肺癌胸水来源类器官的培养基、培养方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于肺癌类器官培养的 培养基、使用该培养基培养肺癌胸水来源类器官的方法、及其在药物 的疗效评估和筛选中的应用。

背景技术

肺癌是肺部常见的恶性肿瘤，对人类健康和生命威胁最大的恶性 肿瘤之一。临床研究证实肺癌发展到晚期都会出现恶性胸腔积液 (malignant pleural effusion,MPE)。MPE的出现即提示失去手术治疗 机会，表明患者预后不良。高通量药敏检测分析需要在体外分离纯化 出足够数目的病人自体肿瘤细胞，而肿瘤细胞的体外培养，一直是阻 碍肿瘤细胞药敏检测的瓶颈问题。由于晚期肺癌伴胸水的患者，其胸 水中常常富含纯度较高的肿瘤细胞，因此适合通过高通量药敏检测技 术来为病人筛选最佳治疗方案。传统临床药物敏感性检测大多采用二 维细胞培养。然而，二维培养的细胞仅在有限程度上模拟组织生理条件，缺乏体内真实的组织结构，易导致低分化水平和细胞生理功能的 丢失，进而导致获得的实验结果很难预测临床实际结果。

类器官，属于三维(3D)细胞培养物，主要来源于人体具有分化 能力的胚胎干细胞、诱导多潜能干细胞和成体干细胞。不同组织器官 都存在内源组织干细胞，在维持各器官的功能形态发挥着重要作用。 这些干细胞在体外一定的诱导条件下，可以自组织形成一个直径仅为 几毫米的迷你结构。肿瘤类器官是用取自患者体内原发性肿瘤，在实 验室中培养出一些微型的3D肿瘤细胞模型。肿瘤类器官高度模拟了来 源肿瘤组织的特征，保留了个体之间的肿瘤异质性，可用于功能性的 测试，如进行高通量药物筛选和个体化精准治疗。当前，肺癌类器官 培养方法多采用R-spondin-1、WNT3A和Noggin等昂贵的蛋白因子，导致类器官培养成本较高；且这项技术操作复杂和技术难度大，导致 其大规模商业化应用受到限制。因此，需要开发一种低成本、简单且 成功率高的类器官培养方法和培养基。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于在体外快速扩增 肺癌类器官的培养基及培养方法。

本发明的一个方面在于提供一种肺癌类器官的培养基，所述培养 基包含MST1/2激酶抑制剂、选自N2和B27的至少一种细胞培养添加 剂、成纤维细胞生长因子10、SB202190、Y27632、A83-01、神经调节 蛋白1、胰岛素样生长因子1、角化细胞生长因子、GlutaMAX、烟酰 胺和HEPES。其中，所述MST1/2激酶抑制剂包括式(I)的化合物或 其药学可接受的盐、或溶剂化物，

其中，

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优选的实施方式中，MST1/2激酶抑制剂包括式(Ia)的化合物或其 药学可接受的盐、或溶剂化物，

其中，

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优选地，所述MST1/2抑制剂是选自以下化合物或其药学可接受的 盐、或溶剂化物中的至少一种。

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最优选地，本发明的MST1/2激酶抑制剂为化合物1。

在本发明的实施方式中，本发明的培养基中各成分的含量满足以 下任意一项或多项或全部满足：

(1)MST1/2激酶抑制剂的浓度优选为2.5～10μM；

(2)B27或N2细胞培养添加剂相对于培养基的体积比优选为 1:25～1:100；

(3)成纤维细胞生长因子10的浓度优选为25～200ng/mL；

(4)SB202190的浓度优选为200～1000nM；

(5)Y27632的浓度优选为2.5～10μM；

(6)A83-01的浓度优选为200～1000nM；

(7)神经调节蛋白1的浓度优选为1～40ng/mL；

(8)胰岛素样生长因子1的浓度优选为2～40ng/mL；

(9)角化细胞生长因子的浓度优选为2～40ng/mL；

(10)GlutaMAX相对于培养基的体积比优选为1:50～1:200；

(11)烟酰胺的浓度优选为1～10mM；

(12)HEPES的浓度优选为1～10mM。

在本发明的实施方式中，所述培养基还含有选自DMEM/F12、 DMEM、F12或RPMI-1640的初始培养基；和选自链霉素/青霉素、两 性霉素B和Primocin中的一种或多种的抗生素。

