改性明胶

技术领域

本发明涉及改性明胶、制备改性明胶的方法、水凝胶、制备水凝胶的方法和适用于制备水凝胶的试剂盒(kit)。

背景技术

水凝胶是能够吸收大量水和/或生物体液的三维亲水性聚合物网络。由于它们的高含水量、多孔性和柔软一致性，它们与天然的活组织非常相似。

水凝胶可用于许多领域—隐形眼镜、伤口敷料、药物递送系统、组织工程和卫生产品中。一些水凝胶可用作有效的基质平台以将细胞包封在3D细胞培养物中。

合成聚合物和天然来源的生物聚合物是被广泛研究的水凝胶前体类型之一。一般来说，合成凝胶基质可以容易地在机械强度和降解速率方面进行优化。然而，合成聚合物支架如聚(乙二醇)衍生的水凝胶(基于PEG)缺乏生物功能性并且不与细胞相互作用。相比之下，天然来源的生物材料诸如胶原、明胶、纤维蛋白和透明质酸能够提供细胞相互作用位点，但是，由于水凝胶网络中孔网尺寸(mesh size)分布较宽，可能会产生较弱的机械性能。对于明胶中的α1和α2链，沿生物聚合物骨架的交联节点之间的距离范围宽，导致三维网络中的机械性能变得不均匀。显然，需要兼具生物功能和合成化学控制的材料。重组明胶提供了控制和细胞相互作用的优选组合。

一种广泛使用的形成水凝胶的方法基于光引发自由基聚合。主要使用以下物质中的丙烯酸酯部分：聚(乙二醇)二丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯化的生物聚合物如明胶、透明质酸和葡聚糖。通过添加光引发剂并曝光，引发聚合并形成水凝胶网络。当暴露于自由基时，(甲基)丙烯酸酯通过链生长机制交联为成百上千个单体长度的链，导致网络不均匀、交联后水凝胶收缩和光学混浊。作为这种聚合方法的缺点之一，我们发现所使用的曝光强度是决定所得水凝胶机械性能的关键。在固定的总曝光条件下，低强度长时间曝光与高强度短时间曝光相比，甲基丙烯酸化的(重组)明胶的最终水凝胶压缩模量的变化超过2倍。低强度导致最柔软的水凝胶并且还导致非常明显的水凝胶混浊。最高曝光强度导致最高刚性连同可接受的光学透明度。显然，当需要在聚合之前包封细胞时，高(UV)曝光并不是优选的。细胞活力可能会受损害。

替代地，在光引发自由基聚合方法中，使用硫醇和烯烃(具有一个或多个烯属不饱和基团，又名“烯”)的混合物作为前体是有益的。添加硫醇前体使反应具有与单独的(甲基)丙烯酸酯的情形不同的特性并具有许多重要优点。硫醇-烯自由基反应在水凝胶形成期间不易受氧抑制的影响。光聚合动力学比甲基丙烯酸酯的光聚合动力学更快，并且聚合需要较少的光引发剂来完成。与单独使用丙烯酸酯的链生长机制相反，硫醇-烯网络是通过逐步生长机制形成的，导致网络均匀且凝胶后收缩可忽略不计。这是有益的，因为它应该导致细胞对水凝胶的机械信号的响应变化较小。此外，在某种应用需要水凝胶包封的蛋白和/或生长因子的情况下，这些分子被硫醇-烯光聚合破坏的程度远低于(甲基)丙烯酸酯作为唯一前体类型时的破坏程度。

然而，光化学交联可能不是最优选的选项可能有多种原因。对于大体积，光路长度可能会变得太长，从而导致曝光强度不均匀。体内应用靶标位点可能会阻挡光线到达样品。需要被包封的细胞类型可能对所需的瞬态光自由基过于敏感，或者最终用户可能没有所需的曝光设备或不方便使用所需的曝光设备。在这类情况下，有必要同时使用细胞相容的点击型反应。

通过使用硫醇化合物和含缺电子“烯”的化合物如丙烯酸酯的组合作为水凝胶前体，得到形成水凝胶的优选的点击型反应。由于低分子量的含硫醇的化合物通常表现出令人不快的气味并且通常对细胞有毒，因此优选将硫醇共价地锚接在大分子量(生物)聚合物上以防止气味和细胞毒性。另一方面，含“烯”的化合物通常没有气味并且可以使用低分子量的前体。然而，已知分子量小于3,000道尔顿的含丙烯酸酯的化合物表现出显著的细胞毒性。这将此类交联剂的使用限制在无包封细胞的应用中。

在一些实施方案中，优选避免使用包含聚(乙二醇)的合成交联剂，而是用缺电子“烯”如丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、马来酰亚胺或乙烯基砜来改性明胶或多糖。如本领域已知，甲基丙烯酰胺或甲基丙烯酸酯基团的添加是使用水溶液中的甲基丙烯酸酐以高产率完成的。这样的生物聚合物型交联剂则通常具有高分子量。此类交联剂的实例是重组明胶(RG)、透明质酸(HA)、硫酸乙酰肝素(HS)、肝素(HP)、硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)和硫酸角质素(KS)的甲基丙烯酸酯化型式。这种生物聚合物交联剂的官能度通常高于4。在一些实施方案中，官能度可以为至少10。

