一株苏云金芽孢杆菌NH26菌株及其应用

技术领域

本发明属于水体微生物修复技术领域，具体涉及一株苏云金芽孢杆菌NH26菌株及其应用。

背景技术

石油主要由多种烷烃和芳烃构成，其中多环芳烃具有致突变、致畸变和致癌等危害。海洋溢油是污染范围广、危害程度大的海洋污染类型，它会严重破坏海洋生态环境。一旦发生海洋溢油事故，石油烃在海洋中将超出其自净能力，会直接或间接地对海洋生物和人类造成严重危害。

目前，海洋石油污染的处理方法包括物理处理法、化学处理法和微生物修复法。物理处理法和化学处理法是海洋溢油初期常用的应急处置方法，目的是尽可能回收泄漏于海洋中的石油，降低海洋的石油污染负荷。然而，物理处理法和化学处理法不仅难以彻底清除泄漏在海洋中的石油，而且这两类方法具有处理成本高，会产生二次污染等缺点。与物理处理法和化学处理法相比，微生物修复法具有高效降烃、原位修复、处置成本低和不产生二次污染等优点。因此，利用具有石油烃降解能力的微生物来清除海洋石油污染的微生物修复法，已被公认为最具发展潜力、环境效益与经济效益均佳的海洋石油污染的终极处置方法。

海洋石油污染的微生物修复法的关键技术之一是筛选并获得具有较强石油烃降解能力及对海洋环境具有较强适应性的微生物菌株。现有研究表明，限制海洋石油污染的微生物修复法推广应用的关键因素之一是石油烃降解效率高、对海洋环境适应性强的微生物菌株储备不足。目前已经分离得到对石油烃具有降解能力的威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、耐碱海旋菌(Thalassospira alkalitolerans)，同时也分离得到对石油烃具有降解能力的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，Maddela NR et al.(2015)提供了一种对淡水中石油烃具有降解功能的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)isolate-2菌株[Maddela NRet al.,2015.Novel diesel-oil-degrading bacteria and fungi from the EcuadorianAmazon rainforest.Water Science&Technology,71(10):1554-1561]，但其无法适用于海水等高盐水体的修复，且最高降解率仅为49.71％；Sun W et al.(2019)提供了一种对淡水中石油烃具有降解功能的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CQ8-1菌株[Sun Wet al.，2019.Isolation，identification，and characterization of diesel-oil-degrading bacterial strains indigenous to Changqing oil field，China.Journalof Basic Microbiology，59:723-734]，但其无法适用于海水等高盐水体的修复，且对柴油的最高降解率仅为66％。

可见，目前分离得到的苏云金芽孢杆菌对石油烃的降解能力十分有限，并且只适用于在淡水中分解石油烃。由于微生物菌株在非盐碱陆地土壤或淡水与在海洋或其它高盐水体中的适应性存在显著差异，因此不能应用于清除海洋或高盐度水体中的石油污染；同时微生物也可能因为细菌钝化、菌株变异、退化等问题失去降解能力，因此扩充降解菌库的成员十分必要。

发明内容

本发明针对现有技术中微生物修复法在清除海洋和高盐水体石油污染应用中存在的技术问题，旨在提供一种同时对天然海水和其它高盐水体中烷烃、多环芳烃具有良好降解能力的微生物菌，为海洋和其它高盐水体中石油污染处置提供候选菌株方面的技术支持。

本发明的首要目的在于提供一株苏云金芽孢杆菌NH26(Bacillus thuringiensisNH26)菌株。

本发明的另一目的在于提供上述苏云金芽孢杆菌NH26菌株在降解石油中的应用。

本发明的又一目的在于提供上述苏云金芽孢杆菌NH26菌株在清除石油污染中的应用，或在修复石油污染的环境中的应用。

本发明的又一目的在于提供上述苏云金芽孢杆菌NH26菌株在降解石油烃中的应用。

本发明的又一目的在于提供上述苏云金芽孢杆菌NH26菌株在降解在清除石油烃污染中的应用，或在修复石油烃污染的环境中的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述发明目的：

