密罗木基因MfWRKY7.2及其编码蛋白和在改善植物抗旱耐盐性能中的用途

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种密罗木基因MfWRKY7.2及其编码蛋白和在改善植物抗旱耐盐性能中的用途。

背景技术

干旱是影响植物生长和生产的重要非生物因素之一。干旱的加剧会直接导致生态环境的恶化，如可利用的水资源匮乏以及荒漠化等，这会对农业、林业等各方面的生产造成巨大的影响。为了克服环境带来的挑战，植物会形成复杂的调控机制来降低环境胁迫对其自身的影响，其中转录因子起着重要的作用。转录因子(transcription factor，TF)可通过调控各种功能蛋白以及多个与干旱胁迫相关基因的表达，使植物快速响应胁迫。因此，过表达耐干旱胁迫的关键转录因子可以提高植物的耐旱性。迄今为止，已有不少耐旱转录因子基因被报道。

目前参与植物干旱胁迫的相关转录因子家族主要有MYB、NAC、WRKY家族等。WRKY转录因子家族是一类普遍存在于高等植物中的转录调控蛋白，1994年，Ishiguro等人从甘薯中克隆出第一个WRKY基因SPF1，此后，研究者们相继从高等植物中分离鉴定出更多的WRKY类家族基因。在模式植物中，拟南芥AtWRKY53通过降低H

密罗木(Myrothamnus flabellifolia Welw.)是迄今为止发现的唯一的木本复苏植物。其本身有着良好的抗逆性，在极度干旱时，叶片及茎段收缩，复水1-3天后枝条就能舒展并恢复生活力。但目前对于密罗木WRKY转录因子的研究还非常少，并且对其中与抗逆相关的基因及其分子机制还不清楚，因此密罗木具有重要的研究价值。通过筛选密罗木耐旱相关基因并对其进行功能验证，可为改良园林植物的抗逆能力提供优质基因资源。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种密罗木基因MfWRKY7.2及其编码蛋白和在改善植物抗耐抗盐性能中的用途，该基因能在干旱脱水早期快速响应，提高植物的抗旱耐盐性能。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种密罗木基因MfWRKY7.2，该基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示或SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

其中，序列表SEQ ID NO.1从密罗木叶片RNA中通过PCR克隆，全长897bp。

进一步地，该基因还可以是与SEQ ID NO.1所述序列具有80％以上同源性，且编码具有相同功能蛋白的基因。

采用上述基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO.2由298个氨基酸组成，其中有一个核定位信号：RCHCSKRKKLRLK；一个WRKY保守结构域，并且还含有一个典型C2H2型锌指结构，属于WRKY转录因子家族II d亚组。

包含上述密罗木MfWRKY7.2基因的质粒。

包含上述密罗木MfWRKY7.2基因的重组表达载体。

包含上述密罗木MfWRKY7.2基因的转基因细胞系。

包含上述密罗木MfWRKY7.2基因的工程菌。

一种基因芯片，包括上述密罗木MfWRKY7.2。

上述密罗木基因MfWRKY7.2、质粒、重组表达载体、工程菌或基因芯片在植物抗旱改良过程中的用途。

上述密罗木基因MfWRKY7.2、质粒、重组表达载体、工程菌或基因芯片在植物耐盐改良过程中的用途。

本发明的有益效果为：

1.获得了对干旱及盐胁迫有较高耐受性的转基因拟南芥。

2.密罗木基因MfWRKY7.2能在干旱脱水早期快速响应，为利用该基因提高其他植物的干旱和盐耐受性提供了理论依据及利用价值。

附图说明

图1为本发明的密罗木基因MfWRKY7.2的同源序列比对结果；

图2为本发明的密罗木基因MfWRKY7.2的系统进化树；

图3为本发明的密罗木基因MfWRKY7.2亚细胞定位的结果；

图4为转MfWRKY7.2基因拟南芥植株的阳性鉴定结果；

图5为野生型和转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株在干旱胁迫处理后的生长状态；其中，图5a为野生型和转基因拟南芥幼苗在干旱胁迫处理后的根系生长状态；图5b为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的根长；图5c野生型和转基因拟南芥植株成株在干旱胁迫处理后的生长状态；

