取情况的监测

用异硫氰酸荧光素(FITC)标记GCG@LFA，贴壁的CT26细胞中前两组加入空白DMEM培养基，第三组加入含有1mM叶酸的DMEM培养基预处理1h。PBS洗去叶酸后再分别加入空白DMEM培养基、含有荧光素标记的GCG@LFA的DMEM培养基，于37℃、5％CO

四、GCG@LFA对结直肠癌细胞对化疗药物敏感性的影响

利用实施例1制得的GCG@LFA研究了本申请中的脂质体化胰高血糖素对结直肠癌细胞对化疗药物敏感性的影响，具体包括以下步骤：

向96孔板中加入含10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素双抗的RPMI-1640培养基，然后将购自ATCC公司的CT26肠癌细胞，以1×10

五、GCG@LFA对血管生成拟态的影响

考察GCG@LFA对肿瘤细胞血管生成拟态的影响，具体包括以下步骤：

在6孔板中按1×10

六、体内评估GCG@LFA和5-FU联合用药的抗肿瘤效应

联合用药效果评估具体包括以下步骤：

(1)将1×10

Volume＝0.5a×b

其中，a和b分别为肿瘤的长直径和垂直短直径。当肿瘤平均体积达到约100～200mm

(2)当肿瘤的平均体积达到约200mm

药物对肿瘤的抑制效果结果如图12～15所示，图中**代表P<0.01，***代表P<0.001，****代表P<0.0001。从图中可以看出，与Ctrl组相比，GCG@LFA组、5-FU组、5-FU+GCG组、5-FU+GCG@LFA组的肿瘤大小(图12、13)和重量(图1/4)均小于Ctrl组，说明这些药物对肿瘤的生长均有抑制作用。CD31/PAS染色发现，与5-FU联合使用时，在肿瘤内区域GCG@LFA显著减少了血管生成拟态的数量(图15)，因此GCG@LFA抑制血管生成拟态，而与5-FU联合使用时可能有助于抑制肿瘤，同体外实验结果一致。

综上所述，研究表明GCG@LFA可以抑制肿瘤血管生成拟态，与5-FU联合使用可进一步降低假血管密度，从而抑制肿瘤生长，对于肿瘤的治疗效果最好。表明含有叶酸靶头的脂质体可以携带胰高血糖素特异性靶向结直肠癌肿瘤组织内部发挥作用，再与化疗药物5-FU联合使用可更大程度地抑制肿瘤的发展。

虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。