在本发明的一个优选的实施方案中，通过硫醇与缺电子“烯”之间的硫醇-迈克尔加成反应形成水凝胶，而不使用光引发剂。

WO2008/103041描述了用于以下的重组明胶：涉及细胞附着的应用，例如细胞培养工作；涉及锚地依赖细胞的细胞培养的应用；以及各种医学应用。细胞附着在医疗应用中起着重要作用，这类应用诸如伤口治疗(包括人造皮肤材料)、骨骼和软骨(再)生长、植入和人造血管材料以及细胞附着受体的阻断。

发明内容

现已发现可对重组明胶诸如WO2008/103041中描述的重组明胶进行改性，以提供具有有用性能的材料，所述有用性能包括用作制备新型水凝胶的水溶性聚合物。

本发明提供以下发明。

(1)改性明胶，其包含：

(a)赖氨酸残基；和

(b)包含带有硫醇基团的悬垂侧链的赖氨酸残基；

其中所述改性明胶包含至少50μmol/g组分(b)和总共至少450μmol/g组分(a)和(b)。

(2)根据(1)所述的改性明胶，其包含平均距离为17个氨基酸且距离标准偏差为12个氨基酸的组分(a)和(b)。

(3)根据(1)或(2)所述的改性明胶，其中(a)型组分之间、(b)型组分之间、以及(a)型与(b)型组分之间的距离标准偏差小于14个氨基酸残基。

(4)根据(1)至(3)中任一项所述的改性明胶，其重均分子量为15,000至80,000道尔顿。

(5)根据(1)至(4)中任一项所述的改性明胶，其等电点为至少5。

(6)根据(1)至(5)中任一项所述的改性明胶，其中相对于重组明胶中存在的氨基酸总数，RGD基序的百分比为至少0.4％。

(7)根据(1)至(6)中任一项所述的改性明胶，其每250个氨基酸包含至少两个RGD序列。

(8)根据(1)至(7)中任一项所述的改性明胶，其不含半胱氨酸。

(9)制备改性明胶的方法，其包括使包含至少450μmol/g赖氨酸的重组明胶与硫醇化剂(thiolating agent)反应，其中所述改性明胶包含至少50μmol/g衍生自硫醇化剂的硫醇基团。

(10)根据(9)所述的方法，其中所述硫醇化剂包括2-亚氨基硫杂环戊烷、和/或DL-N-乙酰高半胱氨酸硫内酯、和/或其盐。

(11)可通过根据(9)或(10)的方法得到的改性明胶。

(12)水凝胶，其可通过使用点击反应使根据(1)至(8)中任一项或(11)所述的改性明胶与交联剂反应得到。

(13)水凝胶，其可通过根据(12)所述使改性明胶反应得到，其中所述点击反应为硫醇-迈克尔加成反应。

(14)根据(12)或(13)所述的水凝胶，其中所述交联剂包含至少两个烯属不饱和基团。

(15)根据(12)或(13)或(14)所述的水凝胶，其中所述交联剂包含至少一个马来酰亚胺基团。

(16)根据(12)至(15)中任一项所述的水凝胶，其中所述交联剂包含至少一个马来酰亚胺基团和至少一个丙烯酸酯基团。

(17)根据(12)至(16)中任一项所述的水凝胶，其中所述交联剂包含一个且仅一个马来酰亚胺基团和一个且仅一个丙烯酸酯基团。

(18)根据(12)至(17)中任一项所述的水凝胶，其中所述交联剂的Mw为2,000至30,000道尔顿。

(19)根据(12)至(18)中任一项所述的水凝胶，其中添加到改性明胶中的交联剂的摩尔数不足以与改性明胶中存在的所有硫醇基团反应。

(20)根据(12)至(19)中任一项所述的水凝胶，其中添加到改性明胶中的交联剂的摩尔数足以与改性明胶中存在的至多95％的硫醇基团反应。

(21)根据(12)至(20)中任一项所述的水凝胶，其包含0.5至15μmol/g硫醇基团。

(22)根据(12)至(21)中任一项所述的水凝胶，其包含65重量至97.5重量％的水。

(23)根据(12)至(21)中任一项所述的水凝胶，其具有至多10重量％的固体含量。

(24)制备水凝胶的方法，其包括使用点击反应使根据(1)至(8)中任一项或(11)所述的改性明胶与交联剂反应。

(25)试剂盒(kit of parts)，其包括：

a.根据(1)至(8)中任一项或(11)所述的改性明胶；和

b.交联剂。

(26)根据(25)所述的试剂盒，其中所述交联剂包含一个且仅一个马来酰亚胺基团和一个且仅一个丙烯酸酯基团。

(27)根据(25)或(26)所述的试剂盒，其还包括用交联剂使改性明胶交联的说明书。

附图说明

图1示出了使用OPA测定得到的每克含有644.7微摩尔赖氨酸的未经改性的REC1明胶的校准曲线。

图2示出了使用OPA测定得到的每克含有400.3微摩尔赖氨酸的未经改性的CREC1明胶的校准曲线。

具体实施方式

根据本发明的第一方面，提供了一种改性明胶，其包含：

(a)赖氨酸残基；和

(b)包含带有硫醇基团的悬垂侧链的赖氨酸残基；

其中所述改性明胶包含至少50μmol/g组分(b)和总共至少450μmol/g组分(a)和(b)。

除非明确规定，否则本说明书中使用的术语“包括”应解释为要求存在所阐述的部分、步骤或部件，但不排除存在一个或多个额外的部分、步骤或部件。

通过不定冠词“一个”或“一种”提到某要素时，除非上下文明确要求存在一个且仅一个该要素，否则不排除存在多于一个该要素的可能性。因此，不定冠词“一个”或“一种”通常表示“至少一个(种)”。