图6为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的生长状态；其中，图6a为野生型和转基因拟南芥植株幼苗在氯化钠胁迫处理后的根系生长状态；图6b为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的根长；图6c野生型和转基因拟南芥植株成株在氯化钠胁迫处理后的生长状态；

图7为野生型和转基因拟南芥植株的气孔测定；其中，图7a为野生型和转基因拟南芥植株的气孔形状检测图；图7b为野生型和转基因拟南芥植株的气孔闭合度统计图；

图8为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫下的离体叶片自然失水率测定；

图9为野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的的叶绿素测定；

图10为野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的的脯氨酸含量测定；

图11为野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的的丙二醛(MDA)含量测定；

图12为野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的的可溶性蛋白质含量测定；

图13为野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的的超氧化物歧化酶(SOD)含量测定；

图14为野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的的过氧化物酶(POD)含量测定；

图15为野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的的过氧化氢酶(CAT)含量测定；

图16为野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的的过氧化氢(H

图17为野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的的二氨基联苯胺(DAB)染色；

图18为野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的的氮蓝四唑染色(NBT)染色。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1：克隆密罗木MfWRKY7.2基因

1、取密罗木叶片，液氮速冻，放置-80℃冰箱中保存以备提取总RNA；总RNA提取采用成都兰博生物公司购买的Plant Total RNA Isolation Kit试剂盒来提取；密罗木cDNA的合成使用大连宝生物科技公司的Reverse Transcriptase M–MLV(RNaseH-)，按其产品说明书操作进行第一链合成。

以上述试剂盒合成的cDNA第一链为扩增模板，利用PCR进行cDNA扩增。为了后续的酶切及重组连接，在设计引物时分别加上NcoI和SpeI这两个酶切位点，引物为F：5’-CATGCCATGGCCGTAGAGCTCCTGAT-3’(SEQ ID NO.3,NcoI)和R：5’-GACTAGTTTAAGAAGATTCAAGGATGAGAT-3’(SEQ ID NO.4,SpeI)，扩增体系见表1，扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min。

表1 PCR扩增体系

2、PCR结束后进行电泳分析，采用OMEGA公司的DNA回收试剂盒回收约897bp的扩增片段，将扩增片段连接到Peasy-T1 Simple克隆载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取白色菌落进行菌落PCR以鉴定阳性克隆，将阳性克隆送到成都擎科生物科技有限公司测定密罗木基因MfWRKY7.2的编码序列，其序如SEQ ID NO.1所示，再利用ORF Finder软件将所得基因的开放阅读框翻译成氨基酸序列，该氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：密罗木MfWRKY7.2的序列同源与同源性分析

将测序结果在NCBI数据库里进行序列比对，发现克隆到的MfWRKY7.2基因序列与WRKY家族转录因子同源关系最近。将该转录因子与其它WRKY转录因子家族成员的蛋白序列进行比对分析，发现该基因与其他同源基因都含有一个WRKY结构域(由WRKYGQK短肽和一个C2H2锌指结构组成)、一个HARF结构域以及一个潜在的钙调蛋白结合结构域(CaMBD)，属于WRKY转录因子家族II d亚组(如图1)。利用Psort II分析MfWRKY7.2基因的亚细胞定位，可看出该基因定位在细胞核的可能性最大，同时通过NLS-mapper预测到一个位于197aa的单一型核定位信号：RCHCSKRKKLRLK(如图1)。进一步利用MEGA软件比对的同源性较高物种的氨基酸序列构建系统进化树(如图2)，发现密罗木MfWRKY7.2与河岸葡萄(Vitis riparia)VrWRKY7基因独聚为一枝，表明二者同源性最高。

实施例3：密罗木基因MfWRKY7.2植物表达载体的构建

将上述经测序正确的菌液提取质粒，含MfWRKY7.2基因的克隆载体质粒经NcoI和SpeI双酶切后，利用DNA回收试剂盒回收897bp左右的DNA片段，将此片段与相同酶切的pGSA1403表达载体相连，获得的载体命名为35S:MfWRKY7.2-pGSA1403。

实施例4：MfWRKY7.2的亚细胞定位

根据亚细胞定位载体pCAMBIA1300-35S-YFP的序列结构特点，选择SacI和KpnI两个酶切位点，并基于同源重组连接的原理进行上下游引物设计。去掉了MfWRKY7.2基因末端的终止密码子以构建YFP融合蛋白载体，保证目的基因的有效表达。引物由成都擎科生物公司合成。其引物的具体序列如下:

