金花茶萃取物的制备方法

分案说明

本申请是分案申请，其母案申请的申请号为201811613815.1、申请日为2018年12月27日，母案发明名称为金花茶萃取物用于提升抗醣化活性及抑制细胞脂肪堆积的用途。

技术领域

本发明涉及植物提取物，特别是有关于一种金花茶萃取物的制备方法。

背景技术

脂肪为人体内的必要成分，但过度的脂肪成分对人体会造成损害。

另外，中国台湾目前已成为「亚洲第一胖」的地区，18岁以上居民中，男性体重过重的比例为51.1％，女性体重过重的比例为35.8％，且比例还在上升中，甚至体重过重的年龄层也是逐年下降，中小学生体重过重的比例已上升至25％以上，是全球排名第八高的区域。因此肥胖是目前亟需解决的问题。

除此之外，醣化反应(glycation)与皮肤与体内老化相关，更与危害国人健康甚巨的糖尿病有关。醣化反应的本质就是梅纳反应(Maillard reaction)或称为羰胺褐变反应(carbonyl-amine browning)，这是糖的醛(酮)基与含胺基物质(例如蛋白质、胜肽、胺基酸、磷脂、核酸或上述的衍生物)的胺基之间的一种非酵素性醣化(nonenzymaticglycosylation；glycation)反应。长期处于高血糖症状下，会引起葡萄糖自动氧化与蛋白质糖化作用，形成高度醣化终产物(advanced glycation end products,AGEs)。而AGEs更可引起多种老化疾病，例如皮肤皱纹、白内障、粥状动脉硬化、肾脏衰竭等。

然而，目前被用来减脂及抗醣化的产品大多由化学成分所制成，长期使用不但对人体健康有害无益，且这些产品往往价格昂贵，并非为一般使用者所能负担。为了解决上述问题，本领域的技术人员亟需研发出具有减脂及抗醣化功效的新颖医药品或食品产品以造福有此需求的广大族群。

发明内容

有鉴于此，本发明目的为提供一种金花茶萃取物的制备方法，其包括下面步骤：粉碎金花茶；以萃取溶剂对粉碎后的金花茶在80±10℃下萃取0.5～2小时得到粗萃取物，其中萃取溶剂与粉碎后的金花茶的体积比是5～20：1～5，以及萃取溶剂是水、醇类、含水醇类或其组合；冷却粗萃取物至室温；对冷却后的粗萃取物进行离心并脱渣过滤，然后收集上清液；以滤网对上清液过滤而得到滤液；于55±10℃下对滤液进行减压浓缩而得到浓缩产物；以及对浓缩产物进行喷雾干燥而得到所述金花茶萃取。

在本发明的一实施例中，该金花茶萃取物的浓度为至少0.5mg/mL。

本发明的另一目的为提供一种金花茶萃取物用于制备一抑制细胞脂肪堆积的组合物的用途，其中该金花茶萃取物是以一溶剂萃取一金花茶所获得，该溶剂为水、醇、或醇水混合物。

在本发明的一实施例中，金花茶的产地是中国广州。

在本发明的一实施例中，粉碎后的金花茶为小于0.5cm的片段。

综上所述，本发明金花茶萃取物的功效在于：能提升其清除高度醣化终产物的能力、及抑制脂肪堆积的效果，以及减少细胞中脂肪的含量并达到减脂的效果。

以下将进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

附图说明

图1是本发明金花茶萃取物在抗醣化的功效的数据图；

图2是本发明金花茶萃取物在减脂的功效的数据图。

具体实施方式

定义

本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。

使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示，个此之间的差异以学生t检验(student's t-test)分析。

依据本发明，金花茶(Camellia chrysantha)是山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)的常绿灌木或小乔木，高可达6米，树皮灰白色，平滑。宽披针形至长椭圆形的叶子互生。金黄色花单生叶腋或近顶生，花瓣肉质，具蜡质光泽，开放时呈杯状、壶状或碗状，花直径可达6厘米；花瓣9～11枚；花期10～12月。金花茶为中国一级保护植物，富含400多种营养物质，有“茶族皇后”的美称，并享誉国际的东方茶。

依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠地道(parenterally)或口服地(orally)投药的剂型(dosage form)，这包括，但不限于：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterile powder)、锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)以及类似之物。

依据本发明的医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteral routes)来投药：腹膜内注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、肌肉内注射(intramuscular injection)以及静脉内注射(intravenous injection)。

依据本发明的医药品可包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，医药上可接受的载剂可包含一或多种选自于由下列所构成的群组中的试剂：溶剂(solvent)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似之物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)、含糖溶液、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)，以及它们的组合。