在本说明书中，前体明胶、改性明胶和水凝胶的所有以μmol/g为单位的量均基于相关材料的干重。

赖氨酸残基和包含带有硫醇基团的悬垂侧链的赖氨酸残基的数量(μmol/g)可以通过下文实施例章节中描述的通用方法来确定。

在第二方面，本发明提供了制备改性明胶的方法，其包括使包含至少450μmol/g赖氨酸的重组明胶与硫醇化剂反应，其中所述改性明胶包含至少50μmol/g衍生自硫醇化剂的硫醇基团。

存在于改性明胶中的衍生自硫醇化剂的硫醇基团的数量(μmol/g)可以通过下文实施例章节中描述的方法来确定。

为了简洁起见，在本发明第二方面的方法中使用的包含至少450μmol/g赖氨酸的重组明胶在本文中缩写为“前体明胶”。天然明胶含有少于450μmol/g赖氨酸。

前体明胶可以通过本领域已知的通用方法得到，例如专利公开EP 0 926 543、EP1014 176、WO 01/34646和WO 2008/03041中描述的方法。用于制备重组明胶的方法也在出版物“High yield secretion of recombinant gelatins by Pichia pastoris”,M.W.T.Werten等人,Yeast 15,1087-1096(1999)中进行了描述。

前体明胶和改性明胶优选包含150至1,000个氨基酸。在本说明书中，术语“氨基酸”和“氨基酸残基”可互换使用。

前体明胶和改性明胶优选具有在18,000至90,000道尔顿的范围内的设计分子量。优选地，制备这些前体明胶和改性明胶的生产方法是精心设计的，并且仅引起最少量的大分子断裂。结果，得到的重均分子量(“WAMW”)在15,000至80,000道尔顿的范围内，且多分散指数pD小于1.2。由于聚合物链断裂最少，WAMW通常仅略低于重组明胶的设计分子量。

与从动物组织中提取的天然明胶相对地，重组明胶的分子量是设计氨基酸序列的结果。理论上，得到了具有确定分子量MW的单分散性大分子。然而，在实践中，由于少量的链断裂，与理想的单分散性存在一些偏差。这导致重均分子量(WAMW)与设计分子量相比有所降低并且多分散指数(pD)略高于1。发现小于17,000或大于90,000道尔顿的设计分子量会产生低收率的低效生产方法，因此不太优选。此外，在处理作为水凝胶形成过程的前体的改性明胶溶液期间，以测得的WAMW大于80,000道尔顿为特征的改性明胶生产批次导致溶液粘度高。太高的粘度限制了在需要水凝胶表面流平的应用中的适用性。

前体明胶和改性明胶优选具有为至少5的等电点。

优选地，前体明胶是富含RGD的重组明胶，其包含至少450μmol/g的赖氨酸，例如包含至少450μmol/g赖氨酸的重组明胶，其中相对于氨基酸总数，RGD基序的百分比为至少0.4(即，按顺序由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成的RGD基序计为“1”，并且相对于前体明胶中存在的氨基酸总数，这样的RGD基序的数量为至少0.4)。因此，在改性明胶中，相对于氨基酸总数，RGD基序的百分比也优选为至少0.4。

当前体明胶或改性明胶包含350个或更多个氨基酸时，优选地，每段(stretch)350个氨基酸中包含至少一个RGD基序。

优选地，前体明胶和改性明胶包含至少450μmol/g的赖氨酸和至少0.6％的RGD基序，更优选至少0.8％，尤其是至少1.0％，更尤其是至少1.2％，最优选至少1.5％的RGD基序。RGD基序百分比为0.4对应于每250个氨基酸中有至少一个RGD基序。RGD基序的数量是整数，因此为了满足至少0.4％的特征，由251个氨基酸组成的前体明胶或改性明胶必须包含至少两个RGD基序。优选地，前体明胶和改性明胶每250个氨基酸包含至少两个RGD基序，更优选每250个氨基酸包含至少三个RGD基序，最优选每250个氨基酸包含至少四个RGD基序。

前体明胶和改性明胶优选包含至少三个RGD基序。在另一个实施方案中，前体明胶和改性明胶包含至少四个RGD基序，优选至少六个、更优选至少八个、甚至更优选至少十二个RGD基序。优选地，前体明胶和改性明胶包含至多二十个RGD基序。前体明胶和改性明胶优选包含赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸残基，尤其是均匀分布的赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸残基。

优选地，前体明胶(和所得改性明胶)包含均匀分布的赖氨酸残基。以这种方式，与硫醇化剂的反应提供了包含均匀分布的赖氨酸残基的改性明胶，所述赖氨酸残基包含带有硫醇基团的悬垂侧链。然后，当改性明胶与交联剂反应时，会产生这样的水凝胶，该水凝胶中改性明胶分子之间的交联均匀分布，以提供更均匀且机械强度更稳健的水凝胶。

