猪繁殖与呼吸综合征病毒的抑制剂

与相关申请的交叉引用

本申请要求2020年5月29日提交的美国临时专利申请号63/031,631的优先权，所述临时申请整体通过参考并入本文。

联邦资助的研究

本发明在美国农业部/国家食品和农业研究院(U.S.Department ofAgriculture/National Institute of Food and Agriculture)授予的资助号为2017-67016-26675的政府支持下做出。美国政府在本发明中具有一定权利。

对序列表的参考

依照37C.F.R.§1.821(c)，本申请与计算机可读形式的序列表一起提交。所述通过EFS提交的文本文件“209670-9042-WO01_sequence_listing_27-MAY-2021_ST25.txt”于2021年5月27日创建，含有10个序列，文件大小为2.14千字节，并整体通过参考并入本文。

技术领域

本文描述了用于治疗或预防猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，具体来说通过靶向猪CD163-SRCR5来抑制PRRS病毒的组合物和方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是最具经济影响力的猪科动物疾病之一，每年对全球猪肉行业造成超过十亿美元的损失。PRRS的致病病毒(PRRSV)是巢病毒目(Nidovirales)中动脉炎病毒(Arterivirus)属的一种包膜正义单链RNA病毒。PRRSV感染在母猪中引起严重繁殖失败并在仔猪中引起呼吸疾病。这可能因具有甚至更大的临床表现和死亡率的继发感染而变得复杂。不幸的是，由于PRRSV的高度遗传和抗原异质性，仍然缺少广泛有效的疫苗。需要新的方法来对抗PRRS动物共患病以减轻这种疾病的毁灭性后果。

生产性PRRSV感染主要通过猪肺中的猪肺泡巨噬细胞(PAM)发生。CD163这种巨噬细胞特异性膜清道夫受体是PRRSV感染的关键受体。通过敲除研究证实了CD163表达对PRRSV感染的必要性，所述研究显示没有CD163的猪变得对PRRSV具有抗性。在CD163中的9个细胞外清道夫受体富含半胱氨酸(SRCR)结构域中，发现SRCR5对PRRSV感染至关重要，并且来自于表达具有缺失的SRCR5的CD163的猪的单核细胞/巨噬细胞完全免受PRRSV感染。细胞拉下测定和双分子荧光互补(BiFC)分析揭示出PRRSV通过其次要糖蛋白GP2a和GP4与CD163直接相互作用，所述糖蛋白结合CD163的胞外区但不结合跨膜或胞质区。因此，可以合理地假设CD163-SRCR5结构域与所述PRRSV糖蛋白直接相互作用。然而，尚未报道研究CD163-SRCR5结构域与PRRSV糖蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)的测定。

已鉴定到许多小分子通过结合并拮抗宿主细胞受体/辅助受体，有效地阻断各种不同人类病毒的进入。然而，尚未报道靶向PRRSV与CD163之间的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)的小分子。猪CD163 X-射线晶体结构的最新研究揭示出CD163-SRCR5结构域环5–6区(Phe 544–Arg 570)与其在SRCR超家族蛋白M2BP和CD5中的同源区相比独特的3-D结构排列。此外，在SRCR5的环5–6区中Arg 561改变成Ala的CD163突变体与野生型CD163相比抑制PRRSV感染。

因此，对于在Arg 561区处靶向猪CD163-SRCR5以预防PRRSV感染，存在着需求。

发明内容

本文公开了抗病毒组合物和使用此类组合物治疗受试者的方法。

一方面，本文描述了通过向有需要的受试者给药有效量的式I的化合物来治疗繁殖与呼吸综合征的方法：

其中：

R是

R

R

在某些实施方式中，R是

另一方面，本文描述了通过向有需要的受试者给药有效量的式I的化合物来抑制分化群163(CD163)的清道夫受体富含半胱氨酸结构域5(SRCR5)与动脉炎病毒的糖蛋白之间的相互作用的方法：

其中：

R是

R

另一方面，本文描述了治疗被动脉炎病毒感染的猪、改善其症状、预防所述感染或降低其病毒负荷的方法，所述方法包括给药治疗有效量的药物组合物，所述组合物包含一种或多种可药用赋形剂和一种或多种选自下述的化合物：

在某些实施方式中，一种或多种镇痛药、抗病毒药、抗感染药、祛痰药、减充血剂、退烧药或其他药剂被共同给药。在某些实施方式中，所述化合物的治疗有效量是约0.5mg/kg至约2.5mg/kg。

另一方面，本文描述了药物组合物，其包含：

有效量的式I的化合物：

其中：

R是

R

R

前提是：

(i)当R

(ii)当R

(iii)当R

一种或多种可药用赋形剂。

在某些实施方式中，R是

在某些实施方式中，R是

R

R

在某些实施方式中，R是

R

R

R

在某些实施方式中，R是

R

R

R

在某些实施方式中，所述化合物是式II或III之一：

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其中：

X是O、NH或CH

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本文还描述了药物组合物，其包含：

有效量的

和

一种或多种可药用赋形剂。

在某些实施方式中，所述可药用赋形剂包含缓冲剂、增溶剂、溶剂、抗微生物防腐剂、抗氧化剂、悬浮剂、片剂或胶囊稀释剂或片剂崩解剂。

在某些实施方式中，所述式I的化合物抑制分化群163(CD163)的清道夫受体富含半胱氨酸结构域5(SRCR5)与动脉炎病毒的糖蛋白之间的相互作用。另一方面，所述式I的化合物治疗动脉炎病毒感染、改善所述感染的症状或预防所述感染。另一方面，所述组合物包含约5mg至约400mg的式I的化合物。

本文还公开了一种药物剂型，其包含治疗有效量的本文描述的药物组合物。

一方面，所述治疗有效量的药物组合物包含约0.5mg/kg至约2.5mg/kg的式I的化合物。

本文还公开了本文描述的药物组合物用于通过向有需要的受试者给药有效量的式I的化合物来治疗繁殖与呼吸综合征的用途。

本文还公开了一种药剂盒，其包含本文描述的药物组合物的一种或多种剂型，并且还包含一个或多个包装、容器、递送装置、标签或使用说明书。

本文还公开了一种筛选能够与猪CD163-SRCR5结构域相互作用的生物活性化合物的方法，所述方法包括：(a)在处理器上进行计算机人工智能分子筛选，以鉴定能够与猪CD163-SRCR5结构域相互作用的化合物；和(b)在双分子荧光互补(BiFC)测定中测试在步骤(a)中鉴定的化合物抑制猪CD163-SRCR5结构域与GP2a或GP4之间的蛋白质-蛋白质相互作用的能力。在某些实施方式中，所述BiFC测定包括用表达CD163-SRCR5和GP2a或GP4的载体转染细胞，将转染的细胞与一定量感兴趣的化合物温育，并使用荧光显微镜评估所述细胞的CD163-SRCR5与GP2a或GP4之间的蛋白质-蛋白质相互作用。

附图说明

所述专利或申请文件含有至少一张彩图。本专利或专利申请出版物的带有彩图的副本在申请并付出必要费用后由专利局提供。

图1A–E示出了BiFC测定和筛选可以抑制PRRSV与CD163之间的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)的化合物。图1A示出了猪CD163SRCR或PRRSV次要包膜糖蛋白分别与维纳斯蛋白VN155(I152L)或VC155的片段之间的BiFC测定融合蛋白构建物的示意图。图1B示出了在用SRCR5-VN或SRCR2-VN质粒与GP2a-VC共转染24小时后HEK293T细胞的亮视野和荧光图像。标尺条＝250μm。条形图示出了相对细胞荧光。平均值±SD。n＝3。**：p<0.01。图1C示出了在用SRCR5-VN或SRCR2-VN质粒与GP2a-VC共转染24小时后HEK293T细胞的亮视野和荧光图像。标尺条＝250μm。条形图示出了相对细胞荧光相对荧光强度。平均值±SD，n＝3，**：p<0.01。图1D示出了SRCR5-VN和GP2a-VC蛋白之间的BiFC测定的亮视野和荧光图像。图像示出了化合物B7但不是B8的正抑制效应，使用DMSO作为对照。标尺条＝250μm。条形图示出了相对荧光强度。平均值±SD，n＝3。标志“a”、“b”和“ab”表示在Anova分析后通过Tukey事后检验得到的样品平均值的显著差异。平均值如果不共享同一个字母，则它们是不同的。图1E示出了SRCR5-VN与GP4-VC蛋白之间的BiFC测定的亮视野和荧光图像，显示了B7化合物但不是B8的相似抑制效应。标尺条＝120μm。条形图示出了相对荧光强度。平均值±SD，n＝3。标志“a”和“b”和表示在Anova分析后通过Tukey事后检验得到的样品平均值的显著差异。

