一种高比活中温淀粉酶突变体

技术领域

本发明涉及基因工程和蛋白质改造技术领域，具体涉及一种高比活中温淀粉酶突变。

背景技术

淀粉酶是一种重要的水解酶类，是水解淀粉和糖原的一类酶的总称，淀粉酶通常作用于直链淀粉、可溶性淀粉、糖元、糊精等α-1,4-葡聚糖糖苷键。淀粉酶分布广泛，几乎存在于所有的动植物和微生物中。最近统计表明淀粉酶产量已经占据酶制剂市场的30%左右，其广泛应用于淀粉制糖业、味精、啤酒等食品发酵行业、饲料以及造纸、纺织印染行业等。

α-淀粉酶是淀粉酶中应用最广泛的酶种，其可以随机地从内部切断淀粉、糖原内的α-1,4-葡萄糖苷键，将淀粉水解为糊精、低聚糖和单糖。根据其催化作用温度的不同，α-淀粉酶可分为低温α-淀粉酶、中温α-淀粉酶和耐高温α-淀粉酶。

中温淀粉酶在适宜的条件下，可以在淀粉分子内部任意切割α-1,4-葡萄糖苷键，使淀粉迅速降解，失去粘性，变成麦芽糖、葡萄糖和糊精等，这个过程通常被称之为淀粉的液化，因此α-淀粉酶被称为液化酶。其中，中温α-淀粉酶在pH6.0-6.5时较稳定，最适pH6.0，在pH5.0以下失活。其作用温度在60℃以下较为稳定，最适作用温度60-70℃。

中温淀粉酶在食品加工、医疗工业、造纸工业、饲料产业等都有较广泛的应用。此外，其在石油开采、有机合成、环境保护等方面的应用正逐步被研究。中温淀粉酶添加在饲料中能够提高幼龄动物生产性能，补充幼龄动物内源性淀粉酶分泌不足，减少各种应激反应对动物的影响，同时也可提高饲料利用率，提高生产性能；其内切效率高，能够高效分解饲料原料的淀粉，提高能量利用率，降低生产成本。

近年来，随着酶制剂工业的蓬勃发展，品种和产量不断增加，其应用领域也不断拓宽，作为酶制剂产品中重要的一种，中温淀粉酶必将发挥越来越重要的作用。但是由于目前天然微生物表达的中温淀粉酶的产量较低、稳定性差、生产成本高等缺点无法满足市场的需求，进一步阻碍了中温淀粉酶的广泛应用。为得到产量高、稳定性好、活性高的中温淀粉酶，可通过用不同的方式解决：1.通过基因工程改良；2.优化表达系统；3.寻找更合适的宿主等获得更高效价的菌株。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种高比活中温淀粉酶突变体。所述突变体的比活力显著高于野生型，可广泛应用于饲料、食品加工等领域。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明涉及一种淀粉酶突变体，其包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：26，69，265，351。

在本发明的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。

在一些更具体的实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。

在本发明的一些实施例中，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：V26F，N69D，S265K，F351M。

在本发明的一些实施例中，所述突变体包含的取代或取代的组合选自下述取代和取代的组合：

V26F；

N69D；

S265K；

F351M；

V26F/N69D；

V26F/S265K；

V26F/F351M；

N69D/S265K；

N69D/F351M；

S265K/F351M；

V26F/N69D/S265K；

V26F/N69D/F351M；

V26F/S265K/F351M；

N69D/S265K/F351M；

V26F/N69D/S265K/F351M。

本发明还涉及编码上述淀粉酶突变体的DNA分子。

本发明还涉及包含上述DNA分子的重组表达载体。

本发明还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。

将上述的质粒转入宿主细胞中，重组表达的淀粉酶突变体的比活力得到显著提升。

在本发明的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母（

本发明还提供了上述淀粉酶突变体在饲料生产或食品加工领域中的应用。

本发明以野生型中温淀粉酶ZD为基础，提供了包含V26F、N69D、S265K和F351M中至少一个突变位点的突变体。与野生型相比，本发明提供的淀粉酶单点突变体的比活力普遍提高了55.2%-147.2%；其中，含V26F单点突变的突变体ZD-1，其比活力最高，达2526 U/mg，取得了意料不到的技术效果。

本发明提供的V26F、N69D、S265K和F351M四个突变位点能显著提高中温淀粉酶ZD的比活力，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域的广泛应用。

具体实施方式

本发明公开了一种高比活的中温淀粉酶突变体、其制备方法及应用、编码该淀粉酶突变体的DNA分子、载体、宿主细胞，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECΜLAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLSIN MOLECΜLAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。例如，本发明可选用如下实验材料和试剂：

菌株与载体：大肠杆菌DH5α本公司保藏，毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、pPICZA、Amp、G418、Zeocin购自Invitrogen公司。

培养基：

LB培养基（大肠杆菌培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，pH7.0；

LB+Amp培养基：LB培养基加100μg/ml氨苄青霉素；

YPD培养基（酵母培养基）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；

YPD+Zeocin培养基：YPD培养基加100μg/ml Zeocin；

MD培养基（酵母筛选培养基）：1.34% YNB，4×10

BMGY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10

BMMY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10

实验试剂：DNA聚合酶购自Takara公司，T4连接酶、限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒和胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。

本发明实施例中所述淀粉酶的酶活检测方法参照GB/T24401-2009。

下面结合具体实施方式，对本发明做进一步阐述。

实施例1 中温淀粉酶基因合成

以中温淀粉酶基因（GenBank号为AXQ39825.1）的氨基酸序列为基础，分析该中温淀粉酶的氨基酸序列，去除其自身的信号肽，再根据毕赤酵母的密码子偏好性，对其进行密码子优化，由华大基因公司进行全基因合成。申请人将该中温淀粉酶命名为ZD，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