F：5’-GAGAACACGGGGGACGAGCTCATGGCCGTAGAGCTCCTGATG-3’(SEQ ID NO.5,SacI)

R:5’-GCCCTTGCTCACCATGGTACCAGAAGATTCAAGGATGAGATTGGATG-3’(SEQ ID NO.6,KpnI)

使用REШMix同源重组试剂盒，连接去掉终止密码子的MfWRKY7.2基因与经SacI和KpnI双酶切线性化的pCAMBIA1300-35S-YFP载体，构建融合载体35S:MfWRKY7.2-pCAMBIA1300-YFP。将空载pCAMBIA1300-35S-YFP和融合载体35S:MfWRKY7.2-pCAMBIA1300-YFP分别注射野生型本氏烟草叶片进行瞬时表达，在激光共聚焦显微镜下观察结果如图3所示；从图3中可看出，只转入pCAMBIA1300-35S-YFP的烟草叶片的荧光信号分布在烟草细胞内的各个部位，而转入35S:MfWRKY7.2-pCAMBIA1300-YFP质粒的烟草叶片的荧光信号则只出现在细胞核中，说明MfWRKY7.2基因定位于细胞核中，并在细胞核中起作用。

实施例5：MfWRKY7.2基因的遗传转化

将农杆菌LBA4404感受态细胞置于冰上解冻，取5μL重组质粒35S:MfWRKY7.2-pGSA1403于200μL感受态中，用枪头轻轻混匀，冰浴30min，液氮速冻1min，37℃水浴5min，冰上放置2min后加入800μL LB液体培养基，在恒温培养箱中29℃，120r/min，培养2～4h。将上述菌液均匀涂布在含10μg/mL氯霉素的LB固体培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养，然后挑取单菌斑接种于5mL LB液体培养基中，28℃，250r/min振荡培养24h。取1mL上述菌液转入50mL含10μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于28℃，250r/min，振荡培养至OD

转化前需剪掉成熟的果荚，让植株浸入农杆菌细胞悬浮液2min，然后将浸好的植株暗处理24h后于光照培养箱中正常培养，一周后可重复浸染一次。待种荚黄化后收种，记为T0代。继续将T0代拟南芥种子放入含有50μg/mL卡那霉素的1/2MS培养基里，转入外源基因的植株能在含有卡那霉素的抗性培养基上生长，而非转基因植株则不能正常生长。据此筛选出能正常生长且颜色呈深绿色的植株，对深绿色植株提取DNA并进行PCR检测阳性，获得T1代转基因植株，继续筛选获得T2代转基因植株，对T2代的不同植株进行筛选(如图4)，其中，“WT”和“H

实施例6：转基因拟南芥的胁迫处理

1、幼苗处理是将野生型(WT)和过表达T3代纯系(LineB，LineG，LineJ)分别播种于含甘露醇(0mM，250mM，300mM)、NaCl(0mM，100mM，150mM)的1/2MS培养基中，对照组只添加正常成分，记为CK。每个方形培养皿中WT和三种株系分别点播15粒种子，4℃暗处理2d后移入光照培养箱中垂直放置，继续培养2周，在根系分析仪下拍照并测量根长。每个处理重复3次。

图5a为干旱胁迫下的幼苗根部生长状态，图5b为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理前后的根长；图6a为盐胁迫下的幼苗表型根部生长状态，图6b为野生型和转基因拟南芥植株在盐胁迫处理后的根长。

2、成株的处理，是将野生型拟南芥(WT)和过表达T3代纯系(LineB，LineG，LineJ)种子10粒播种在花钵里，培养4周左右，选择长势一致的植株进行抗逆性分析。

(1)干旱胁迫处理：对照组(记为CK)正常浇水管理，其余组均不浇水使其自然干旱失水，期间持续观察并记录植株生长状况，失水3周左右后开始复水，处理期间拍照记录(如图5c)。3次重复，共30株。

(2)盐胁迫处理：对照组不作处理，记为CK，其余组每隔3天浇一次300mM的氯化钠处理液，持续处理2周，期间不断观察拍照并记录植株生长状况(如图6c)。3次重复，共30株。