在优选的实施方式中，当抗生素选自链霉素/青霉素时，链霉素浓 度范围为25～400μg/mL，青霉素浓度范围为25～400U/mL，当抗生 素选自两性霉素B时，浓度范围为0.25～4μg/mL，当抗生素选自 Primocin时，浓度范围为25～400μg/mL。

本发明还提供一种肺癌类器官的培养方法。在本发明的肺癌类器 官的培养方法中，使用本发明的肺癌类器官培养基对肺癌胸水组织来 源的原代细胞进行培养。

本发明的肺癌类器官培养方法包括以下步骤。

1.从肺癌胸水组织中分离样本，获得肺癌原代细胞。该处理过程 包括以下步骤：

(1)分离肺癌胸水组织样本，将收集到的肺癌胸水转移至离心管 中，离心转速为1800～2200rpm，离心时间为8～12分钟；

(2)离心后弃去上清液，加入基础培养基重悬后过筛，收集细胞 悬液离心，离心转速为1200～1600rpm，离心时间为3～5分钟；

(3)观察细胞沉淀，若含红细胞，则加入3-5毫升红细胞裂解液 在冰上裂解5-10分钟，裂解完全后离心，离心转速为1200～1600rpm， 离心时间为3～5分钟，得到细胞沉淀待用。

其中，基础培养基配方包括选自DMEM/F12、DMEM、F12或 RPMI-1640的初始培养基；和选自链霉素/青霉素、两性霉素B和Primocin中的一种或多种的抗生素。

2.配制本发明的肺癌类器官培养基，并对上述步骤获得的肺癌原 代细胞进行培养。

将上述步骤1中获得的肺癌原代细胞用本发明的肺癌类器官培养 基重悬并计数，将细胞密度稀释为5～10×10

本发明还提供一种用于评估或筛选治疗肺癌疾病的药物的方法， 其包括以下步骤：

(1)使用本发明的肺癌类器官的培养方法培养肺癌类器官；

(2)选定需要检测的药物并按照所需浓度梯度进行稀释；

(3)对(1)中培养得到的类器官添加稀释后的所述药物；

(4)进行类器官大小或类器官活力测试。

本发明的有益效果包括：

(1)提高肺癌组织来源类器官培养的成功率，成功率达到85％以 上；

(2)保证体外原代培养的肺癌类器官能够保持病人的病理特性；

(3)扩增效率高，能快速培养出肺癌类器官，扩增出的肺癌类器 官还可以连续传代；

(4)培养成本可控，培养基无需加入价格昂贵的Wnt激动剂、 R-spondin家族蛋白和Noggin蛋白；

(5)所述技术养获得的肺癌类器官数量多，适合高通量筛选候选 化合物和为病人提供高通量药物体外敏感性功能测试。

附图说明

图1A-1L为显示本发明的肺癌类器官培养基所添加因子的不同浓 度对肺癌类器官增殖的影响的图。

图2A-2D为利用显微镜观察使用本发明的肺癌类器官培养基培养 得到的肺癌胸水类器官的照片，其中图2A显示由样本OPB1获得的类 器官培养5天后的照片；图2B显示由样本OPB1获得的类器官培养10 天后的照片；图2C显示由样本OPB2获得的类器官培养16天后的照 片(4倍镜拍照)；图2D显示由样本OPB2获得的类器官培养16天 后的照片(10倍镜拍照)。

图3A和3B为对原始胸水细胞样本OPB1和使用本发明的肺癌类 器官培养基培养样本OPB1得到的肺癌类器官进行病理和免疫组化鉴 定结果比较。

图4A和4B为对样本OPB3使用本发明的肺癌类器官培养基培养 得到的肺癌类器官进行电镜分析的结果，图4B为图4A的局部放大图。

图5A和5B为使用本发明的肺癌类器官培养基与现有培养基分别 对肺癌类器官进行培养的比较结果，其中图5A显示用本发明的LPOM 培养基培养14天后的照片；图5B显示用文献培养基ROM培养14天 后的照片。

图6A和6B显示使用本发明的肺癌类器官培养基培养得到肺癌类 器官进行药物浓度敏感性测试的结果。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明作进一步 描述。以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。