图2示出了BiFC SRCR5-VN、SRCR2-VN和载体VN蛋白的Western印迹。

图3示出了用于虚拟筛选的CD163靶位点(示出了残基)。

图4示出了在与猪肺泡巨噬细胞(PAM)温育24h的B7的MTT测定中细胞存活率相对于B7浓度的图。注明了B7的IC

图5A–D示出了PAM的PRRSV感染被化合物B7抑制。图5A示出了在从用各种不同浓度的B7化合物处理的PRRSV毒株VR-2332感染的PAM提取的总RNA中PRRSV的qRT-PCR。平均值±SD，n＝3，***：p<0.001，n.s.：不显著。图5B示出了在如图5A中所述处理的PAM的培养基中PRRSV的滴定测定结果。条＝平均值±SD，n＝3，**：p<0.01，***：p<0.001，n.s.：不显著。图5C示出了在从被PRRSV的不同毒株感染并用15μM B7化合物处理的PAM提取的总RNA中PRRSV的qRT-PCR。值用PAM的GAPDH进行归一化。条＝平均值±SD，n＝3，**：p<0.01。图5D示出了在如图5C中所述处理的PAM的培养基中PRRSV的滴定测定结果。条＝平均值±SD，n＝3，**：p<0.01。

图6A–B示出了结构上与B7相似的化合物的PRRSV抑制效应的评估。图6A示出了B7类似物(B7-A1至B7-A6)的分子结构。图6B示出了SRCR5-VN与GP2a-VC蛋白之间的BiFC测定。代表性的荧光图像示出了化合物B7及其类似物对SRCR5/GP2a之间的蛋白质-蛋白质相互作用的不同影响，使用DMSO作为对照。标尺条＝250μm。

图7A–C示出了结构上与B7相似的化合物的PRRSV抑制效应。图7A示出了通过ImageJ定量的图6B中的相对荧光强度。平均值±SD，n＝3。**：p<0.01，***：p<0.001。n.s.：不显著。图7B示出了在从用15μM B7及其类似物处理的PRRSV毒株VR-2332感染的PAM提取的总RNA中PRRSV的qRT-PCR。值用PAM的GAPDH进行归一化。条＝平均值±SD，n＝3。*：p<0.05，**：p<0.01。图7C示出了在如图7B中所述处理的PAM的培养基中PRRSV的滴定测定结果。条＝平均值±SD，n＝3，*：p<0.05，**：p<0.01，n.s.：不显著。

图8示出了与PAM温育24h的B7及其类似化合物的MTT测定的结果。条＝平均值±SD，n＝3。

图9A–D示出了单独的3-(吗啉代磺酰基)苯胺或3-(哌啶基磺酰基)苯胺不抑制PRRSV感染并且B7后处理显著抑制PRRSV感染。图9A示出了B7-A7和B7-A8的分子结构。图9B示出了用B7、B7-A7或B7-A8处理并被PRRSV毒株V-2332感染的PAM的培养基的滴定测定的结果。条＝平均值±SD，n＝3，***：p<0.001，n.s.：不显著。图9C示出了从被PRRSV VR-2332感染并在接种前和/或接种后用15μM B7化合物处理的PAM提取的总RNA中PRRSV的qRT-PCR。值用PAM的GAPDH进行归一化。条＝平均值±SD，n＝3。*：p<0.05。n.s.：不显著。图9D示出了在如图9C中所述处理的PAM的培养基中PRRSV的滴定测定结果。条＝平均值±SD，n＝3，***：p<0.001，n.s.：不显著。

图10A–B示出了使用B7 IM注射(4mg/kg)的大鼠急性毒性研究的结果。图10A示出了在治疗前(第0天)和治疗后(第1-7天)对照和B7治疗的大鼠组的每日体温(左侧y-轴)和体重(g)(右侧y-轴)。平均值±SD，n＝4。图10B示出了在第7天通过心室穿刺抽血后大鼠的大体解剖的照片。

图11A–B示出了用对照或B7注射的大鼠的全血计数参数和统计显著性。图11A示出了B7与对照相比的嗜中性粒细胞、血红蛋白、淋巴细胞和红细胞比容水平。图11B示出了B7与对照相比的ALP和AST浓度。数据示出在表4中。

具体实施方式

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是影响全球猪肉行业的经济上最具毁灭性的疾病之一。PRRS由PRRS病毒(PRRSV)引起。目前不存在针对这种猪类疾病的有效治疗。通过人工智能分子筛选，获得了预测会靶向CD163这种对PRRSV感染特异的细胞表面受体的清道夫受体富含半胱氨酸结构域5(SRCR5)的一组小分子化合物。使用天然或合成化合物抑制PRRSV与CD163之间的关键PPI是对抗PRRS动物共患病的一种独特方法，其可用作疫苗接种的辅助治疗进一步减少病毒载量和脱落。开发了一种基于细胞的双分子荧光互补(BiFC)测定来研究PRRSV糖蛋白与CD163-SRCR5结构域之间的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)。使用BiFC测定，筛选了通过使用

定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。例如，本文中描述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交相结合使用的任何术语和所述领域的技术在本领域中是公知且常用的。在有冲突的情况下，以包括定义在内的本公开为准。下文描述了示例性方法和材料，尽管与本文中描述的相似或等同的方法和材料可用于本文中描述的实施方式和方面的实践和测试。

当在本文中使用时，术语“氨基酸”、“核苷酸”、“多核苷酸”、“载体”、“多肽”和“蛋白质”具有本领域普通技术的生化学家会理解的它们的常用含义。在本文中使用标准的单字母核苷酸(A、C、G、T、U)和标准的单字母氨基酸(A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y)。

当在本文中使用时，诸如“包括”、“含有”、“具有”等的术语意味着“包含”。本公开还设想了“包含”本文中呈现的实施方式或要素、“由它们组成”和“基本上由它们组成”的其他实施方式，不论是否明确阐述。

当在本文中使用时，在本公开的情形中(特别是在权利要求书的情形中)使用的没有具体数目的指称应该被解释为涵盖单数和复数两者，除非本文中另有指明或明显与上下文矛盾。此外，除非另有指明，否则没有具体数目的指称意味着“一个或多个”。

当在本文中使用时，术语“或”可以是连词或反意连词。

当在本文中使用时，术语“基本上”意味着极大或显著程度，但不完全。

当在本文中使用时，除非另有指明，否则所有百分率(％)均是指质量(或重量，w/w)百分数。

当在本文中使用时，术语“约”或“大约”在应用于一个或多个感兴趣的值时，是指与所陈述的参比值相近或在所述特定值的可接受的误差范围内的值，所述可接受的误差范围由本领域普通技术人员确定，并且部分依赖于所述值如何测量或确定，例如测量系统的限制。在一种情况下，术语“约”是指在被术语“约”修饰的值的至多±10％的变动范围内的任何值，包括整数和分数分量两者。或者，根据本领域中的做法，“约”可以意味着在3个或更多个标准偏差以内。或者，例如对于生物系统或过程来说，术语“约”可以意味着在值的一个数量级以内，在某些实施方式中在5倍以内，在某些实施方式中在2倍以内。当在本文中使用时，符号“～”意味着“约”或“大约”。

本文公开的所有范围包括作为离散值的两个端点以及所述范围内指定的所有整数和分数。例如，0.1–2.0的范围包括0.1、0.2、0.3、0.4……2.0。如果端点被术语“约”修饰，则指定的范围将被扩大至所述范围内的任何值、包括端点的至多±10％或3个或更多个标准偏差以内的变动。

当在本文中使用时，术语“活性成分”或“活性药物成分”是指提供药理、通常是有益效果的药剂、活性成分、化合物或物质、组合物或其混合物。

当在本文中使用时，术语“对照”或“参比”在本文中可互换使用。“参比”或“对照”水平可以是预定值或范围，其被用作基线或基准，针对它们来评估实测结果。“对照”也指对照实验或对照细胞。

当在本文中使用时，术语“药剂”表示包括细胞在内的任何形式的活性成分制剂或组合物，其含有通过至少一次或多次给药足以启动或产生治疗效果的量。“制剂”和“组合物”在本文中可互换使用。