通过研究野生型与过表达拟南芥幼苗和成株在干旱及氯化钠胁迫下的表型，发现过表达MfWRKY7.2基因株系LineB，LineG和LineJ对干旱及盐的耐受性均强于WT，说明过表达MfWRKY7.2基因提高了拟南芥对干旱及盐胁迫的抗性。

实施例7：相关生理指标的测定

(1)拟南芥的培养、胁迫处理及取样

将野生型拟南芥(WT)和过表达T3代纯系(LineB，LineG，LineJ)种子播撒在50孔穴盘内(已等量分装好营养土并浇足水)，继续培养4周左右。

离体叶片自然失水率，叶绿素，脯氨酸(Pro)，丙二醛(MDA)，可溶性蛋白，超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(POD)，抗氧化酶(CAT)，过氧化氢(H

(2)甘露醇处理下气孔开度的测定

取未经胁迫处理的WT，LineB，LineG和LineJ的莲座叶叶片，每个株系取12个叶片，置于100mL的MES-KCl缓冲液(50mM KCl，0.1mM CaCl

观察WT与过表达株系的气孔表型可知(如图7a)，在300mM甘露醇处理下，过表达植株LineB，LineG和LineJ的气孔闭合度高于野生型植株。统计100个气孔数据分析得知过表达植株的气孔闭合程度(宽与长的比值)显著小于WT(如图7b)，表现为极显著。因此在胁迫处理下，过表达MfWKRY7.2基因的植株能及时关闭气孔，尽量减少体内水分的散失，提高植株抗失水能力。

(3)失水率的处理及测定

将穴盘中培养的WT，LineB，LineG和LineJ浇足水分，剪莲座叶取样，在天平上用定量滤纸称取三个株系各0.5g叶片，此时叶片含水量为初始含水量，记为m

相同条件下，随着时间的推移，各株系均有持续失水的趋势，而转基因株系LineB，LineG和LineJ的失水率始终低于WT，这说明转基因株系能够更好地调控水分以应对环境变化，尽量降低环境影响对自身的伤害。

(4)叶绿素含量的测定

取正常生长和胁迫处理后的WT，LineB，LineG和LineJ植株叶片鲜样各0.5g，将其叶中脉剪掉并剪碎叶片，加入到50mL的棕色容量瓶中，分别加入95％乙醇提取液50mL，将容量瓶加塞放入25℃的恒温培养箱中暗中提取48h。因为95％乙醇提取液在波长为649nm和665nm处具有最大吸光值A649和A665，所以用紫外分光光度计测量A649和A665，以95％乙醇提取液作为空白对照，此步骤重复两次。3次重复，结果如图9所示。

过表达MfWRKY7.2株系LineB，LineG和LineJ在受到胁迫处理后各转基因的叶绿素含量均有所上调，而WT叶绿素含量则降低。说明过表达MfWRKY7.2基因拟南芥植株对干旱及盐胁迫的抗逆性优于野生型拟南芥。

(5)脯氨酸含量的测定

在天平上准确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内用少量蒸馏水溶解后倒入250mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100μg；取6个50mL容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3mL，用蒸馏水定容至刻度并混匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL。

取正常条件和胁迫处理的WT，LineB，LineG和LineJ植株叶片鲜样各0.5g，加入少许石英砂和少许3％的磺基水杨酸溶液在研钵中磨碎，倒入10mL离心管并定容至10mL，4500r离心3min。取上清液并用3％的磺基水杨酸溶液定容至10mL。吸取2mL提取液至一洁净干燥玻璃试管中，加入2mL酸性茚三酮和2mL冰乙酸，100℃加热1h，放入冰水中终止反应，加入4mL甲苯，充分振荡15～20s，静置分层后用移液枪轻轻吸取上层红色溶液于比色皿中，以甲苯为对照，在分光光度计520nm波长处比色并求得吸光度值，此步骤重复两次。3次重复，结果如图10所示。

脯氨酸作为植物体内的渗透调节物质、膜和酶的保护物质，可对植物在胁迫下的生长起到保护作用。在胁迫条件下，LineB，LineG和LineJ转基因株系体内的脯氨酸含量远高于野生型。说明在干旱和盐胁迫下，过表达MfWRKY7.2基因能使拟南芥更好地适应恶劣环境。