实施例2 高比活中温淀粉酶突变体的筛选

为了提高中温淀粉酶ZD2的比活力，申请人通过定向进化技术进行了大量突变的筛选。

设计PCR引物1(F)和引物1(R)：

引物1(F)：GCGC

引物1(R)：TAAA

以中温淀粉酶ZD的基因片段为模板，利用上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒（博迈斯）进行PCR扩增；胶回收PCR产物，

实验结果表明，有些突变对中温淀粉酶ZD的比活力没有影响，有些突变甚至使其比活力变得更低了。最终，申请人筛选到能显著提高中温淀粉酶ZD2比活力的突变位点：V26F，N69D，S265K，F351M。

本发明在野生型ZD的基础上，提供了分别包含V26F、N69D、S265K、F351M单个突变位点的突变体。其中：

将含V26F单点突变的淀粉酶突变体命名为ZD-1，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3；

将含N69D单点突变的淀粉酶突变体命名为ZD-2，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4；

将含S265K单点突变的淀粉酶突变体命名为ZD-3，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5；

将含F351M单点突变的淀粉酶突变体命名为ZD-4，其氨基酸序列为SEQ ID NO:6。

用引物1(F)和引物1(R)对上述各单点突变体进行PCR扩增，PCR条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，35个循环后，72℃保温10min。各突变体基因长度与ZD基因相同，全长1446bp。

实施例3 表达重组中温淀粉酶基因的毕赤酵母工程菌的构建

1、重组质粒的构建

将中温淀粉酶基因ZD以及四个突变体基因（ZD-1、ZD-2、ZD-3、ZD-4）分别用限制性内切酶

将双酶切后的中温淀粉酶基因片段分别与表达载体pPIC9K连接，连接体系如下：表达载体pPIC9K双酶切产物5 μl、中温淀粉酶基因双酶切产物3 μl、10×T

2、转化与筛选

将上述构建的重组酵母表达质粒分别用

3、摇瓶发酵验证

挑取单个多拷贝转化子分别接入BMGY培养基中，30℃、220rpm振荡培养24小时后，再转入BMMY培养基中，30℃、220rpm振荡培养，每24h添加0.5%的甲醇。诱导表达4d后，离心去除菌体，将上清液分别进行中温淀粉酶活力测定和蛋白含量测定，计算比活力，具体结果见表1。

表1 中温淀粉酶突变体的比活力比较

从表1的结果可知，在摇瓶水平下，表达野生型中温淀粉酶ZD的转化子中发酵上清液的比活力最高达到1022 U/mg；而表达分别包含V26F、N69D、S265K、F351M单点突变的突变体的转化子中发酵上清液的比活力提高了55.2%-147.2%；其中，含V26F单点突变的突变体ZD-1，其比活力最高，达2526 U/mg，取得了意料不到的技术效果。

本发明提供的V26F、N69D、S265K和F351M四个突变位点能显著提高中温淀粉酶ZD的比活力，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域的广泛应用。

（一）淀粉酶酶活检测方法

参考GB/T24401-2009方法。

（二）考马斯亮蓝法检测蛋白含量

1、试剂

（1）考马斯亮蓝G-250染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升，常温可使用1个月；

（2）标准蛋白溶液：用牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度，配制成1 mg/ml的蛋白质标准溶液；

（3）标准原液的配制：在分析天平上精确称取0.05g结晶牛血清蛋白，于小烧杯中，加入少量蒸馏水溶解后转入50ml容量瓶中，烧杯内残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，最后用蒸馏水定容至刻度。配制成标准原液，其中牛血清蛋白浓度为1000μg/ml。

2、标准曲线的绘制。

（1）分别取6支试管，编号，按下表加入试剂，混匀。

准确吸取2.5ml 考马斯亮蓝溶液于6支干净试管中，准确吸取上述各管溶液0.1ml，对应放于各自编号的试管中，涡旋混匀，室温放置5min后，以1号试管调零，测定在595nm处比色，记录吸光值。

（2）绘制标准曲线：记录1-6管所读吸光值，以蛋白质含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。注意，由于考马斯亮蓝染色能力强，比色杯一定要洗干净。不可用石英杯测定。

3、样品的测定

样品的准备：

（1）液体样品：将待测样品稀释至蛋白含量0.1-0.3mg/ml，控制除去空白后的吸光值（减去空白以后）在0.2-0.4之间；

（2）固体样品：准确称取1.0000g样品于100ml三角瓶中，用移液枪加入20ml去离子水，磁力搅拌10min，4000rpm离心10min，取上清进一步稀释测定蛋白含量，稀释方法参见液体样品。

样品检测：

取干净试管，加入到含有2.5ml考马斯亮蓝溶液，然后加入待测样品，涡旋震荡摇匀，室温放置5min，以标准曲线空白作对照，用1cm光径的微量比色杯在595nm测定吸光度，根据标曲求得蛋白含量。

4、蛋白含量计算

蛋白含量=X×稀释倍数×标样折算系数。

X：根据标曲求出的蛋白含量（mg/ml）；

标样折算值：标样为47mg/ml，根据实测值折算一个系数。

（三）比活力的计算

“比活力 (Specific Activity)”是指：单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用U/mg蛋白质来表示。一般来说，酶的比活力越高，酶越纯。

比活力计算公式：比活力（U/mg）=酶活（U/mL）/ 蛋白含量（mg/mL）。