本发明研究获得了一株苏云金芽孢杆菌NH26(Bacillus thuringiensis NH26)菌株，其能在石油烃存在的天然海水和其它高盐水体中快速生长，并对烷烃和多环芳烃均具有优异的降解作用，在高盐度水体中对浓度为20g/L的精制柴油中正十二烷～正二十七烷的降解率均达90％以上，总降解率为93.1％；在高盐度水体中对浓度为50g/L的精制柴油中正十二烷～正二十七烷的降解率均达87％以上，总降解率为88.4％；在天然海水中对浓度为20g/L的精制柴油中正十二烷～正二十七烷的降解率均达90％以上，总降解率为93.4％；在天然海水中对浓度为50g/L的精制柴油中正十二烷～正二十七烷的降解率均达88％以上，总降解率为89.4％；在高盐度水体中对浓度均为100mg/L的蒽、菲和芘的去除率分别为39.57％、42.48％和64.79％；在天然海水中对浓度均为100mg/L的蒽、菲和芘的去除率分别为40.07％、43.88％和65.02％。本发明的苏云金芽孢杆菌NH26菌株对高盐水体中烷烃、多环芳烃表现出优异的降解效果。

因此，以下技术方案均应在本发明的保护范围之内：

本发明提供了一株苏云金芽孢杆菌NH26(Bacillus thuringiensis NH26)菌株，于2022年7月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M20221149，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。

本发明提供了上述苏云金芽孢杆菌NH26菌株在降解石油中的应用。

本发明提供了上述苏云金芽孢杆菌NH26菌株在清除石油污染中的应用，或在修复石油污染的环境中的应用。

本发明提供了上述苏云金芽孢杆菌NH26菌株在降解石油烃中的应用。

本发明提供了上述苏云金芽孢杆菌NH26菌株在清除石油烃污染中的应用，或在修复石油烃污染的环境中的应用。

进一步说明，上述降解石油/石油烃或清除石油/石油烃污染或修复石油/石油烃污染的环境均在高盐度环境下进行。

优选地，所述高盐度环境包括高盐水体环境，包括但不限于海洋或其它高盐度水体。

优选地，所述石油烃为烷烃和多环芳烃。

更优选地，所述烷烃包括正十二烷～正二十七烷。

更优选地，所述多环芳烃包括蒽、菲和芘。

本发明的技术方案具有以下有益效果：

(1)本发明提供的苏云金芽孢杆菌NH26菌株在高盐度条件下对石油/石油烃(包括烷烃、多环芳烃)具有优异的降解能力，适用于海洋和其它高盐水体中的石油/石油烃的清除；

(2)本发明提供的苏云金芽孢杆菌NH26菌株在高盐度条件下对高浓度(精制柴油高达50g/L)的石油/石油烃(包括烷烃、多环芳烃)也具有优异的降解效果；

(3)本发明提供的苏云金芽孢杆菌NH26菌株可应用于清除石油/石油烃污染或应用于修复石油/石油烃污染的环境；如天然海水和其它高盐水体。

(4)本发明提供的苏云金芽孢杆菌NH26菌株具有易培养、生长快的优点，适合用于规模化生产菌剂，在用于修复被石油污染的海域和其它高盐水体方面具有重要的价值和应用前景。

附图说明

图1为苏云金芽孢杆菌NH26(Bacillus thuringiensis NH26)菌株形态；A图为菌落在LB琼脂培养基平板上的形态；B图为经革兰氏染色后在光学显微镜下的菌体形态。

图2为采用邻位相接法构建的苏云金芽孢杆菌NH26菌株的系统发育树。

图3为苏云金芽胞杆菌NH26菌株的生长曲线。

图4为苏云金芽胞杆菌NH26菌株的动态发酵曲线。

图5为苏云金芽胞杆菌NH26菌株在降解实验前(图5A)与降解后(图5B)高盐液体培养基中精制柴油的正十二烷～正二十七烷的气相色谱-质谱(GC-MS)图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1苏云金芽孢杆菌NH26菌株的分离纯化

一、样本来源

在广东惠州遭受原油污染的海岸带湿地采集表层土壤/沉积物样品。湿地的理化性质为氨氮12.38μg/g，亚硝氮1.36μg/g，硝氮0.94μg/g，磷含量94.05μg/g，钾含量23.32μg/g，总有机碳含量1.69％，总有机氮含量0.19％，pH为7.15。