(6)丙二醛(MDA)含量的测定

取正常条件和胁迫处理的WT，LineB，LineG和LineJ植株叶片鲜样各0.5g，加入少量石英砂和10％三氯乙酸2mL，研磨至匀浆，再加8mL10％三氯乙酸进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，其上清液为丙二醛提取液。取4支干净试管，分别编号，3支为样品管(三个重复)，各加入提取液2mL；1支为对照管，对照管加蒸馏水2mL，然后各管再加入2mL0.6％硫代巴比妥酸溶液。摇匀，混合液在沸水浴中反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液注入酶标板中放入酶标仪，分别在532、600和450nm波长下测定吸光度(A)值。3次重复，结果如图11所示。

在胁迫条件下，各株系MDA含量均有所升高，但WT植株叶片的MDA含量明显高于LineB，LineG和LineJ，说明过表达MfWRKY7.2转基因株系植株在胁迫下能尽量降低自身膜系统的损伤。

(7)可溶性蛋白质含量的测定

称取正常条件和胁迫处理的WT，LineB，LineG和LineJ植株叶片鲜样0.2g，用5mL磷酸缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min离心10min，上清液备用。此为实验用植物酶液。吸取样品提取液1.0mL(视蛋白质含量适当稀释)，放入试管中(每个样品重复2次)，加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查找蛋白质的含量。3次重复，其检测结果如图12所示。

在逆境胁迫下，转基因株系LineB，LineG和LineJ的可溶性蛋白含量明显高于野生型，说明过表达MfWRKY7.2基因可使拟南芥体内的营养物质和渗透调节物质增加，以此来应对胁迫环境。

(8)超氧化物歧化酶(SOD)含量的测定

分别取Met：162mL，EDTA-Na2：6mL，NBT：6mL，核黄素：6mL于烧杯中混匀备用。取型号相同的试管，吸取(7)中植物酶液40μL，并分别加入3mL的混合反应液，同时取两支试管作对照，一支加入40μL磷酸缓冲液和3mL混合反应液作空白对照，一支40μL磷酸缓冲液和3mL混合反应液用锡箔纸包好避光以作测定时调零。将试管置于光照培养箱中4000Lux，25℃下反应20min。以黑暗处理下的试管调零，测定各反应液560nm下吸光度值，3次重复，结果如图13所示。

超氧物歧化酶可以清除植物体内的超氧阴离子自由基，提高植物的抗逆性。在干旱和盐胁迫下，各株系植株叶片的SOD活性均有不同程度的升高，且LineB，LineG和LineJ株系植株的SOD活性均高于WT株系。

(9)过氧化物酶(POD)含量的测定

取0.1MPH 6.0的磷酸缓冲液50mL于烧杯中，加入愈创木酚28μL，磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解，冷却后加入30％H

过氧化物酶可使毒性物质失活、调节细胞内氧浓度，对细胞起保护作用。在干旱和盐胁迫下，各株系植株叶片的POD活性均有升高，但LineB，LineG和LineJ株系植株的POD活性均高于WT株系。

(10)过氧化氢酶(CAT)含量的测定

配置0.1M H

过氧化氢酶活性可反映出植物的代谢强度、以及自身的耐胁迫和抗病能力。在干旱和盐胁迫下，各株系植株叶片的CAT活性均有不同程度的升高，且LineB，LineG和LineJ株系植株的CAT活性均高WT株系。

(11)过氧化氢(H

取正常条件和胁迫处理的WT，LineB，LineG和LineJ植株叶片鲜样各0.3g。配置0.05M pH7.4磷酸盐缓冲液。3000r/min离心10min，上清液备用。此为实验用植物酶液。具体操作按照Hydrogen Peroxide assay kit试剂盒进行，3次重复，结果如图16所示。

H

(12)二氨基联苯胺(DAB)和氮蓝四唑染色(NBT)染色

取正常条件和胁迫处理的WT，LineB，LineG和LineJ植株新鲜叶片放入配好的DAB溶液中和NBT溶液中，DAB溶液中叶片需避光浸泡8h后光下放置1h，出现红棕色斑点后用95％的乙醇浸泡脱色后拍照。NBT溶液中处理的叶片则浸泡3h，出现蓝色斑点后浸泡好后用95％的乙醇浸泡脱色后拍照。其结果如图17和图18所示。