通过在本发明的方法中使用重组明胶代替天然明胶，可以确保明胶中存在的赖氨酸残基比在天然明胶中发现的赖氨酸残基数量更多且分布/间隔更均匀。考虑到因为过高的赖氨酸密度意味着其他氨基酸残基(诸如RGD三联体)的量固有地被降低，可能会折损明胶的生物学性能，因此明胶链中赖氨酸残基的优选数量存在上限。因此，明胶中的赖氨酸残基含量和赖氨酸之间沿骨架的平均距离存在最佳值。由于赖氨酸残基为随后交联以形成水凝胶的硫醇化剂(见下文)提供锚定点，在本发明第二方面的方法中使用具有所述含量的赖氨酸残基的重组明胶，在交联后提供具有强大且可调节结构的水凝胶。此外，赖氨酸残基的分布比在天然明胶中更均匀，这提供了具有稳健结构和相对均匀网孔尺寸的所得水凝胶。这种结构的改进对于提供包埋(entrapped)在水凝胶中的任何所需细胞、药物、兽医产品等的控制释放特别有价值。

考虑到出于上述原因需要前体明胶包含均匀分布的赖氨酸残基，优选在根据本发明第二方面的方法中使用的前体明胶包含多个赖氨酸残基，其中赖氨酸残基之间沿骨架测得的平均距离小于24，距离分布的标准偏差小于14AA。更优选地，赖氨酸残基之间的该平均距离小于20AA，标准偏差小于14AA。最优选的是，我们发现平均赖氨酸残基距离为17AA，标准偏差为12AA。这进而提供了一种改性明胶，其包含平均距离为17个氨基酸且距离标准偏差为12个氨基酸的组分(a)和(b)。

通过包括赖氨酸残基之一来计算相邻赖氨酸残基之间的距离(ΔLys)。例如，在序列Lys-Arg-Gly-Lys中，两个赖氨酸残基之间的距离为3个氨基酸残基。前体明胶中赖氨酸残基之间的平均距离(ΔLys

已知前体明胶的氨基酸序列后，可以如下计算ΔLys

[化学式1]

ΔLys

在一个实施方案中，可以由每1000个氨基酸残基包含至少30个赖氨酸残基的另一种重组明胶制备前体明胶。

在一个优选的实施方案中，前体明胶和改性明胶不含半胱氨酸。

在另一个优选的实施方案中，前体明胶和改性明胶不含羟基赖氨酸。

在一个优选的实施方案中，前体明胶包含与SEQ ID NO:1具有至少75％的氨基酸序列相同性，更优选至少76％、78％、80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％的序列相同性的氨基酸序列，或由其组成。在一个特别优选的实施方案中，前体明胶包含SEQ ID NO:1的单体或其变体，或由其组成，诸如包含与SEQ ID NO:1具有上述％的氨基酸序列相同性的氨基酸序列。

WO 2008/103041中描述了与SEQ ID NO:1具有氨基酸序列相同性的前体明胶的制备，并且所述序列在WO 2008/103041中描述为SEQ ID NO:3。

在第二个优选的实施方案中，前体明胶包含与SEQ ID NO:2具有至少75％的氨基酸序列相同性，更优选至少76％、78％、80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％的序列相同性的氨基酸序列，或由其组成。在一个特别优选的实施方案中，前体明胶包含SEQ ID NO:2的单体或其变体，或由其组成，诸如包含与SEQ ID NO:2具有上述％的氨基酸序列相同性的氨基酸序列。

WO 2008/103041中描述了与SEQ ID NO:2具有氨基酸序列相同性的前体明胶的制备，并且所述序列在WO 2008/103041中描述为SEQ ID NO:5。

在一个实施方案中，前体明胶不含硫醇基团。

作为硫醇化剂，可以使用将硫醇(-SH)基团结合到前体明胶上或增加存在于前体明胶中的硫醇基团数量的任何试剂。通常硫醇化剂包含硫醇基团或受保护的硫醇基团以及与赖氨酸中存在的氨基具有反应性的基团。赖氨酸中的氨基通常与硫醇化剂中存在的反应性基团形成共价键，并且当硫醇化剂中存在的硫醇基被保护时，在硫醇化剂与赖氨酸中存在的氨基反应期间或之后除去保护基团。

优选的硫醇化剂包含式-S-C(＝X)-的基团，其中X是S、O或NR

合适的硫醇化剂的实例包括以下(包括第一结构和第三结构的盐形式，例如盐酸盐形式)：

2-亚氨基硫杂环戊烷：

[化学式2]

DL-N-乙酰高半胱氨酸硫内酯：

[化学式3]

N-丁酰基-DL-高半胱氨酸硫内酯：

[化学式4]

优选地，硫醇化剂包括2-亚氨基硫杂环戊烷、和/或DL-N-乙酰高半胱氨酸硫内酯、和/或其盐。

用于使前体明胶与硫醇化剂反应的条件在某种程度上取决于所使用的硫醇化剂。然而，优选前体明胶与硫醇化剂在不存在氧气的情况下反应，例如在惰性气体(例如氮气)覆盖下。如果需要，也可以对用于反应的试剂进行脱气以除去氧气。以这种方式可以避免或降低改性明胶中的硫醇基团被氧化的程度。

优选地，前体明胶与硫醇化剂在7至12、更优选8至11、尤其是9至10.5范围内的pH下反应。可以通过在碱和/或pH缓冲剂的存在下进行反应，来达到所需的pH。

如有必要，可以使用缓冲剂来溶解硫醇化剂。例如，可以通过以60份A(59.3g)与40份B(39.5g)的体积比将0.1摩尔碳酸钠溶液(A)与0.1摩尔碳酸氢钠溶液(B)混合，来制备合适的pH缓冲剂。这种缓冲剂在25℃提供约10.0±0.2的pH值。