[MST1/2激酶抑制剂的制备实施例]

本说明书中，MST1/2激酶抑制剂是指直接或间接地对MST1/2信 号传导进行负调节的任意的抑制剂。一般来说，MST1/2激酶抑制剂例 如与MST1/2激酶结合并降低其活性。由于MST1和MST2的结构具 有相似性，MST1/2激酶抑制剂也可以是例如与MST1或MST2结合并 降低其活性的化合物。

1.MST1/2激酶抑制剂化合物1的制备

4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)苯

2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(A2)：在圆底烧瓶中加入2- 氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸(2.0克)后加入甲醇(30毫升)，随后冰 浴下滴加二氯亚砜(1.2毫升)。反应体系在85℃反应过夜。反应结束 后，体系在减压下蒸干溶剂，所得白色固体，直接用于下一步。

2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(A3)： 在圆底烧瓶中加入2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2克)后加入丙 酮(30毫升)和碳酸钾(2.2克)，然后用冰盐浴使体系冷却到-10℃， 接着缓慢加入2,4-二氯-5-硝基嘧啶(3.1克)的丙酮溶液。反应体系在 室温搅拌过夜。反应结束后，过滤，滤液在减压下除去溶剂，残留物 经加压硅胶柱层析提纯后得化合物A3。LC/MS：M+H 359.0。

2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(A4)：在圆底烧瓶 中加入2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2.5 克)后加入醋酸(50毫升)和铁粉(3.9克)。反应体系在60℃搅拌 两小时。反应结束后，体系在减压下蒸干溶剂，所得物用饱和碳酸氢 钠中和至碱性。乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗涤后 用无水硫酸钠干燥。有机相经过滤，减压蒸干后得粗品。粗品经乙醚 洗涤后得化合物A4。LC/MS：M+H 297.0。

2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(A5)： 在圆底烧瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(2克) 和N,N-二甲基乙酰胺(10毫升)，冷却至-35℃，加入碘甲烷(0.9毫 升)，随后加入氢化钠(615毫克)，反应体系继续搅拌两小时。反应 结束后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗 涤后用无水硫酸钠干燥。有机相经过滤，减压蒸干后得粗品。粗品经 乙醚洗涤后得化合物A5。LC/MS：M+H 325.0。

4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨 基)苯磺酰胺(1)：在圆底烧瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲 基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(100毫克)、磺胺(53毫克)、对甲苯磺 酸(53毫克)和仲丁醇(5毫升)。反应体系在120℃搅拌过夜。反应 结束后，过滤，甲醇和乙醚洗涤得化合物1。LC/MS：M+H 461.1。

2.本发明的其他MST1/2抑制剂化合物的制备

本发明的其他MST1/2抑制剂化合物按照与化合物1类似的方法合 成，其结构及质谱数据如下表所示。

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实施例1肺癌类器官培养基中各添加因子对肺癌类器官增殖的影 响

(1)肺癌类器官培养基的配制

首先配制含有初始培养基的基础培养基。初始培养基可选自本领 域常用的DMEM/F12、DMEM、F12或RPMI-1640。在本实施例中， 基础培养基的配方为：DMEM/F12培养基(购自Corning公司)+100 μg/mL Primocin(购自InvivoGen公司，0.2％(v/v)，市售产品浓度50mg/ml)。

在基础培养基内分别加入不同种类的添加剂(参见表1)配制成含 有不同添加成分的肺癌类器官培养基。

(2)肺癌原代细胞的分离和处理

1样品选择

肺癌胸水样品由专业医疗机构的专业医务人员从患者胸腔中获 取，患者均签署了知情同意书。胸水体积200-500毫升，冷链存储运输。

2材料准备

15mL无菌离心管、移液枪、10mL移液管、无菌枪头等表面消毒 后放入超净工作台中紫外照射30分钟。提前30分钟从4℃冰箱取出基 础培养基。

3样品分离

3.1将收集到的胸水每50毫升分至离心管中，室温2000rpm离心 10分钟；

3.2取出离心好的细胞，弃去上清，用30毫升基础培养基重悬； 过40微米筛网，倒扣筛网，用20毫升基础培养基反复冲洗筛网，确 保筛网上细胞尽可能多的被收集到50毫升离心管中；