当在本文中使用时，术语“预防”是指以统计显著的程度或本领域普通技术人员可检测的程度阻止或减少障碍的进展。

当在本文中使用时，短语本文描述的化合物的“有效量”或“治疗有效量”是指本文描述的化合物会引发受试者的生物学或医学响应例如酶或蛋白质活性的降低或抑制，或改善症状、缓解病症、减缓或延迟疾病进展或预防疾病等的量。结果可以是疾病的征兆、症状或病因的减少或减轻或生物系统的任何其他所需变化。有效量可以基于每位受试者个体的因素，包括但不限于受试者的年龄、体型、疾病类型或程度、疾病阶段、给药途径、使用的补充疗法的类型或程度、正在进行的疾病过程和所需治疗的类型。

在一个实施方式中，术语“治疗有效量”是指本文描述的化合物在给药到受试者时有效地至少部分缓解、阻止和/或改善病症或障碍或病毒感染、呼吸病症、繁殖病症、先天性呼吸障碍、发热、嗜睡、食欲不振、死产、早产、流产、断奶后呼吸疾病、呼吸窘迫、抑郁、耳、腹和外阴发绀或呕吐的量。在一个实施方式中，术语“治疗有效量”是指本文描述的化合物在给药到细胞或组织或非细胞生物材料或介质时有效治疗或改善病毒感染、细胞或组织死亡或蛋白质-蛋白质相互作用的量。

当在本文中使用时，术语“受试者”是指动物。通常，所述受试者是哺乳动物。受试者也指灵长动物(例如人类，男性或女性，婴儿、青少年或成人)、非人类灵长动物、大鼠、小鼠、兔、猪、奶牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、鱼、鸟等。在一个实施方式中，所述受试者是灵长动物。在一个实施方式中，所述受试者是人类。在一个实施方式中，所述受试者是猪。

当在本文中使用时，如果受试者会在生物学、医学或生命质量上从治疗获益，则此类受试者是“需要治疗的”。需要治疗的受试者不必定表现出症状，特别是在预防性治疗的情况下。

当在本文中使用时，术语“抑制”是指给定生物过程、病症、症状、障碍或疾病的减轻或抑制或生物活性或过程的基线活性的显著降低。

当在本文中使用时，“治疗”是指疾病的预防，阻止、抑制、阻遏、逆转、减轻、改善或抑制包括障碍或疾病在内的生物过程的进展，或完全消除疾病。治疗可以以急性或慢性方式进行。术语“治疗”也指在患病之前降低所述疾病或与这种疾病相关的症状的严重程度。“阻遏”或“改善”疾病、障碍或其症状涉及在此类疾病、障碍或其症状临床出现后向受试者给药本文描述的细胞、组合物或化合物。“预防”或“阻止”疾病、障碍或其症状涉及在所述疾病、障碍或其症状发作之前向受试者给药本文描述的细胞、组合物或化合物。“抑制”疾病或障碍涉及在诱导所述疾病或障碍之后但在其临床表象或症状显现之前向受试者给药本文描述的细胞、组合物或化合物。

当在本文中使用时，“制剂”和“组合物”可互换使用，并且是指至少两种成分的组合。在某些实施方式中，至少一种成分可以是活性药剂或具有在给药到受试者时发挥生理活性的特性。当在本文中使用时，“治疗组合物”和“药物组合物”可互换使用，并且是指至少两种成分的组合。

特定官能团和化学术语的定义在本文中更详细描述。化学元素按照元素周期表(Periodic Table of the Elements，CAS版本，《化学和物理学手册》(Handbook ofChemistry and Physics)，第75版，内封面)来鉴定，特定官能团总体上如其中所述来定义。此外，有机化学的通用原理以及特定功能性组成部分和反应性描述在下述文献中：ThomasSorrell，《有机化学》(Organic Chemistry)，University Science Books,Sausalito,1999；Smith和March，《March高等有机化学》(March’s Advanced Organic Chemistry)，第5版，John Wiley&Sons,Inc.,New York,2001；Larock，《有机转化详解》(ComprehensiveOrganic Transformations)，VCH Publishers,Inc.,New York,1989；和Carruthers，《有机合成的一些现代方法》(Some Modern Methods of Organic Synthesis)，第3版，CambridgeUniversity Press,Cambridge,1987。

当在本文中使用时，术语“烷基”是指具有1至6个碳原子的直链或支链饱和烃基的游离基(“C

当在本文中使用时，术语“亚烷基”是指烷基的二价游离基，例如–CH

当在本文中使用时，术语“杂烷基”是指还包括在母体链内(即插入到其相邻的碳原子之间)或放置在母体链的一个或多个末端位置处的至少一个选自氧、氮或硫的杂原子(例如1、2、3或4个杂原子)的烷基。在某些实施方式中，杂烷基是指具有1至10个碳原子和母体链内的一个或多个杂原子的饱和基团(“杂C

当在本文中使用时，术语“亚杂烷基”是指杂烷基的二价游离基。

当在本文中使用时，术语“烷氧基”是指-O-烷基游离基。在某些实施方式中，所述烷氧基是甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基和1,2-二甲基丁氧基。在某些实施方式中，烷氧基是低级烷氧基，即具有1至6个碳原子。在某些实施方式中，烷氧基具有1至4个碳原子。

当在本文中使用时，术语“芳基”是指具有指定数目的环碳原子的稳定的芳香族单环或双环游离基。芳基的实例包括但不限于苯基、1-萘基、2-萘基等。同样，相关术语“芳环”是指具有指定数目的环碳原子的稳定的芳香族单环或双环。

当在本文中使用时，术语“杂芳基”是指具有指定数目的环原子并包含一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的稳定的芳香族单环或双环游离基。所述杂芳基游离基可以通过碳原子或杂原子成键。杂芳基的实例包括但不限于呋喃基、吡咯基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、

当在本文中使用时，术语“碳环基”是指具有指定数目的环碳原子的稳定的饱和或不饱和非芳香族单环或双(稠合、桥接或螺接)环游离基。碳环基的实例包括但不限于上文指定的环烷基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基等。在一个实施方式中，所述指定数目是C

当在本文中使用时，术语“杂环基”是指具有指定数目的环原子并包含一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的稳定的饱和或不饱和非芳香族单环或双(稠合、桥接或螺接)环游离基。所述杂环基游离基可以通过碳原子或杂原子成键。在一个实施方式中，所述指定数目是C

当在本文中使用时，术语“卤”或“卤素”是指氟(氟代，-F)、氯(氯代，-Cl)、溴(溴代，-Br)或碘(碘代，-I)。

当在本文中使用时，术语“取代的”不论前方是否具有术语“任选”，均意味着指定组成部分的一个或多个氢被适合的取代基代替。

当在本文中使用时，每个表述例如烷基、m、n等的定义当在任何结构中出现超过一次时，打算独立于它在同一结构中别处的定义。

药物组合物

本文公开了药物组合物，其包含：

有效量的式I的化合物：

其中：

R是

R

R

前提是：

当R

当R

当R

一种或多种可药用赋形剂。

在某些实施方式中，R是

在某些实施方式中，R是

R

R

在某些实施方式中，R是

R

R

R

在某些实施方式中，R是

R

R

R

在某些实施方式中，所述化合物是式II或III之一：

其中：

X是O、NH或CH

R

本文还公开了药物组合物，其包含：

有效量的

和

一种或多种可药用赋形剂。

在某些实施方式中，所述可药用赋形剂包含缓冲剂、增溶剂、溶剂、抗微生物防腐剂、抗氧化剂、悬浮剂、片剂或胶囊稀释剂或片剂崩解剂。在某些实施方式中，所述式I的化合物抑制分化群163(CD163)的清道夫受体富含半胱氨酸结构域5(SRCR5)与动脉炎病毒的糖蛋白之间的相互作用。在某些实施方式中，所述式I的化合物治疗动脉炎病毒感染、改善所述感染的症状或预防所述感染。在某些实施方式中，所述组合物包含约5mg至约400mg的式I的化合物。