另一种可用于溶解硫醇化剂的缓冲剂为由磷酸氢钠和水制备的磷酸盐缓冲剂。可以使用例如盐酸将磷酸盐缓冲剂的pH调节至所需水平(例如8.0)。

优选地，前体明胶与硫醇化剂在例如25至60、更优选30至50、尤其是35至45℃的温度的升温下反应。

优选地，前体明胶与硫醇化剂反应30分钟至5小时、更优选1小时至4小时、尤其是1小时至3小时的时间。

在一个优选的实施方案中，前体明胶与硫醇化剂在金属螯合剂例如乙二胺四乙酸四钠盐的存在下反应。金属螯合剂可用于络合任何可能催化改性明胶中存在的硫醇的氧化的金属。

优选地，通过根据本发明第二方面的方法可以得到或得到根据本发明第一方面的改性明胶。

在本发明第二方面的方法中使用的硫醇化剂与前体明胶的优选的摩尔比，在某种程度上取决于硫醇化剂以及取决于改性明胶所需的硫醇基团的量。例如，增加硫醇化剂与前体明胶的比率可以增加改性明胶中提供的硫醇基团的量，而降低硫醇化剂与前体明胶的比率可以减少改性明胶中提供的硫醇基团的量。

存在于前体明胶中的赖氨酸残基已与硫醇化剂反应以得到改性明胶的程度，在本文中称为改性明胶的DS％。例如，如果前体明胶中一半的赖氨酸残基已与硫醇化剂反应，则认为所得改性明胶的DS％为50％。如果前体明胶中所有的赖氨酸残基都与硫醇化剂反应，则认为所得改性明胶的DS％为100％，依此类推。

换而言之，当本发明第二方面的方法用于制备根据本发明第二方面的改性明胶时，当组分(a)的量与组分(b)的量相同时，则改性明胶的DS％为50％。

本发明人已经发现，可以通过遵循某些配方，来制备具有至多为约100％的任何所需DS％的改性明胶。例如，为了确定如何通过使前体明胶与2-亚氨基硫杂环戊烷反应来制备具有所需DS％为Y％的改性明胶，可以进行以下计算：

为了实现Y％的DS％，每克干前体明胶所需的2-IT的质量(W

W

其中：

Y为待硫醇化的赖氨酸残基所需的％；

L为1g前体明胶中存在的赖氨酸的微摩尔数；和

M1为2-IT的分子量。

当2-IT为其盐酸盐形式时，M1的值为137.6。

为了确定如何通过使前体明胶与DL-N-乙酰高半胱氨酸硫内酯(NAHCTL)反应来制备具有所需DS％为Y％的改性明胶，可以进行以下计算：

为了实现Y％的DS％，每克每克干前体明胶所需的NAHCTL的质量(W

W

其中：

Y为待硫醇化的赖氨酸残基所需的％；

L为1g前体明胶中存在的赖氨酸的微摩尔数；和

M2为NAHCTL的分子量。

NAHCTL的分子量(M2)为159.2。

在上述方程(1)和(2)中，明胶的重量当然为其干重(100％固体)。

为了制备机械上刚性的水凝胶，优选改性明胶具有高DS％，例如30至100％的DS％，更优选50至100％的DS％，尤其是70至100％的DS％。

为了制备更柔软的水凝胶，优选改性明胶具有较低的DS％，例如7至50％的DS％，更优选10至40％的DS％，尤其是10至30％的DS％.

具有在上述两个范围之间的重叠部分的DS％(即，DS％为30至70％)的改性明胶具有中等的柔性和刚性。

根据本发明的第三方面，提供了一种可以通过使改性明胶与交联剂反应得到的水凝胶。在本发明的该第三方面，改性明胶如关于本发明第一方面所定义，和/或改性明胶通过本发明第二方面的方法制备。

交联剂优选包含至少两个烯属不饱和基团。因此，在一个优选的实施方案中，存在于改性明胶中的硫醇基团与交联剂中的烯属不饱和基团形成共价键。以这种方式，形成了这样的水凝胶，其中多个改性明胶分子通过交联剂连接在一起以形成大的结构。当改性明胶与交联剂在水性条件下反应时，通常形成水凝胶。

在一个优选的实施方案中，交联剂包含2至4个烯属不饱和基团。

在一些实施方案中，在用(甲基)丙烯酸酯或(甲基)丙烯酰胺对明胶或多糖改性的情况下，交联剂包含4至50个烯属不饱和基团。

在一个优选的实施方案中，交联剂包含一个或多个聚(氧化烯)基团，尤其是一个或多个聚(氧化乙烯)基团，例如式-(CH

在一个优选的实施方案中，根据本发明第三方面的方法在没有引发剂的情况下(例如在没有光引发剂和热引发剂的情况下)进行。

存在于交联剂中的烯属不饱和基团在化学上可以全部相同，或者交联剂可以包含两个或更多个不同的烯属不饱和基团，尤其是至少两个与硫醇具有不同反应速率的烯属不饱和基团。

优选的烯属不饱和基团为(甲基)丙烯酸类、(甲基)丙烯酰胺、丙烯腈、乙烯基砜和马来酰亚胺基团。

合适的(甲基)丙烯酸类基团的实例包括丙烯酸酯(H

优选的烯属不饱和基团不含酯基团，原因是这可以提高所得水凝胶的稳定性和pH耐受性。不含酯基团的烯属不饱和基团包括(甲基)丙烯酰胺基团、乙烯基砜和马来酰亚胺(尤其优选(甲基)丙烯酰胺基团和马来酰亚胺)。