3.3取收集后的细胞悬液，室温1500rpm离心5分钟。若含红细 胞，则加入3-5毫升红细胞裂解液在冰上裂解5-10分钟，裂解完全后 离心，室温1500rpm离心5分钟，得到细胞沉淀待用。

4肺癌原代细胞瑞氏-吉姆萨染色鉴定

4.1吸取10微升3.3中获取的细胞进行细胞涂片，室温晾干侯滴 入1滴瑞氏-吉姆萨A液，随后滴入3滴瑞氏-吉姆萨B液，混匀后染 色3分钟；

4.2流水冲洗(冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲去，以防有沉 渣沉淀在标本上)；

4.3干燥，镜下观察拍照，先低倍镜(10倍)拍照后高倍镜(40 倍)拍照。

5细胞计数及处理

5.1镜下观察：移取少量重悬细胞平铺于培养皿中，显微镜 (CNOPTEC，BDS400)下观察癌细胞密度和形态；

5.2活细胞计数：取重悬的细胞悬液12μL，12μL台盼蓝染液(生 产厂家：生工生物工程(上海)股份有限公司)充分混合后，取20μL 加入细胞计数板(生产厂家：Countstar，规格：50片/盒)，细胞计数 仪(Countstar，IC1000)下计算出活的大细胞(细胞粒径>10μm)百分率＝活细胞数/总细胞数*100％。

(3)肺癌类器官的培养

将上述步骤中获得的肺癌原代细胞用基础培养基重悬并计数，将 细胞密度稀释为5～10×10

表1培养基中的添加成分及促类器官增殖效果

其中，“+”表示与基础培养基相比，加入该添加剂的培养基对 从肺癌组织分离出的肺癌类器官中的至少两例有促进增殖的作用； “－”表示添加该添加剂的培养基对从肺癌组织分离出的肺癌类器官 中的至少一例显示有抑制增殖的作用；“○”表示添加该添加剂的培 养基对从肺癌组织分离出的肺癌类器官中的至少两例的增殖没有明显 的影响。

根据以上结果，拟选择化合物1、Y27632、SB202190、角化细胞 生长因子(KGF)、成纤维细胞生长因子10(FGF10)、A83-01、B27、 GlutaMAX、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、烟酰胺、神经调节蛋白1 (NRG1)和HEPES等因子进行进一步培养实验。

实施例2培养基添加因子的不同浓度对肺癌类器官的增殖作用

按照实施例1之(2)的方法从胸水样本(编号为OPB1、OPB2) 获得肺癌原代细胞，并使用下表2中的培养基配方进行类器官培养。

表2培养基配方(浓度为终浓度)

在使用配方1的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方1 的基础上分别添加配制好的B27每孔200μL，B27的终浓度分别为 1:25、1:50、1:100；并使用配方1的培养基设置对照孔(BC)。该系 列的培养基中其他添加因子的终浓度与LPOM培养基相同。以下配方1-12的实验也以同样的方式进行，不再赘述。

在使用配方2的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方2 的基础上分别添加配制好的FGF10每孔200μL，FGF10的终浓度分别 为200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL；并使用配方2的培养基设置对 照孔(BC)。

在使用配方3的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方3 的基础上分别添加配制好的SB202190细胞培养添加剂每孔200μL， SB202190细胞培养添加剂终浓度分别为200nM、500nM、1000nM； 并使用配方3的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方4的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方4 的基础上分别添加配制好的Y27632每孔200μL，Y27632的终浓度分 别为2.5μM、5μM、10μM；并使用配方4的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方5的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方5 的基础上分别添加配制好的A83-01每孔200μL，A83-01的终浓度分 别为200nM、500nM、1000nM；并使用配方5的培养基设置对照孔 (BC)。

在使用配方6的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方6 的基础上分别添加配制好的NRG1每孔200μL，NRG1终浓度分别为 1ng/mL、5ng/mL、40ng/mL；并使用配方6的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方7的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方7 的基础上分别添加配制好的IGF-1每孔200μL，IGF-1的终浓度分别为 2ng/mL、10ng/mL、40ng/mL；并使用配方7的培养基设置对照孔 (BC)。