本文还公开了一种药物剂型，其包含治疗有效量的本文描述的药物组合物。

在某些实施方式中，所述治疗有效量的药物组合物包含约0.5mg/kg至约2.5mg/kg的式I的化合物。

本文还公开了本文描述的药物组合物用于通过向有需要的受试者给药有效量的式I的化合物来治疗繁殖与呼吸综合征的用途。

本文还公开了药剂盒，其包含本文描述的药物组合物的一种或多种剂型。在某些实施方式中，所述药剂盒还包含一个或多个包装、容器、递送装置、标签和/或使用说明书。

药物组合物

本文公开的组合物可以被并入到适合于给药到受试者(例如可以是人类或非人类的患者)的药物组合物中。为了给药到受试者，可以制备所述药物组合物。此类药物组合物可以以医学、兽医和制药领域的技术人员公知的剂量和技术，考虑到诸如特定受试者的年龄、性别、体重和状况以及给药途径等因素进行给药。

所述药物组合物和制剂可以包含可药用载体。当在本文中使用时，术语“可药用载体”意味着任何类型的无毒惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或配制辅料。可以充当可药用载体的示例性材料是：糖类，例如但不限于乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如但不限于玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如但不限于羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和纤维素乙酸酯；黄耆胶粉；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如但不限于可可脂和栓剂用蜡；油，例如但不限于花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；酯类，例如但不限于油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如但不限于氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇和磷酸盐缓冲溶液，以及其他无毒相容性润滑剂，例如但不限于月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和香料，根据配方师的判断，防腐剂和抗氧化剂也可以出现在组合物中。

因此，所述化合物和它们的可药用盐可以被配制用于通过例如注射、吸入(通过口或鼻)、固体给药、眼滴剂、在局部油基制剂中、植入物、口、颊、肠胃外或直肠给药来给药。技术和制剂通常可以在《Remington制药学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(Meade Publishing Co.,Easton,Pa.)中找到。治疗组合物通常必须是无菌的，并且在制造和储存条件下稳定。

本公开的化合物的给药途径和组合物的形式决定待使用的载体的类型。所述组合物可以采取各种不同的形式，以例如适合于系统给药(例如口、直肠、鼻、舌下、颊、植入物或肠胃外)或局部给药(例如皮肤、肺、鼻、耳、眼、脂质体递送系统或离子电渗)。

用于系统给药的载体通常包括稀释剂、润滑剂、黏合剂、崩解剂、着色剂、调味剂、甜味剂、抗氧化剂、防腐剂、助流剂、溶剂、悬浮剂、润湿剂、表面活性剂中的至少一者及其组合等。所有载体在组合物中均为任选的。

适合的稀释剂包括糖类，如葡萄糖、乳糖、右旋糖和蔗糖；二醇，如丙二醇；碳酸钙；碳酸钠；糖醇，如甘油；甘露糖醇；和山梨糖醇。系统或局部组合物中稀释剂的量通常为约50％至约90％。

适合的润滑剂包括但不限于二氧化硅、滑石、硬脂酸及其镁盐和钙盐、硫酸钙；以及液体润滑剂如聚乙二醇和植物油如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可属植物的油。系统或局部组合物中润滑剂的量通常为约5％至约10％。

适合的黏合剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮；硅酸镁铝；淀粉如玉米淀粉和马铃薯淀粉；明胶；黄耆胶；以及纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素，甲基纤维素、微晶纤维素和羧甲基纤维素钠。系统组合物中黏合剂的量通常为约5％至约50％。

适合的崩解剂包括但不限于琼脂、藻酸及其钠盐、泡腾混合物、交联羧甲基纤维素、交联聚维酮、羧甲基淀粉钠、淀粉乙醇酸钠、黏土和离子交换树脂。系统或局部组合物中崩解剂的量通常为约0.1％至约10％。

适合的着色剂包括但不限于诸如FD&C染料的着色剂。在使用时，系统或局部组合物中着色剂的量通常为约0.005％至约0.1％。

适合的调味剂包括但不限于薄荷醇、胡椒薄荷和水果调味剂。在使用时，系统或局部组合物中调味剂的量通常为约0.1％至约1.0％。

适合的甜味剂包括但不限于阿斯巴甜和糖精。系统或局部组合物中甜味剂的量通常为约0.001％至约1％。

适合的抗氧化剂包括但不限于丁基化羟基茴香醚(“BHA”)、丁基化羟基甲苯(“BHT”)和维生素E。系统或局部组合物中抗氧化剂的量通常为约0.1％至约5％。

适合的防腐剂包括但不限于苯扎氯胺、对羟基苯甲酸甲酯和苯甲酸钠。系统或局部组合物中防腐剂的量通常为约0.01％至约5％。

适合的助流剂包括但不限于二氧化硅。系统或局部组合物中助流剂的量通常为约1％至约5％。

适合的溶剂包括但不限于水、等渗盐水、油酸乙酯、甘油、羟基化蓖麻油、醇类例如乙醇和磷酸盐缓冲溶液。系统或局部组合物中溶剂的量通常为约0％至约100％。

适合的悬浮剂包括但不限于AVICEL RC-591(来自于FMC Corporation ofPhiladelphia,PA)和藻酸钠。系统或局部组合物中悬浮剂的量通常为约1％至约8％。

适合的表面活性剂包括但不限于卵磷脂、聚山梨醇酯80和月桂基硫酸钠和

尽管系统组合物中组分的量可以根据所制备的系统组合物的类型而变，但一般来说，系统组合物包括约0.01％至约50％的活性化合物和约50％至约99.99％的一种或多种载体。用于肠胃外给药的组合物通常包括约0.1％至约10％的活性化合物和约90％至约99.9％的包括稀释剂和溶剂在内的载体。

用于口服给药的组合物可以具有液体形式。例如，适合的液体形式包括水性溶液、乳液、悬液、从非泡腾颗粒重构的溶液、从非泡腾颗粒重构的悬液、从泡腾颗粒重构的泡腾制剂、酏剂、酊剂、糖浆等。口服给药的液体组合物通常包含本公开的化合物和载体，即选自稀释剂、着色剂、调味剂、甜味剂、防腐剂、溶剂、悬浮剂和表面活性剂的载体。在某些实施方式中，经口液体组合物包含选自着色剂、调味剂和甜味剂的一种或多种成分。

可用于获得主题化合物的系统递送的其他组合物包括舌下、颊和鼻剂型。此类组合物通常包含一种或多种可溶性填充物质，例如稀释剂包括蔗糖、山梨糖醇和甘露糖醇；以及黏合剂例如阿拉伯胶、微晶纤维素、羧甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素。此类组合物还可以包含润滑剂、着色剂、调味剂、甜味剂、抗氧化剂和/或助流剂。

与本公开的化合物联合使用的载体的量足以提供所述化合物的每个单位剂量的用于给药的实际量的组合物。用于制备可用于本发明的方法的剂型的技术和组合物被描述在下述参考文献中：《现代制药学》(Modern Pharmaceutics)，第9和第10章，Banker&Rhodes主编(1979)；Lieberman等，《药物剂型：片剂》(Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets)(1981)；和Ansel，《药物剂型简介》(Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms)，第2版(1976)。