作为优选的烯属不饱和基团的实例，可以提及下式的基团：

[化学式5]

优选的交联剂包含线性、3-臂或4-臂聚(乙二醇)链和至少两个缺电子碳-碳双键。

优选地，交联剂的Mw为2,000至30,000道尔顿，尤其是3,000至10,000道尔顿。优选的交联剂的实例包括以下交联剂，其中l、m、n和o各自独立地具有3至250的值，并且R

/>

优选的含碳部分含有1至4个碳原子，例如C

在一个实施方案中，交联剂与改性明胶以允许其他组分(例如细胞或药学活性物质)被物理包埋在由该反应形成的网络中的速率反应。因此，根据本发明第一方面的改性明胶与交联剂之间的非常快速的反应(例如反应时间小于1分钟)不是优选的。另一方面，非常缓慢的反应也不是优选的，因为有任何其他成分沉淀的风险(例如细胞沉降)。因此，在一个优选的实施方案中，交联剂与改性明胶完全反应所花费的时间为1分钟至1小时，更优选5分钟至1小时，最优选10分钟至45分钟。

在软水凝胶的一个实施方案中，虽然交联剂可以包含多于2个(例如3或4个)烯属不饱和基团，但是优选交联剂包含2个且仅2个烯属不饱和基团。这种交联剂可以产生具有特别有用性能的水凝胶。

在一个特别优选的实施方案中，交联剂包含至少两个不同的烯属不饱和基团，例如至少两个与硫醇基团具有不同反应速率的不同的烯属不饱和基团，特别是一种烯属不饱和基团与硫醇基团快速反应(例如马来酰亚胺基团)，而一种烯属不饱和基团与硫醇基团相对缓慢反应(例如丙烯酸酯基团)。以这种方式，可以实现交联剂与改性明胶充分反应所需的最佳时间。在该实施方案中，交联剂优选包含聚(乙二醇)基团，例如含有3至500个氧化乙烯单元。

在一个实施方案中，交联剂包含一个且仅一个马来酰亚胺基团以及一个且仅一个丙烯酸酯基团。

在某些实施方案中，交联剂包括选自以下群组的生物聚合物：用烯属不饱和基团改性的多肽、明胶、重组明胶、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素或硫酸皮肤素。在本发明的一个实施方案中，该交联剂包含多于4个烯属不饱和基团。在本发明的另一个实施方案中，交联剂包含多于10个烯属不饱和基团。

例如，可以用甲基丙烯酸酐对明胶进行改性，以产生包含具有甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酰胺基团的改性明胶的交联剂。

可以用甲基丙烯酸酐对重组明胶REC1进行改性，以产生包含具有甲基丙烯酰胺基团的改性REC1的交联剂。

优选地，改性明胶与交联剂在5.0至10.0、更优选6.0至9.0、尤其是6.8至8.0范围内的pH下反应。

优选地，改性明胶与交联剂在没有氧气的情况下反应。例如，改性明胶与交联剂在氮气覆盖下反应，并且任选地已经对与改性明胶接触的任何溶剂(包括水)进行处理以除去氧气(例如，通过真空脱气和/或通过氮气吹扫)。以这种方式，可以避免或减少改性明胶中存在的硫醇基团的氧化程度。

本发明第三方面的一个优点为改性明胶与交联剂的反应不需要存在高浓度的pH缓冲剂以在水凝胶形成期间对抗酸的形成。因此，在一个实施方案中，改性明胶与交联剂在不存在pH缓冲剂的情况下反应，或在水中浓度小于0.1M、更优选小于0.05M的pH缓冲剂的存在下反应。优选地，在改性明胶与交联剂反应期间存在pH缓冲剂时，pH缓冲剂将pH保持在7.0至7.8的范围内。

优选地，改性明胶与交联剂在例如35至39℃、更优选36至38℃、尤其是36.5至37.5℃的温度的升温下反应。

在一个优选的实施方案中，改性明胶与交联剂在金属螯合剂例如乙二胺四乙酸及其盐的存在下反应。金属螯合剂可用于络合任何可能催化改性明胶中存在的硫醇基团的氧化的金属。

任选地，将交联剂以适当的化学计量比添加到改性明胶中，使得改性明胶中的所有硫醇基团与交联剂的烯属不饱和基团反应。优选地，改性明胶中的硫醇基团以相对于交联剂的官能团(略微)过量的方式存在。因此，与改性明胶反应的交联剂的摩尔数优选不足以与改性明胶中存在的所有硫醇基团反应。后者是优选的，因为以这种方式，由改性明胶形成的所得水凝胶包含(未反应或“游离的”)硫醇基团。这种硫醇基团是有用的，因为它们具有抗氧化性能，从而稳定了可能截留在通过交联反应形成的水凝胶中的任何“有效载荷”(例如，细胞和药物活性物质)。

在一个实施方案中，当需要水凝胶包含硫醇基团时，与改性明胶反应的交联剂的摩尔数优选足以与至多95％、更优选20至90％、尤其是40至90％的存在于改性明胶中的硫醇基团反应。

在计算待与改性明胶反应以在所得水凝胶中实现所需交联度的交联剂的量时，将考虑交联剂中存在的烯属不饱和基团的数量。例如，为了在所得水凝胶中实现所需水平的交联(例如，改性明胶中存在的硫醇基团的50％交联)，与包含3个烯属不饱和基团的交联剂相比，包含4个烯属不饱和基团的交联剂的用量更少。类似地，如果交联剂仅包含2个烯属不饱和基团，则需要更多的交联剂来实现相同水平的交联。