在使用配方8的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方8 的基础上分别添加配制好的KGF每孔200μL，KGF的终浓度分别为2 ng/mL、10ng/mL、40ng/mL；并使用配方8的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方9的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方9 的基础上分别添加配制好的GlutaMAX每孔200μL，GlutaMAX的终 浓度分别为1:200、1:100、1:50；并使用配方9的培养基设置对照孔 (BC)。

在使用配方10的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方 10的基础上分别添加配制好的化合物1每孔200μL，化合物1的终浓 度分别为2.5μM、5μM、10μM；并使用配方10的培养基设置对照孔 (BC)。

在使用配方11的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方 11的基础上分别添加配制好的烟酰胺每孔200μL，烟酰胺的终浓度分 别为1mM、2.5mM、10mM；并使用配方12的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方12的培养基时，在接种有类器官的96孔板中在配方 12的基础上分别添加配制好的HEPES每孔200μL，HEPES的终浓度 分别为1mM、2.5mM、10mM；并使用配方12的培养基设置对照孔 (BC)。

12天后对所培养的类器官进行拍照，并测量统计类器官的直径大 小，比较各因子浓度对肺癌类器官增殖的促进作用。将2例样本收集 的数据汇总示于图1A～1L。图1A～1L中，比值为使用各培养基培养 12天得到的类器官直径与对应的BC对照孔培养12天得到的类器官直 径的比。比值大于1说明配制的含不同浓度的因子或小分子化合物的 培养基促增殖效果优于对照孔培养基；比值小于1，则说明配制的含不 同浓度的因子或小分子化合物的培养基促增殖效果较对照孔培养基促 增殖效果弱。

根据图1A～1L的结果，B27的体积浓度优选为1:25～1:100；成纤 维细胞生长因子10的含量优选为25～200ng/mL；SB202190的含量优 选为200～1000nM；Y27632的含量优选为2.5～10μM；A83-01的含 量优选为200～1000nM；神经调节蛋白1的含量优选为1～40ng/mL； IGF-1的含量优选为2～40ng/mL；角化细胞生长因子的含量优选为2～ 40ng/mL；GlutaMAX的体积浓度优选为1:50～1:200；MST1/2激酶抑 制剂化合物1的含量优选为2.5～10μM；烟酰胺的含量优选为1～10 mM；HEPES的含量优选为1～10mM。

实施例3肺癌类器官培养及鉴定

将按照实施例1之(2)所述方法获得的肺癌原代细胞(OPB1、 OPB2、OPB3)用本发明的肺癌类器官培养基LPOM重悬并计数，将 细胞密度稀释为5～10×10

在第5-16天，使用显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)观察培 养得到的肺癌类器官。图2A-2D的是显微镜下拍摄样本OPB1(第5 天，4倍镜)、OPB1(第10天，4倍镜)、OPB2(第16天，4倍镜)、 OPB2(第16天，10倍镜)培养后得到的肺癌类器官的照片。如图所 示，类器官在培养过程中体积是不断增大的，且不断形成类似微小组 织结构；样本OPB2在培养16天后可形成多种类型的结构，表示可以 在体外模拟体内肿瘤的异质性。

对培养得到的肺癌类器官进行病理和免疫组化鉴定，同时将对应 的原始胸水细胞进行病理和免疫组化鉴定，比较类器官和原始胸水病 理指标的一致性。

收集扩增好的肺癌类器官，按照标准的操作进行电镜分析。

图3A和3B为由样本OPB3体外培养后得到的肺癌类器官进行病 理和免疫组化鉴定的结果，分别为20倍物镜下拍照的图片。如图所示， 结果显示类器官的结构形态为癌组织形态；根据免疫组化指标判断该 例样本类器官培养后得到的细胞为肺癌细胞，且病理指标和胸水细胞 指标保持一致，表明使用本发明的培养基LPOM培养的肺癌类器官与 培养前的肺癌胸水组织样本的诊断结果一致。同时培养得到的类器官 在结构上较胸水细胞更复杂，更能反应体内复杂为微环境。

图4A和4B为由样本OPB3体外培养后得到的肺癌类器官进行电 镜检测的结果。如图4A和4B所示，在不同放大倍数下均能够观察到 类器官具有肺组织特有的肺纤毛结构，证明本发明的培养基培养得到 的类器官具有一定生理功能。