可用于本文描述的组合物的药物赋形剂包括但不限于：酸化剂(乙酸、冰醋酸、柠檬酸、富马酸、盐酸、稀盐酸、苹果酸、硝酸、磷酸、稀磷酸、硫酸、酒石酸)；碱化剂(氨溶液、碳酸铵、二乙醇胺、二异丙醇胺、氢氧化钾、碳酸氢钠、硼酸钠、碳酸钠、氢氧化钠、三乙醇胺)；消泡剂(二甲基硅氧烷、二甲基硅油)；抗微生物防腐剂(苯扎氯铵、苯扎氯胺溶液、苄索氯铵、苯甲酸、苯甲醇、对羟基苯甲酸丁酯、鲸蜡基氯化吡啶、氯丁醇、氯甲酚、甲酚、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯钠、苯酚、苯乙醇、苯基乙酸汞、苯基硝酸汞、苯甲酸钾、山梨酸钾、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丙酯钠、苯甲酸钠、脱氢乙酸钠、丙酸钠、抗坏血酸、硫柳汞、百里酚)；抗氧化剂(抗坏血酸、棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、次磷酸、单硫代甘油、没食子酸丙酯、甲醛次硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、二氧化硫、生育酚、生育酚类赋形剂)；缓冲剂(乙酸、碳酸铵、磷酸铵、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸、柠檬酸钾、偏磷酸钾、磷酸二氢钾、乙酸钠、柠檬酸钠、乳酸钠溶液、磷酸二钠、磷酸一钠)；螯合剂(依地酸二钠、乙二胺四乙酸及其盐、依地酸)；包衣剂(羧甲基纤维素钠、纤维素乙酸酯、邻苯二甲酸乙酸纤维素、乙基纤维素、明胶、药用釉、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸共聚物、甲基纤维素、聚乙酸乙烯酯邻苯二甲酸酯、虫胶、蔗糖、二氧化钛、巴西棕榈蜡、微晶蜡、玉米醇溶蛋白)；着色剂(焦糖色、红色、黄色、黑色或掺混物、氧化铁)；络合剂(乙二胺四乙酸及其盐(EDTA)、依地酸、龙胆酸乙醇酰胺、硫酸羟基喹啉)；干燥剂(氯化钙、硫酸钙、二氧化硅)；乳化和/或增溶剂(阿拉伯胶、胆固醇、二乙醇胺(辅料)、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂醇、单甘油酯和双甘油酯、单乙醇胺(辅料)、卵磷脂、油酸(辅料)、油醇(稳定剂)、泊洛沙姆、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯35蓖麻油、聚氧乙烯40氢化蓖麻油、聚氧乙烯10油基醚、聚氧乙烯20鲸蜡硬脂基醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、二乙酸酯、单硬脂酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸钠、失水山梨糖醇单月桂酸酯、失水山梨糖醇单油酸酯、失水山梨糖醇单棕榈酸酯、失水山梨糖醇单硬脂酸酯、硬脂酸、三乙醇胺、乳化蜡)；助滤剂(粉状纤维素、纯化硅藻土)；调味剂和香料(茴香脑、苯甲醛、乙基香草醛、薄荷醇、水杨酸甲酯、谷氨酸单钠、橙花油、胡椒薄荷、胡椒薄荷油、胡椒薄荷精、玫瑰油、浓玫瑰水、百里酚、托鲁香脂酊、香草、香草酊、香草醛)；保湿剂(甘油、己二醇、山梨糖醇)；增塑剂(例如蓖麻油、二乙酰化单甘油酯、邻苯二甲酸二乙酯、甘油、单乙酰化和二乙酰化的单甘油酯，丙二醇、三乙酸甘油酯、柠檬酸三乙酯)；聚合物(例如纤维素乙酸酯、烷基纤维素、羟烷基、丙烯酸聚合物和共聚物)；溶剂(丙酮、醇、稀释醇、水合戊烯、苯甲酸苯甲酯、丁醇、四氯化碳、氯仿、玉米油、棉籽油、乙酸乙酯、甘油、己二醇、异丙醇、甲醇、二氯甲烷、甲基异丁基酮、矿物油、花生油、碳酸丙二酯、芝麻油、注射用水、无菌注射用水、无菌灌溉用水、纯净水)；吸附剂(纤维素粉、木炭、纯化硅藻土)；二氧化碳吸附剂(氢氧化钡石灰、苏打石灰)；硬化剂(氢化蓖麻油、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、鲸脂蜡、硬脂肪、石蜡、聚乙烯赋形剂、硬脂醇、乳化蜡、白蜡、黄蜡)；悬浮剂和/或增粘剂(阿拉伯胶、琼脂、藻酸、单硬脂酸铝、膨润土、纯化膨润土、乳浆膨润土、卡波姆、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钠卡拉胶、微晶和羧甲基纤维素钠纤维素、糊精、明胶、瓜尔胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硅酸镁铝、甲基纤维素、果胶、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚维酮、藻酸盐、二氧化硅、胶态二氧化硅、藻酸钠、黄原胶)；甜味剂(阿斯巴甜、淀粉水解寡糖(dextrates)、右旋糖、赋形剂右旋糖、果糖、甘露糖醇、糖精、糖精钙、糖精钠、山梨糖醇、山梨糖醇溶液、蔗糖、可压缩糖、糖果用糖、糖浆)；表面活性剂(二甲基硅油)；片剂黏合剂(阿拉伯胶、藻酸、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、糊精、乙基纤维素、明胶、液体葡萄糖、瓜尔胶、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、聚氧化乙烯、聚维酮、预明胶化淀粉、糖浆)；片剂和/或胶囊稀释剂(碳酸钙、磷酸二钙、磷酸三钙、硫酸钙、微晶纤维素、粉状纤维素、淀粉水解寡糖、糊精、右旋糖赋形剂、果糖、高岭土、乳糖、甘露糖醇、山梨糖醇、淀粉、预明胶化淀粉、蔗糖、可压缩糖、糖果用糖)；片剂崩解剂(藻酸、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、波拉克林钾、乙醇酸淀粉钠、淀粉、预明胶化淀粉)；片剂和/或胶囊润滑剂(硬脂酸钙、山嵛酸甘油酯、硬脂酸镁、轻质矿物油、硬脂基富马酸钠、硬脂酸、纯化硬脂酸、滑石、氢化植物油、硬脂酸锌)；增稠剂(凝胶强度为50-100的明胶)；张度剂(右旋糖、甘油、甘露糖醇、氯化钾、氯化钠)；媒介物：调味和/或增甜(芳香酏、化合物苯甲醛酏、等醇酏、胡椒薄荷水、山梨糖醇溶液、糖浆、托鲁香脂糖浆)；媒介物：含油(杏仁油、玉米油、棉籽油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油、轻质矿物油、肉豆蔻醇、辛基十二醇、橄榄油、花生油、桃仁油、芝麻油、大豆油、角鲨烷)；媒介物：固体载体(糖球)；媒介物：无菌(注射用抑菌水、抑菌氯化钠注射液)；增黏(参见悬浮剂)；拒水剂(环甲氧硅油、二甲基硅氧烷、二甲基硅油)；和/或增溶剂(苯扎氯铵、苄索氯铵、鲸蜡基氯化吡啶、多库酯钠、壬基酚聚醚9、壬基酚聚醚10、辛基酚聚醚9、泊洛沙姆、聚氧乙烯35蓖麻油、聚氧乙烯40氢化蓖麻油、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯10油基醚、聚氧乙烯20鲸蜡基醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、月桂基硫酸钠、失水山梨糖醇单月桂酸酯、失水山梨糖醇单油酸酯、失水山梨糖醇单棕榈酸酯、失水山梨糖醇单硬脂酸酯、泰洛沙泊)。这个名单不打算是排他性的，而是仅仅代表了赋形剂的类别和可用于本文描述的口服剂型中的特定赋形剂。参见《Remington制药学基础》(Remington’s Essentials of Pharmaceutics)，PharmaceuticalPress Publishing Company,London,UK，第1版，2013和《药物赋形剂手册》(Handbook ofPharmaceutical Excipients)，第8版，Pharmaceutical Press Publishing CompanyLondon,UK,2017，每个所述文献的此类教导通过参考并入本文。

本文还描述了制造剂型的方法，包括配制本文描述的组合物，所述剂型包括喷剂、胶囊、片剂、酏剂、乳液、含片、悬液、糖浆、丸剂、洗剂、表皮贴片、栓剂、吸入剂或注射剂。可以使用本领域已知的用于将提取物或活性精华成分配制成洗剂、皂等的任何方法。

可药用盐

本公开的化合物可以作为可药用盐存在。术语“可药用盐”是指化合物的可以溶解或分散在水或油中，适合于治疗障碍而没有过多毒性、刺激性和过敏反应，与合理的利益/风险比相称并且对它们的目标用途有效的盐或两性离子。所述盐可以在所述化合物的最终分离和纯化期间制备，或通过将所述化合物的氨基与适合的酸反应独立地制备。例如，可以将化合物溶解在适合的溶剂例如但不限于甲醇和水中，并用至少一个当量的酸例如盐酸处理。得到的盐可以沉淀出来，通过过滤分离并在减压下干燥。或者，可以在减压下除去所述溶剂和过量的酸，以提供盐。代表性的盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、甲酸盐、羟乙基磺酸盐、富马酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、草酸盐、马来酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、谷氨酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐等。所述化合物的氨基也可以用烷基氯化物、溴化物和碘化物例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、月桂基、肉豆蔻基、硬脂基等季铵化。

碱加成盐可以在本公开的化合物的最终分离和纯化期间，通过羧基与适合的碱例如金属阳离子如锂、钠、钾、钙、镁或铝的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐或有机伯胺、仲胺或叔胺的反应来制备。可以制备季胺盐，例如源自于甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺、三丁胺、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二环己胺、普鲁卡因、二苯甲胺、N,N-二苯甲基苯乙胺、1-ephenamine、N,N′-二苯甲基乙二胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等的季胺盐。