二、菌株的分离与纯化

取10g遭受原油污染的海岸带湿地表层土壤/沉积物样品，将其加入100mL富集液体培养基中，于30℃、180转/分钟的摇床上培养24小时。将培养液涂布于平板选择培养基中，30℃、180转/分钟的摇床培养24小时后，挑取单菌落。重复挑取和培养单菌落，待平板菌落有效分离后，再根据菌落颜色、形态特征不同的菌落，分别用接种针挑选进行平板划线纯化分离。然后，将菌株接种于斜面培养基中，在4℃冰箱中冷藏保存备用。

其中，富集液体培养基的成分为：精制柴油(市售柴油经100℃下蒸馏240小时获得)20g/L，尿素2.5g/L，NaCl 10g/L，Na

斜面培养基和平板选择培养基均采用LB琼脂培养基，它们的成分均为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L和琼脂20g/L；将pH调至7.2，121℃灭菌20分钟。

三、溶油圈法筛选石油烃降解菌

将上述培养于斜面培养基中的纯菌菌种接种于平板琼脂富集培养基(具体成分同上富集液体培养基，但添加了凝固剂琼脂)上，置于30℃培养箱中培养7-10天，观察是否有排油圈出现，并根据排油圈直径与菌落直径之比值初步确定菌株的烃降解能力。

将筛选到的排油圈最大的烃降解菌接种于斜面培养基上，于4℃冰箱中冷藏保存备用。将其编号为NH26菌株。

实施例2苏云金芽孢杆菌NH26菌株的鉴定

一、菌株的形态特征鉴定

用LB琼脂平板培养基在30℃下培养NH26菌株24小时后观察菌落形态。NH26菌株的菌落在平板上的形态如图1A所示。从图1A看出，NH26菌株的菌落呈乳白色、圆形、稍有光泽、湿润、质地较软、厚实。NH26菌株的菌体经革兰氏染色后，在光学显微镜(20×)下的形态如图1B所示。从图1B看出，NH26菌株的菌体呈杆状，连接成短链或长链，大小为(2.9～5.1)μm×(1.1～1.6)μm。

二、NH26菌株的生化特性鉴定

NH26菌株的菌体经革兰氏染色后呈紫色，表明其为革兰氏阳性菌(G

表1苏云金芽孢杆菌NH26菌株的形态和生理生化特征

注：“+”表示反应为阳性；“-”表示反应为阴性。

三、菌株的16S rDNA鉴定

对分离纯化后获得的上述NH26菌株，用DNA提取试剂盒进行总基因组DNA提取；将获得的总基因组DNA进行扩增；扩增产物在ABI 3730测序平台上测序。

从所获得的测序结果看出，该菌株16S rRNA长1420bp，经NCBI的nt库Blast比对和系统发育分析软件MEGA11构建进化树(图2)，结果显示，本发明所述NH26菌株属于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，与Bacillus thuringiensis VKK-BB-1菌株相似度最高(约为99％)。

综上，根据以上结果并结合生理生化特性，将其命名为苏云金芽孢杆菌NH26(Bacillus thuringiensis NH26)，该菌株已于2022年7月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M20221149，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。

实施例3苏云金芽孢杆菌NH26菌株的生长实验

一、生长曲线的测定

将LB培养基中的苏云金芽孢杆菌NH26菌株接种至种子培养基。取3个平行样品，在30℃、180转/分钟的条件下培养。用酶标仪每隔2小时测量一次培养液在波长610nm下的吸光度OD

其中，种子培养基的组分如下所示：

葡萄糖20g/L、酵母膏10g/L、硫酸铵5g/L、KH

生长曲线的测定结果见图3。从图3看出，菌株NH26的对数生长期为2-10小时，随后进入稳定生长期，34小时后菌体开始衰亡，反映出苏云金芽孢杆菌NH26菌株在种子培养基中易培养、生长快。

二、动态发酵曲线的测定

将苏云金芽孢杆菌NH26菌株的种子培养液(在种子培养基中培养8小时)按10％的接种量转接至液体发酵培养基。在30℃、180转/分钟的条件下培养4天。在发酵期间定时取样发酵液。将发酵液样本离心后，取沉淀的菌体经真空冷冻干燥后测量其干重，获得苏云金芽孢杆菌NH26菌株的生物量干重(Dry Weight of Biomass)。将苏云金芽孢杆菌NH26菌株发酵液的生物量干重(Dry Weight of Biomass)、表面张力(Surface Tension)(用表面张力仪测定)和pH值(用酸度计测定)对时间做图，得到苏云金芽孢杆菌NH26菌株的动态发酵曲线。