鉴于上述情况，改性明胶优选包含300-700μmol/g硫醇基团，更优选400-700μmol/g、尤其是450-700μmol/g硫醇基团。

事实上，可以根据需要调整交联剂与明胶的比率，以得到更硬(更多交联)或更软(更少交联)的水凝胶。

通常，可以通过根据本发明第一方面的改性明胶与交联剂在水性条件下反应，得到根据本发明第三方面的水凝胶。

通常，水凝胶呈现开放的交联网络形式，其中水，和如果需要的话，其他物质(例如细胞或药物)位于网络内。这种水凝胶因其特别是在体内的缓释性能而有用。

优选地，通过其中改性明胶与水的重量比在1至30％、更优选2至15％、尤其是3至12％、更尤其是5至12％的范围内的方法，得到根据本发明第三方面的水凝胶。优选地，水具有非常低的溶解氧含量，例如以重量计，每百万份水的氧含量低于1份。

在一个实施方案中，水凝胶具有至多8重量％、更优选3至8重量％的固体含量。这提供了“软”水凝胶。为了得到“硬”水凝胶，水凝胶优选具有根据本发明第二方面的化合物的高于8重量％、更优选10至30重量％的固体含量。水凝胶的固体含量可以通过执行以下计算来确定：

水凝胶固体含量＝[1-[(W1-W2)/W1]]x 100％。

本发明的水凝胶可用于为各种治疗剂的释放提供空间和时间控制，所述治疗剂包括小分子药物、大分子药物、兽医治疗和细胞。前体明胶、硫醇化剂、交联剂和制备条件的选择能够调整其物理性质、释放速率、以及保护细胞和不稳定药物免于降解的能力。水凝胶的性能可以根据其所需的最终用途进行调整。

根据本发明第二方面的水凝胶通常包含亲水性聚合物链的网络，亲水性聚合物链的网络衍生自与交联剂反应的改性明胶中的硫醇基团。水凝胶优选为果冻状的。水凝胶优选具有与天然组织非常相似的一定程度的柔韧性，部分归因于其显著的水含量。

水凝胶优选包含其量为65至97.5重量％、更优选75至97重量％，最优选80至97重量％的水。水凝胶的水含量可以简单地通过在冷冻干燥之前(W1)和冷冻干燥之后(W2)称量水凝胶并进行以下计算来确定：

水凝胶的水含量＝[(W1-W2)/W1]x 100％。

如上所提到，如果使用不足以与改性明胶中存在的所有硫醇基团反应的交联剂来制备水凝胶，则产生包含硫醇基团的水凝胶。这样的硫醇基团是有用的，因为它们可以充当抗氧化剂，例如，来保护可能存在于水凝胶中的任何物质(例如细胞或药物)。因此，在一个优选的实施方案中，水凝胶包含硫醇基团，例如衍生自用于制备改性明胶的硫醇化剂。在一个优选的实施方案中，水凝胶包含每克水凝胶(包括水凝胶中存在的水)0.3至60μmol硫醇基团，更优选0.5至15μmol硫醇基团。可以通过将水凝胶切成小块并进行硫醇定量测定，例如Ellman测定，来确定水凝胶的硫醇含量。

取决于水凝胶的预期用途，可能需要机械上刚性水凝胶或软水凝胶。例如，对于需要包封细胞的医学目的，优选水凝胶为柔软的，例如具有小于100kPa的压缩模量(E)。

相比之下，对于预期用于诸如角膜组织置换的水凝胶，水凝胶优选具有110至600kPa、更优选200至600kPa的压缩模量(E)。

对于软组织应用和细胞治疗应用，水凝胶优选具有100至20,000Pa、更优选200至5,000Pa的压缩模量(E)。

压缩模量可以使用流变仪例如通过以下实施例章节中描述的方法测定。

优选的压缩模量可以通过选择具有所需量的赖氨酸残基的前体明胶、控制明胶前体中赖氨酸残基被硫醇化的程度、然后选择用交联剂交联改性明胶中硫醇基团的程度来实现。一般来说，机械上刚性的水凝胶具有高水平的交联，因此要制备这些水凝胶，将选择具有高赖氨酸含量的明胶前体，使其与大量硫醇化剂反应以产生具有高DS％的改性明胶，然后使用大量交联剂高度交联具有高DS％的改性明胶。相比之下，一般来说，软水凝胶的交联度较低，因此为了制备这些软水凝胶，会选择具有较低赖氨酸含量的明胶前体，将其与较少量的硫醇化剂反应，以产生具有低或中等DS％的改性明胶，然后使用交联剂使具有低或中等DS％的改性明胶交联。替代地，为了制备软水凝胶，可以选择具有高赖氨酸含量的明胶前体，但仅使一小部分赖氨酸残基与硫醇化剂反应，以产生具有低硫醇含量的改性明胶，然后使用交联剂使具有低硫醇含量的改性明胶交联。

为了制备机械上刚性的水凝胶，优选交联剂具有低分子量Mw，例如在250至1,000Da范围内的Mw(例如实施例中描述的MAL-PEG-MAL)。

为了制备可用于细胞包封的水凝胶，交联剂优选包含至少两个能够与硫醇基团(例如实施例中描述的AC-PEG-MAL)反应的不同的烯属不饱和基团，并且具有至少3,000道尔顿的分子量，以使细胞毒性作用最小化。