治疗方法

在某些实施方式中，本文描述的化合物和药物组合物可用于在有需要的受试者中治疗本文描述的障碍。

当在本文中使用时，术语“受试者”和“患者”可互换使用，是指任何脊椎动物，包括都不限于哺乳动物和人类。在某些实施方式中，所述受试者可以是猪。在某些实施方式中，所述受试者正经历治疗形式。

术语“剂量”和“药剂”被理解为意味着活性药剂的适合于给药到受试者以便实现或以其他方式有助于治疗效果的量。在某些实例中，剂量单位是指给药到受试者，易于操作和包装并保持为物理和化学上稳定的单位剂量的单份药剂。

给药

所述药物组合物和制剂可以包含“治疗有效量”或“预防有效量”的所述药剂。“治疗有效量”是指在必需的剂量和时间段中有效实现所需治疗结果的量。组合物的治疗有效量通常由本领域技术人员确定，并且可以随着多种因素而变，例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及所述组合物在所述个体中引发所需应答的能力。治疗有效量也是其中本发明的化合物的治疗有益效果超过其任何有毒或有害效果的量。“预防有效量”是指在必需的剂量和时间段中有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防剂量在疾病之前或其早期阶段在受试者中使用，因此预防有效量低于治疗有效量。

例如，活性化合物的治疗有效量可以在1mg至约1000mg一种或多种本文描述的化合物的范围内。在一种情况下，治疗有效量为约5mg至约400mg，包括所述范围内的所有整数和分数。在另一种情况下，治疗有效量为约2.5mg、5mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg、210mg、220mg、230mg、240mg、250mg、260mg、270mg、280mg、290mg、300mg、310mg、320mg、330mg、340mg、350mg、360mg、370mg、380mg、390mg、400mg、410mg、420mg、430mg、440mg、450mg、460mg、470mg、480mg、490mg或500mg一种或多种本文描述的化合物。

在另一个实施方式中，本文描述的化合物的治疗有效量为约0.1mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg。

在一种情况下，所述治疗有效量为约0.5mg/kg至约2.5mg/kg，包括所述范围内的所有整数和分数。

本文描述的组合物的一种或多种剂型可以每天给药例如1×、2×、3×、4×、5×、6×或更多次。一种或多种剂型可以给药例如1、2、3、4、5、6、7天或甚至更长时间。一种或多种剂型可以给药例如1、2、3、4周或更长时间。一种或多种剂型可以给药例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月、1年、2年、3年、4年、5年、超过5年、十年、几十年或甚至更长时间。一种或多种剂型可以以规则的间隔给药，直至所述受试者或有需要的受试者不需治疗、预防或改善任何疾病或病症包括但不限于病毒感染或其症状为止。在一种情况下，所述病毒是动脉炎病毒。在另一种情况下，所述受试者有风险感染、已感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)或具有与所述病毒相关的症状。

在一个实施方式中，本文描述的组合物可以作为剂型以各种不同的方案给药，包括每天一剂(QD)、每天两剂(BID)、每天三剂(TID)或每天四剂(QID)，以达到每天总剂量。在另一个实施方式中，任何上述剂量包含每天总剂量。

本文描述了通过向有需要的受试者给药有效量的式I的化合物来治疗繁殖与呼吸综合征的方法：

其中：

R是

R

R

在一种情况下，R是

本文还描述了通过向有需要的受试者给药有效量的式I的化合物来抑制分化群163(CD163)的清道夫受体富含半胱氨酸结构域5(SRCR5)与动脉炎病毒的糖蛋白之间的相互作用的方法：

其中：

R是

R

本文还公开了治疗被动脉炎病毒感染的猪、改善其症状、预防所述感染或降低其病毒负荷的方法，所述方法包括给药治疗有效量的药物组合物，所述组合物包含一种或多种可药用赋形剂和一种或多种选自下述的化合物：

在某些实施方式中，所述化合物是：

在某些实施方式中，将一种或多种镇痛药、抗病毒药、抗感染药、祛痰药、减充血剂、退烧药或其他药剂共同给药。在某些实施方式中，所述化合物的治疗有效量为约0.5mg/kg至约2.5mg/kg。

本文还公开了一种药物组合，其包含一种或多种本文描述的化合物和一种或多种另外的治疗剂，用于同时、独立或顺序使用，以治疗或预防病毒感染例如猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。在一个实施方式中，所述另外的治疗剂包括镇痛药、祛痰药、减充血剂、退烧药、抗病毒剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗生素、免疫调节剂、抗炎剂、通用抗感染剂、维生素、电解质或食物源中的一者或多者。在一种情况下，将一种或多种镇痛药、抗感染药、祛痰药、减充血剂、退烧药或其他药剂共同给药。

对于相关领域的普通技术人员来说，显然可以对本文描述的组合物、制剂、方法、过程和应用做出适合的修改和调整，而不背离其任何实施方式或方面的范围。所提供的组合物和方法是示例性的，并且不打算限制任何指定实施方式的范围。本文公开的各种不同实施方式、方面和选择都可以以任何变化或迭代方式组合。本文描述的组合物、制剂、方法和过程的范围包括本文描述的实施方式、方面、选择、实例和优选项的所有实际和潜在组合。本文描述的组合物、制剂或方法可以省略任何组分或步骤，替换本文公开的任何组分或步骤，或包括本文中别处公开的任何组分或步骤。本文公开的任何组合物或制剂的任何组分的质量与所述制剂中任何其他组分的质量或所述制剂中其他组分的总质量之比在本文中公开，如同它们被明确地公开。在通过参考并入的任何专利或出版物中任何术语的含义与本公开中使用的术语的含义有冲突的情况下，以本公开中所述术语或短语的含义为准。此外，本说明书仅仅公开并描述了示例性实施方式。本文引用的所有专利和出版物以其特定教导通过参考并入本文。

实施例

实施例1

化学品、细胞和病毒

所有筛选化合物均由Atomwise Inc.(CA,USA)作为通过Mcule,Inc.(CA,USA)的人工智能分子筛选(AIMS)奖励计划的一部分提供，或直接从MolPort,Inc(NY,USA)购买。PAM从6只健康的4-6月龄且PRRSV阴性的Landrace/Yorkshire杂交猪收获。简单来说，将猪在屠宰前安乐死。取出肺并在冰上转移到细胞培养柜中。将含有200U/mL青霉素和200μg/mL链霉素的温热PBS通过气管支气管注入到肺的两侧中。按摩肺并取出支气管肺泡灌洗液(BALF)。将BALF以400×g离心15min，沉淀物含有肺泡巨噬细胞(PAM)。然后将所述沉淀物用温热的完全培养基清洗两次。将细胞计数并在90％ FBS(HI,Rocky Mountain Biologicals,Inc)和10％ DMSO(Sigma)中冷冻。将细胞储存在Mr.Frosty冷冻容器(Nalgene,USA)中，并在-80℃下温育，然后转移到液氮。PAM在增补有10％ FBS(HI,Rocky Mountain Biologicals,Inc)、2mM Glutamax(Invitrogen)、0.1mM MEM非必需氨基酸(Gibco)、1mM丙酮酸钠(Gibco)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素(Gibco)和0.5μg/mL两性霉素B(Gibco)的RPMI-1640(Gibco)中培养。所有PRRSV毒株均在MARC-145细胞中繁殖和滴定。

人工智能分子筛选(AIMS)

虚拟筛选使用

质粒构建

将截短的Venus-I152L的N-端和C-端插入到载体骨架pMyc-CMV和pCMV-HA中，分别构成了商品化质粒pBiFC-VN155(I152L)和pBiFC-VC155(Addgene,Watertown,MA,USA)。参见Kodama和Hu，Biotechniques 49:793-805(2010)。通过RT-PCR扩增猪CD163受体的清道夫受体富含半胱氨酸结构域2(SRCR2)和SRCR5以及PRRSV糖蛋白GP2a和GP4的cDNA片段。将SRCR2或SRCR5的扩增的cDNA片段亚克隆到用EcoRI/BglII消化的pBiFC-VN155(I152L)载体中。为了构建GP2a和GP4融合蛋白，将编码GP2a或GP4的cDNA片段亚克隆到用EcoRI/BglII消化的pBiFC-VC155载体中。所有质粒克隆通过DNA Sanger测序进行验证。