其中，液体发酵培养基的组分如下所示：

豆油20g/L、酵母膏5g/L、KH

动态发酵曲线测定结果见图4。从图4看出，经12小时发酵，苏云金芽孢杆菌NH26菌株的生物量达到最大，40小时后生物量趋于平稳，反映出NH26菌株在发酵液体培养基中具有易培养、生长快的特点。

实施例4苏云金芽孢杆菌NH26菌株对高盐水体中烷烃的降解

一、苏云金芽孢杆菌NH26菌株在高盐水体中精制柴油浓度为20g/L时对正十二烷～正二十七烷的降解能力

将苏云金芽孢杆菌NH26菌株的种子培养液(在种子培养基中经8小时培养)按10％的接种量转接至实施例1所述的富集液体培养基，但将NaCl浓度提高至30g/L(相当于正常海水中NaCl的浓度)，其余成分同实施例1。在pH 7.3、30℃和180转/分钟的条件下培养10天。经苏云金芽孢杆菌NH26菌株降解后，先用二氯甲烷对培养基(高盐液体培养基)中的残留烷烃进行萃取，再用气相色谱-质谱仪(GC-MS)对烷烃组成进行分析，并与降解实验前的精制柴油组分进行对比(图5)。

通过比较降解实验前后正十二烷～正二十七烷组分的分峰面积，计算各自的降解率，结果如表2所示。

表2苏云金芽孢杆菌NH26菌株对高盐水体中精制柴油浓度为20g/L时对正十二烷～正二十七烷的降解率

从图5和表2中看出，苏云金芽孢杆菌NH26菌株对正十二烷～正二十七烷的降解率均达90％以上，总降解率为93.1％，表明苏云金芽孢杆菌NH26菌株在高盐水体中对正十二烷～正二十七烷均具有优异的降解能力。

二、苏云金芽孢杆菌NH26菌株在高盐水体中精制柴油浓度为50g/L时对正十二烷～正二十七烷的降解能力

将苏云金芽孢杆菌NH26菌株的种子培养液(在种子培养基中经8小时培养)按10％的接种量转接至实施例1所述的富集液体培养基中，但将NaCl浓度提高至30g/L(相当于正常海水中NaCl的浓度)及将精制柴油的浓度调高至50g/L，其余成分同实施例1。在pH 7.3、30℃和180转/分钟的条件下培养10天。经苏云金芽孢杆菌NH26菌株降解后，先用二氯甲烷对培养基中的残留烷烃进行萃取，再用GC-MS对烷烃组成进行分析，并与降解实验前的精制柴油组分进行对比。通过比较降解实验前后正十二烷～正二十七烷的分峰面积，计算各自的降解率，结果如表3所示。

表3苏云金芽孢杆菌NH26菌株在高盐水体中精制柴油浓度为50g/L时对正十二烷～正二十七烷的降解率

从表3看出，苏云金芽孢杆菌NH26菌株对正十二烷～正二十七烷的降解率均达87％以上，总降解率为88.4％，表明苏云金芽孢杆菌NH26菌株在高浓度(50g/L)精制柴油的高盐水体中对正十二烷～正二十七烷仍保持非常好的降解能力。

实施例5苏云金芽孢杆菌NH26菌株对天然海水中烷烃的降解

一、苏云金芽孢杆菌NH26菌株在天然海水中精制柴油浓度为20g/L时对正十二烷～正二十七烷的降解能力

将苏云金芽孢杆菌NH26菌株的种子培养液(在种子培养基中经8小时培养)按10％的接种量转接至实施例1所述的富集液体培养基，但将添加的NaCl和蒸馏水调整为天然海水(将采自南海的天然海水用0.22μm滤膜过滤后获得，其盐度为35‰)，其余成分同实施例1。在pH 7.3、30℃和180转/分钟的条件下培养10天。经苏云金芽孢杆菌NH26菌株降解后，先用二氯甲烷对培养基中的残留烷烃进行萃取，再用气相色谱-质谱仪(GC-MS)对烷烃组成进行分析，并与降解实验前的精制柴油组分进行对比。通过比较降解实验前后正十二烷～正二十七烷的分峰面积，计算各自的降解率，结果如表4所示。