实施例4与现有培养基培养效果的比较

(1)对照培养基的配制

配制文献(Norman Sachs等，The EMBO Journal(2019)e100300) 中使用的培养基，其配方为Advanced DMEM/F12培养基(购自 Invitrogen公司)+1:100Penicillin/Streptomycin(购自Corning公司)+ 50μg/mLPrimocin(购自Invivogen公司)+1:100GlutaMAX(购自 Corning公司)+10mM HEPES(购自赛默飞公司)+1:50B27(购自Gibco公司)+1.25mmol/L N-乙酰半胱氨酸(购自MCE公司)+5 mmol/L烟酰胺(购自MCE公司)+500ng/mL R-Spondin 1(购自 sino biological公司)+25ng/mL角化细胞生长因子(购自sinobiological 公司)+100ng/mL成纤维细胞生长因子10(购自sino biological公司) +100ng/ml Noggin(购自sino biologica公司)+500nmol/L SB202190 (购自MCE公司)+500nmol/L A8301(购自MCE公司)+5μmol/L Y27632(购自MCE公司)。以下简称为ROM培养基。

(2)肺癌类器官培养

按照实施例1之(2)的方法从术中组织样本OPB8获得肺癌原代 细胞，并分别用LPOM培养基和ROM培养基按照实施例3的方法进 行类器官培养。

在培养第14天，使用显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)观察 培养得到的肺癌类器官。图5A和5B是4倍物镜下拍摄分别由LPOM 培养基和ROM培养基培养14天得到的类器官的照片。

根据图5A和5B的结果可知，与ROM培养基相比，LPOM培养 基能显著促进肺癌类器官的形成和扩增培养。

实施例5使用本发明的培养基扩增得到的肺癌类器官用于药物筛 选

(1)肺癌类器官培养

从肺癌术中样本(OPB6)按照实施例1之(2)的方法分离得到 肺癌原代细胞，并使用LPOM培养基进行类器官培养，超低吸附96 孔板中每孔1万细胞/100μL培养基，待肺癌类器官直径超过50μm时 进行药物筛选。

(2)筛选药物配制

如下所述配制10个浓度梯度的2种药物(硼替佐米和阿法替尼； 均购自MCE公司)，保存待用。

不同浓度硼替佐米和阿法替尼药物添加液的配制：将硼替佐米和 阿法替尼配制成10个不同浓度的储存液，最高浓度为20000μM，然 后2倍稀释比例进行稀释，得到10000μM、5000μM、2500μM、1250 μM、625μM、312.5μM、156.25μM、78.125μM和39.0625μM不同 浓度的储存液。

(3)加药

取出配制好的药物储存液，置于室温，将药物用LPOM培养基稀 释500倍后备用。从孵箱取出按照步骤(1)培养获得的类器官，将含 有药物的培养基按照每孔100μL沿着孔壁慢慢将入到96孔超低吸附 培养板中，最终得到测试药物浓度为20000nM、10000nM、5000nM、2500nM、1250nM、625nM、312.5nM、156.25nM、78.13nM和39.06 nM。加药结束后，96孔板表面消毒后移至培养箱中继续培养，5天后 测定类器官活力。

(4)类器官活力测试

4℃冰箱取出CellTiter-Glo发光试剂(购自Promega公司)，取10 毫升试剂于加样槽中，培养箱中取出待检测96孔板，每孔加入50μL CellTiter-Glo发光试剂，静置30分钟后观察96孔板中细胞状态，若细 胞大部分已经裂解，则轻轻震荡混匀，吸取100μL至另外一块白色96 孔板中，使用多功能酶标仪(Perkin Elmer公司Envision)检测。

(5)数据处理

按照公式药物抑制率(％)＝100％-(第五天培养孔化学发光数 值

工业应用性

本发明提供一种用于肺癌类器官培养的培养基及培养方法，可将 培养得到的类器官应用于药物的疗效评估和筛选。因而，本发明适于 工业应用。

尽管本文对本发明作了详细说明，但本发明不限于此，本技术领 域的技术人员可以根据本发明的原理进行修改，因此，凡按照本发明 的原理进行的各种修改都应当理解为落入本发明的保护范围。