BiFC测定

使用

细胞毒性测定

在生产性PRRSV感染的主要宿主细胞猪肺泡巨噬细胞(PAM)中确定所选筛选化合物的细胞毒性。简单来说，将各种不同浓度的化合物添加到接种在24孔板的PAM中并温育24h。然后向每个孔添加50μl MTT测定标记试剂(体外毒理学测定试剂盒，基于MTT的，Sigma-Aldrich)并温育4h，然后在每个孔中添加500μl溶解溶液，通过过夜温育完全溶解甲臜晶体。使用分光光度法微孔板读板器在600nm处测量样品的吸光值。将用DMSO处理的PAM用作对照。

定量反转录–PCR(qRT-PCR)

使用RNeasy小量试剂盒(Qiagen,Germantown,MD)，按照制造商的说明书从被PRRSV感染的PAM提取总RNA。使用Nanodrop分光光度计(Thermo Fisher Scientific)测量RNA浓度。用于四个PRRSV毒株的ORF7基因和猪GAPDH的特异性实时qPCR引物示出在表1中。GAPDH被用作看家基因用于基因表达归一化。用与ABI 7500相伴的软件处理数据。

Western印迹

从HEK293T细胞分离全细胞蛋白。简单来说，将细胞用冷PBS漂洗两次。在除去PBS后，向细胞添加增补有1％(v/v)蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冷RIPA缓冲液(Thermo FisherScientific)，并在冰上放置5min。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo FisherScientific)确定蛋白质浓度。将来自于每个样品的等量的变性蛋白在10％SDS-PAGE上分离并转移到PVDF膜上。将所述膜与5％脱脂奶温育以阻断非特异性结合，然后与Myc-Tag小鼠单克隆抗体(1:1000，Cell Signaling Technology,Danvers,MA)或抗GAPDH抗体(1:1,000；Cell Signaling Technology,Danvers,MA)在4℃温育过夜。在用1×T-BST清洗后，将膜与HRP偶联的第二抗体(Cell Signaling Technology,Danvers,MA)在室温温育1h，并用ECL印迹底物(Bio-Rad)显影图像并在ChemiDox XRS图像系统(Bio-Rad)下观察。

PRRSV感染和滴定测定

对于PAM细胞的PRRSV感染来说，在感染前一天接种PAM。将对照细胞用DMSO处理，并将测试细胞用所选筛选化合物(5–20μM)在接种前处理4h，在1h PRRSV接种期间处理，并在接种后处理24h。将细胞与VR-2332、SDSU73、NADC30或Lelystad PRRSV以MOI＝0.1接种1h。将24h的细胞培养基上清液储存在-80℃下直至使用。

对于PRRSV滴定测定来说，将MARC145细胞接种在48孔板中，并在接种前生长至～80％的密度。通过10倍连续稀释制备病毒上清液，并向每个孔添加100μl稀释液，制作6份平行样。在2h后从细胞中除去接种物并用0.5mL增补有2％ FBS、2mM谷氨酰胺、0.1mM MEM非必需氨基酸、50U/mL青霉素和50μg/m链霉素(Invitrogen)的DMEM代替。将细胞在37℃培养6天，并观察和记录任何细胞病变效果。PRRSV滴度使用Reed和Müench的方法计算，并表示为中值组织培养物感染剂量(TCID50/mL)。Reed和Müench，Am.J.Epidemiol.27(3):493-497(1938)。

统计分析

所有实验进行至少3次。数据通过单向ANOVA和Tukey事后比较或通过配对t-检验进行分析。数据被表示为平均值±sd，并且p<0.05被认为是显著的。

实施例2

开发BiFC测定以鉴定抑制PRRSV与CD163之间的蛋白质-蛋白质相互作用的小分子

使用以前描述的基于片段化维纳斯蛋白(VN-155[I152L]，在后文中被命名为VN)和(VC-155，在后文中被命名为VC)的BiFC载体，建立了猪CD163蛋白SRCR5或SRCR2结构域与VN之间和PRRSV次要糖蛋白(GP2a或GP4)与VC之间的融合蛋白构建物(图1A、2)。参见Kodama等，Biotechniques 49(5):793-805(2010)。将这些质粒在HEK293T细胞中共表达以评估SRCR5结构域与GP2a或GP4之间的PPI。与CD163-SRCR5在介导PRRSV/CD163相互作用和PRRSV感染中的已证实的关键作用相一致，CD163-SRCR5/VN融合蛋白(SRCR5-VN)与GP2a-或GP4-VC相互作用，在显微镜下检测到强烈荧光(图1B、1C)。相反，对于PRRSV感染和PRRSV-CD163相互作用来说非必要的CD163-SRCR2结构域的融合蛋白(SRCR2-VN)，当与GP2a-或GP4-VC共表达时仅显示出背景荧光(图1B、1C)。这些数据支持猪CD163-SRCR5结构域与PRRSV糖蛋白GP2a和GP4直接相互作用。

测试了BiFC测定以确定它是否可以鉴定具有阻断CD163与PRRSV之间的蛋白质-蛋白质相互作用的潜力的小分子。使用

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化合物B7抑制PAM的PRRSV感染

基于已证实的B7对CD163-SRCR5结构域与PRRSV糖蛋白之间的相互作用的抑制效应，测试了这种化合物以确定它是否抑制PAM的PRRSV感染。MTT测定揭示出B7化合物在低于25μM的浓度下被PAM良好耐受，其中经计算LC

进一步测试了B7对PRRSV的多种毒株的抑制效应。将PAM用15μM B7预处理4h，用PRRSV毒株VR-2332、SDSU73、NADC30(II型)或Lelystad(I型)接种1h，并与15μM B7继续温育24h。qRT-PCR揭示出在被所有PRRSV毒株感染的PAM中B7处理显著降低检测到的病毒RNA(图5C)。感染的PAM的培养基的病毒滴定结果进一步确认了这种抑制效应，其中15μM B7处理在3种II型PRRSV毒株中将病毒滴度降低2.8–3.1log，并将I型毒株(Lelystad)的病毒滴度降低2.2log(图5D)。因此，化合物B7确实抑制PAM的PRRSV感染。B7对PAM的PRRSV感染的显著剂量依赖性抑制使这种化合物及其衍生物明显成为进一步评估它们在抑制PRRSV感染方面的体内功效的候选物。

评估具有与B7相似的化学结构的化合物的PRRSV感染抑制效应

B7是一种合成化合物，其功能以前未被验证。为了检查B7支架与PRRSV感染抑制的结构相关性，进行了PubChem搜索，并鉴定到与B7结构相关的6种化合物(在本文中被命名为B7-A1至B7-A6，图6A，表2)。使用BiFC测定检查了任何这些B7类似物是否可以抑制CD163-SRCR5结构域与PRRSV GP2a蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)。与B7类似，在BiFC测定中化合物B7-A1至B7-A4都显著抑制CD163-SRCR5/GP2a PPI(图6B、图7A)。有趣的是将B7的3-(吗啉代磺酰基)苯胺组成部分迁移到4-(吗啉代磺酰基)苯胺位置(B7-A2)或将该组成部分改变成3-(哌啶基磺酰基)苯胺基团(B7-A4；图6A，虚线圆)不消除这些化合物抑制CD163-SRCR5/GP2a PPI的能力(图6B，图7A)。然而，将所述3-(哌啶基磺酰基)苯胺或3-(吗啉代磺酰基)苯胺组成部分用化合物B7-A5和B7-A6中的吗啉代替(图6A，虚线圆)完全阻断了它们抑制CD163-SRCR2/GP2a相互作用的能力(图6B，图7A)。这些报告的BiFC测定对于进一步筛选可以阻断PRRSV与CD163之间的PPI的小分子来说极有价值。

为了确认这些化合物的功能，进一步评估了化合物B7-A1至B7-A5对PAM的PRRSV感染的影响。MTT测定揭示出这些化合物在15μM水平下对PAM没有明显的细胞毒性效应(图8)。然后将PAM用15μM每种化合物预处理4h，并用PRRSV毒株VR-2332接种1h。然后将细胞与15μM相同化合物继续温育。在24h时，从被感染的PAM提取总RNA，qRT-PCR证实了与B7相似，化合物B7-A1至B7-A4与对照相比在处理的PAM中均显著抑制PRRSV RNA水平(图7B)。此外，与BiFC结果相一致，用B7-A5处理不能在被感染的PAM中抑制PRRSV RNA水平(图7B)。被感染的细胞的24h培养基的滴定进一步确认了所述发现，其证明化合物B7-A1至B7-A4都抑制PAM的PRRSV感染，但B7-A5不抑制，其中化合物B7-A1至A4处理分别将病毒滴度降低2.2、2.4、1.2和2.8log(图7C)。合在一起，所述结果表明3-(吗啉代磺酰基)苯胺组成部分(在B7和B7-A1至B7-A3中)和3-(哌啶基磺酰基)苯胺组成部分(在B7-A4中)对于这些化合物对PRRSV感染的抑制效应是重要的。