表4苏云金芽孢杆菌NH26菌株在天然海水中精制柴油浓度为20g/L时对正十二烷～正二十七烷的降解率

从表4中看出，苏云金芽孢杆菌NH26菌株对正十二烷～正二十七烷的降解率均达90％以上，总降解率为93.4％，表明苏云金芽孢杆菌NH26菌株在天然海水中对正十二烷～正二十七烷具有优异的降解能力。

二、苏云金芽孢杆菌NH26菌株在天然海水中精制柴油浓度为50g/L时对正十二烷～正二十七烷的降解能力

将苏云金芽孢杆菌NH26菌株的种子培养液(在种子培养基中经8小时培养)按10％的接种量转接至实施例1所述的富集液体培养基中，但将添加的NaCl和蒸馏水调整为天然海水(将采自南海的天然海水用0.22μm滤膜过滤后获得，其盐度为35‰)及将精制柴油的浓度调高至50g/L，其余成分同实施例1。在pH 7.3、30℃和180转/分钟的条件下培养10天。经苏云金芽孢杆菌NH26菌株降解后，先用二氯甲烷对培养基中的残留烷烃进行萃取，再用GC-MS对烷烃组成进行分析，并与降解实验前的精制柴油组分进行对比。通过比较降解实验前后正十二烷～正二十七烷的分峰面积，计算各自的降解率，结果如表5所示。

表5苏云金芽孢杆菌NH26菌株在天然海水中精制柴油浓度为50g/L时对正十二烷～正二十七烷的降解率

从表5看出，苏云金芽孢杆菌NH26菌株对正十二烷～正二十七烷的降解率均达88％以上，总降解率为89.4％，表明苏云金芽孢杆菌NH26菌株在高浓度(50g/L)精制柴油的天然海水中对正十二烷～正二十七烷仍保持良好的降解能力，但与精制柴油浓度为20g/L时相比，降解率稍有下降。

实施例6苏云金芽孢杆菌NH26菌株对高盐水体中多环芳烃的降解

一、苏云金芽孢杆菌NH26菌株在高盐水体中蒽、菲和芘浓度均为100mg/L时对三者的降解率

将NH26菌株的种子培养液(在种子培养基中经8小时培养)按10％的接种量转接至实施例1所述的富集液体培养基中，但将NaCl浓度提高至30g/L(相当于正常海水中NaCl的浓度)及将精制柴油更换为多环芳烃(蒽、菲和芘均为100mg/L)，其余成分同实施例1。在pH7.3、30℃和180转/分钟的条件下培养30天。每隔5天检测一次培养基中蒽、菲和芘的残留量，计算其降解率。具体的检测方法为：先用二氯甲烷萃取，再用GC-MS对蒽、菲和芘的残留量分别进行分析，并与降解实验前进行对比。通过比较降解实验前后蒽、菲和芘的分峰面积，计算其降解率，结果如表6所示。

表6苏云金芽孢杆菌NH26菌株在高盐水体中蒽、菲和芘浓度均为100mg/L时对三者的降解率

从表6看出，随着时间的延长，NH26菌株对蒽、菲和芘的去除率均呈上升趋势；经30天的降解，NH26菌株对蒽、芘和菲的去除率分别为39.57％、42.48％和64.79％。

二、苏云金芽孢杆菌NH26菌株在天然海水中蒽、菲和芘浓度均为100mg/L时对三者的降解能力

将NH26菌株的种子培养液(在种子培养基中经8小时培养)按10％的接种量转接至实施例1所述的富集液体培养基中，但将添加的NaCl和蒸馏水调整为天然海水(将采自南海的天然海水用0.22μm滤膜过滤后获得，其盐度为35‰)及将精制柴油调整为多环芳烃(蒽、菲和芘均为100mg/L)，其余成分同实施例1。在pH 7.3、30℃和180转/分钟的条件下培养30天。每隔5天检测一次培养基中蒽、菲和芘的残留量，计算其降解率。具体的检测方法为：先用二氯甲烷萃取，再用GC-MS对蒽、菲和芘的残留量分别进行分析，并与降解实验前进行对比。通过比较降解实验前后蒽、菲和芘的分峰面积，计算其降解率，结果如表7所示。

表7苏云金芽孢杆菌NH26菌株在天然海水中蒽、菲和芘浓度均为100mg/L时对三者的降解率

从表7看出，随着时间的延长，NH26菌株对蒽、菲和芘的去除率均呈上升趋势；经30天的降解，NH26菌株对蒽、芘和菲的去除率分别为40.07％、43.88％和65.02％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。