依据本发明，食品产品可被当作食品添加物(food additive)，藉由习知方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。

依据本发明，食品产品的种类包括但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食补充品(dietary supplements)。

实施例1.金花茶萃取物的制备

首先，将中国广州金花茶(Camellia chrysantha)粉碎成约小于0.5cm的片段，然后取粉碎后的金花茶于80±10℃下，萃取溶剂对金花茶以5～20：1～5的体积比进行萃取0.5～2小时而得到一粗萃取物，其中萃取溶剂是水、醇类、含水醇类或其组合。接着，冷却至室温，然后对粗萃取物以5000rpm进行离心10分钟并脱渣过滤，收集上清液。之后，以400网目(mesh)的滤网对上清液过滤而得到一滤液，然后于55±10℃下对滤液进行减压浓缩而得到一浓缩产物。接着，对浓缩产物进行喷雾干燥而得到金花茶萃取物。

实施例2.金花茶萃取物在抗醣化的效用评估

本实施例是为了测试本发明金花茶萃取物的抗醣化活性，因此以抑制D-果糖(D-fructose)使胶原蛋白(Collagen)产生醣化的效率，进行醣化活性的定量。首先，分别取0.2mL的水作为对照组，或取0.2mL的浓度为100mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、1mg/mL及0.5mg/mL的本发明金花茶萃取物分别作为实验组1～实验组5，加入0.2mL的含有0.06％的NaN

本实施例的结果显示于图1，抑制非酵素褐变，避免体内功能性蛋白质变性。图1是本发明金花茶萃取物在抗醣化上的功效的数据图。由图1可见，与对照组相较之下，实验组1～5的醣化比例百分比有显著的降低。其中，与对照组比较，实验组1的醣化比例百分比减少约85％。本实施例的结果显示，本发明金花茶萃取物能有效提升其清除高度醣化终产物的能力，并具有优异的抗醣化活性。

实施例3.金花茶萃取物在抑制脂肪堆积上的效用评估

本实施例以小鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cell)进行本发明的金花茶萃取物于抑制脂肪堆积的功效测试。该小鼠骨髓基质细胞是购自美国典型培养物保藏中心(美国

为证实本发明的金花茶萃取物具有抑制脂肪堆积的功效，首先将小鼠骨髓基质细胞分化成脂肪细胞，首先，将8×10

之后，将OP9细胞分成4组，其中包括1个对照组及3个实验组(亦即实验组1～3)。将0.5mg/mL金花茶萃取物、0.25mg/mL金花茶萃取物及0.125mg/mL金花茶萃取物分别添加至实验组1～实验组3的细胞中，至于对照组的细胞则不做任何处理。接着，将各组细胞培养7～10天，每3天更换培养基。

接着，使用油红O将细胞内的脂质染色，以评估本发明金花茶萃取物是否确实能减少脂肪堆积，首先将培养基轻轻地取出，并以1mL的磷酸盐缓冲溶液(Phosphate bufferedsaline,PBS)清洗细胞两次，再加入1mL的10％甲醛(购自Echo chemical，台湾，Cat.TG1794-4-0000-72NI)并于室温下反应30分钟以固定细胞，接着移除甲醛后以1mL的PBS轻轻地清洗细胞两次，接着于每孔细胞内加入1mL的60％异丙醇(购自Echo chemical，台湾，PH-3101)反应1分钟后，移除异丙醇并加入1mL的油红O作用溶液，于室温下反应1小时，接着移除油红O作用溶液并迅速地以1mL的60％异丙醇进行脱色5秒钟，再使用显微镜拍照并进行量化。接着，加入100％异丙醇于染色的细胞中，并置于振荡器上反应10分钟以溶解油滴，接着取100μL至96孔培养盘中，以测量ELISA读取仪(BioTek)读取各组的OD

本实施例的结果显示于图2。图2是本发明金花茶萃取物在抑制脂肪堆积上的功效的数据图。由图2可见，与对照组相较之下，实验组1～3的相对脂肪油滴量有降低的情形，且会随着金花茶萃取物浓度的增加而有明显的趋势。其中，与对照组比较，实验组1的相对脂肪油滴量减少约60％。本实施例的结果显示，本发明金花茶萃取物具有抑制细胞脂肪堆积的功效。

综上所述，本发明金花茶萃取物能提升其清除高度醣化终产物的能力、及抑制脂肪堆积的效果，以及减少细胞中脂肪的含量并达到减脂的效果。

以上所述仅为举例性，而非为限制性者。任何未脱离本发明的精神与范畴，而对其进行的等效修改或变更，均应包含于后附的申请专利范围中。