单独的3-(吗啉代磺酰基)苯胺或3-(哌啶基磺酰基)苯胺不抑制PRRSV感染，并且用B7后处理显著抑制PRRSV感染

还注意到了从B7的苯磺酰胺组成部分除去甲基和/或氟基团(化合物B7-A1、A2和A3，图6A)减弱了所述化合物在BiFC测定(图6B、7A)和PRRSV感染测定(图7B、7C)中的抑制性功能，尽管影响不像修饰3-(吗啉代磺酰基)苯胺组成部分那样剧烈。为了确定单独的3-(吗啉代磺酰基)苯胺或3-(哌啶基磺酰基)苯胺化学基团是否足以抑制PRRSV感染，购买了这两种化合物并分别命名为B7-A7和B7-A8(图9A)。将PAM用15μM每种分子处理4h，然后进行1hPRRSV VR-2332接种。然后将细胞与相同化合物温育24h。来自于处理的细胞的培养基的PRRSV滴定揭示出这两种化合物均不抑制PAM的PRRSV感染(图9B)。因此，尽管这两种组成部分在功能上是关键的，但其他组成部分(例如苯磺酰胺)的存在对于PRRSV感染的抑制也是必不可少的。

已经核实了在接种前和接种后用B7处理对PRRSV感染的抑制效应后，进行了实验以确定单独在接种前或接种后用B7处理是否具有显著效应。将PAM仅用B7处理4h并随后进行1h PRRSV毒株VR-2332接种而没有后处理，或者仅进行24h的PRRSV接种后处理而没有前处理。在感染后24h，评估了PAM中的病毒RNA和培养基中的PRRSV滴度。qRT-PCR揭示出尽管单独用B7后处理对PRRSV感染表现出与前处理加上后处理相似的抑制效应，但前处理影响极小(图9C)。这被感染的PAM的培养基的病毒滴定进一步确认，其中单独的化合物B7接种后处理导致PRRSV滴度降低2.8log(图9D)。这表明在B7化合物与CD163-SRCR5蛋白质结构域之间存在可逆缔合，在通过清洗除去B7化合物后它不再阻断PRRSV糖蛋白与CD163-SRCR5之间的相互作用。进一步精细的结构活性关系分析可能有助于揭示B7和SRCR5的分子-分子缔合的本质。这些发现以及对CD163-SRCR5结构域中参与PRRSV识别的关键残基的充分理解，可能为针对PRRS的有效化合物的靶向筛选提供有关信息。

实施例3

大鼠急性毒性研究

使用实验室大鼠进行了化合物B7的单剂量初步毒性研究。所述研究如下进行：

1.将8只10周龄Sprague Dawley实验室雄性大鼠(每只～260g)随机选入两个组(n＝4)，其中组1用于对照并且组2用于B7治疗。

2.在第0天，注射B7药物。肌肉内(IM)注射对于组1来说是将媒介物，对于组2来说是将每只大鼠4mg/kg B7以每只大鼠0.15mL的体积注射到左大腿区域。B7被溶解在媒介物中，所述媒介物含有30％DMSO和50％丙二醇(PG)和20％20mM Tris·HCl，pH 8.0。

3.第1–7天观察大鼠，测量每日体重和体温，并记录任何异常行为。

4.第7天尸检：将大鼠用CO

5.对收集的血样进行临床病理分析(由IDDEX Bioanalytics进行的CBC/化学)。

结果

在7天的研究过程中，对照组(C1-C4)和B7治疗组(T1-T4)均未观察到异常迹象，在这些大鼠中观察到正常的每日体重增加和体温。对这些大鼠的大体病理分析发现在C2、T3和T4的肝脏表面上存在多灶点至聚结的轻度淡棕褐色变色；这些浅变色区域未延伸到实质中。在所有3只大鼠中也存在增强的网状图案。此外，在T4中，肾皮质表面具有多个轻度棕褐色变色。这些可能是安乐死的假象、偶然病损，或者可能代表真正的病理变化。全血分析(表3)揭示出在对照与B7治疗组之间血细胞计数没有明显变化，所有值均落于别处所描述的正常范围内或接近所述正常范围。He等，PLoS One 12:e0189837(2017)；Delwatta等，Anim.Mod.Exp.Med.1:250-254(2018)。

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对于血液化学分析来说，只有ALP和AST略微以统计学显著性变化。表3。然而，文献中为雄性Sprague Dawley大鼠描述的正常范围变化相当大。咨询了两位有经验的实验室动物兽医。基于他们对所述数据的评估，这些大鼠中不存在急性毒性的迹象。一位临床病理学家得出了相同结论，并指出治疗组中AST的增加最可能是由血液样品溶血引起的，这也见于一个具有高AST的对照样品。基于所有样品的胆红素水平正常，在体内未发生血样的溶血。这可能是体外样品操作的结果，例如抽血的剪切力或血清样品中血细胞的污染。

实施例4

猪急性毒性研究

正在猪中进行单剂量初步研究以确定两种剂量水平下的急性毒性：10mg/10kg的低剂量和40mg/10kg的高剂量B7。假设生物利用度为100％，这分别对应于B7在猪中估算27.6μM或110.4μM的最高血浆浓度。基于以前对在大型动物中的探索性药物安全性研究的描述，将n＝3用于这项初步猪毒性研究。参见Bass等，J.Pharmacol.Toxicol.Met.60:69-78(2009)。

所述研究如下进行：

1.将9只4周龄仔猪随机分成3组(n＝3)，其中组1用于对照，组2和3用于不同剂量的B7治疗。

2.第0天，注射B7药物。IM注射对于组1来说用媒介物进行，所述媒介物含有30％DMSO和50％丙二醇(PG)和20％20mM Tris·HCl，pH 8.0，对于组2和3来说分别用10或40mgB7，使用2.5mL注射体积。注射部位是仔猪的臀部和大腿区域。

3.第1-7天观察猪，在第0、1、2、3、5和7天收集血样。使用LC-MS测量B7血浆水平用于药代动力学分析。

4.第7天尸检：使用Telazol 4.4mg/Kg、氯胺酮2.2mg/Kg和甲苯噻嗪4.4mg/Kg将猪麻醉，并使用过量戊巴比妥(100mg/Kg)进行安乐死。收集血液样品，用于由IDDEXBioanalytics进行临床病理分析。进行脑、心、肺、肝、肾和脾的尸检大体解剖病理分析。

5.对收集的器官/组织进行显微镜病理分析，以在大体病理学和血液化学数据的基础上调查急性毒性的任何迹象。

使用B7的猪PRRSV激惹研究

对于功效研究来说，将6只仔猪随机分成两组。所有猪均在第0天通过口鼻接种用PRRSV毒株VR-2332以106TCID50/猪接种，然后IM注射(1h后)媒介物对照(组1)或B7(组2，在毒性研究的基础上10mg或40mg，体积至多2.5mL)。根据临床反应每天对猪进行评估/评分，并且在第0、3、6、9、12和14天测量体重。为了测量PRRSV感染，在第0天和第4、7、11和14天收集血液。通过qRT-PCR测量病毒血症。所有猪将在2周时实施安乐死。将进行尸检。将对猪肺进行肉眼检查，以观察炎症和/或PRRSV感染的迹象。将从每个肺叶、气管支气管和腹股沟淋巴结、脾采集组织样品并冷冻，用于病毒载量评估和苏木精/曙红染色。对猪的肺、肾和肝组织病理切片进行处理和检查，用于毒性评估。

1.将6只4周龄仔猪随机分成3组(n＝3)，组1作为对照，组2用于B7治疗。

2.第0天，对于组2来说，将猪用PRRSV毒株VR-2332接种。对于组1对照来说，仅用培养基接种。

3.第0天，在PRRSV接种后1h向猪注射药物。

4.第1–14天观察猪，在第0、4、7、11和14天收集血液样品。从提取自血液样品的病毒RNA通过qRT-PCR测量病毒血症。用于临床病理的血液样品由IDDEX Bioanalytics进行分析。

5.第7天尸检。麻醉和安乐死将如上所述进行。在尸检时，将采集肺、气管支气管、腹股沟淋巴结和脾。分析肺和淋巴结以进行病毒载量测量、组织学处理、显微镜分析和评分。