本发明的水凝胶可用于医学领域，例如用于再生细胞应用中。水凝胶本身可以为细胞和药学物质提供安全的环境。

本发明的水凝胶具有特别好的光学透明度，并且对于制备隐形眼镜和修复人眼内组织具有特别的价值。此外，它们可用于许多医学分支的细胞和药物递送，包括心脏病学、肿瘤学、免疫学、伤口修复和愈合、以及疼痛管理。

本发明的水凝胶具有优异的光学透明性、高压缩模量、高刚性和良好的储存稳定性。此外，通过交联改性明胶中存在的非全部硫醇基团，就可以提供具有抗氧化性能的水凝胶，使其在某些医学应用中具有特别的价值，例如通过注射递送治疗性细胞。

根据本发明第四方面，提供了包含根据本发明第三方面的水凝胶的隐形眼镜或角膜。

根据本发明第五方面，提供了一种试剂盒(kit of parts)，其包括：

(i)根据本发明第一方面的改性明胶；和

(ii)交联剂。

在该试剂盒中，优选的改性明胶和交联剂分别如上文关于本发明第一、第二和第三方面所述。

优选地，试剂盒还包括用交联剂使改性明胶交联的说明书，尤其是以与改性明胶反应的交联剂的摩尔数不足以与改性明胶中存在的所有硫醇基团反应的方式交联。

组分(i)优选储存在气密容器中，尤其是在真空下或在惰性气体(例如氮气)覆盖下。以这种方式，可以确保改性明胶中存在的硫醇基团在储存或运输期间不会氧化。

本发明试剂盒的一个优点为，(i)与(ii)的反应不会引起显著的pH变化，并且通常不需要缓冲剂来制备水凝胶。这有助于局部制备含有对pH敏感物质和细胞的水凝胶。细胞通常不能耐受高pH缓冲剂浓度时经常出现的高离子强度。科研人员等可以使用试剂盒来局部制备含有他们感兴趣的细胞或物质的水凝胶。

本发明的水凝胶可用于多种用途，包括制备隐形眼镜、角膜、伤口敷料、药物递送系统、细胞递送(包括通过注射)、组织工程产品和卫生产品。水凝胶具有特别好的机械稳定性。

本发明的另一个优点为可以调节硫醇化程度，以提供具有针对特定最终用途定制的性能的水凝胶。可以制备包含特定量的游离硫醇基团(例如，以提供具有抗氧化性能的水凝胶)和所需交联程度(例如，以提供具有所需硬度、柔软度、降解和释放速率的水凝胶)的水凝胶。

现在将用以下非限制性实施例来说明本发明，除非另有说明，否则其中所有份数和百分比均以重量计。

实施例

实施例中使用了以下缩写：

REC1为MW为51,200道尔顿的重组明胶，其包含645μmol/g的赖氨酸，并具有如下所示的氨基酸序列SEQ ID NO:1。REC1通过WO 2008/103041中描述的方法得到，并且在其中描述为SEQ ID NO:3。赖氨酸残基之间的平均距离为16.6AA，标准偏差为11.7AA。

REC2为MW为81,100道尔顿的重组明胶，其包含646μmol/g的赖氨酸，并具有如下所示的氨基酸序列SEQ ID NO:2。REC2通过WO 2008/103041中描述的方法得到，并且在其中描述为SEQ ID NO:5。赖氨酸残基之间的平均距离为16.8AA，标准偏差为11.8AA。

CREC1为MW为45,000道尔顿的比较重组明胶，其包含400μmol/g的赖氨酸，并具有如下所示的氨基酸序列SEQ ID NO:3。CREC1通过EP 2,902,413中描述的方法得到，并且在其中描述为SEQ ID NO:1。赖氨酸残基之间的平均距离为26.3AA，标准偏差为17.4AA。

CREC2为MW为72,500道尔顿的比较重组明胶，其包含442μmol/g的赖氨酸，并且具有如下所示的氨基酸序列SEQ ID NO:4。CREC2通过US 8,101,205中描述的方法得到，并且在其中描述为SEQ ID NO:1。赖氨酸残基之间的平均距离为24.7AA，标准偏差为14.5AA。

EDTA为乙二胺四乙酸四钠盐二水合物(一种金属螯合剂，用于减少硫醇基团的金属催化氧化)，得自Sigma-Aldrich。

2-IT为从Sigma-Aldrich得到的2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐(硫醇化剂)(mwt＝137.63g/mol)。

NAHCTL为从Sigma-Aldrich得到的DL-N-乙酰高半胱氨酸硫内酯(硫醇化剂)(mwt＝159.21g/mol)。

MAnh为从Sigma-Aldrich得到的甲基丙烯酸酐(甲基丙烯酸酯化剂)(mwt＝154.16g/mol)。

CB10为如下制备的碳酸盐缓冲剂(pH 10)：通过称取2.13g Na

PB8为一种磷酸盐缓冲剂(pH 8)，其通过如下来制备：将磷酸氢二钠二水合物(5.37g)在无菌净化水(150cm

PBS为一种缓冲剂，其通过如下来制备：使用无菌净化水将市售得到的“10倍浓缩的”无菌磷酸盐缓冲盐水溶液(来自Sigma-Aldrich)稀释十倍。

PEG-AC4为包含四个丙烯酸酯基团和四个聚(乙二醇)链的交联剂，其以产品名称PSB-423得自美国Creative PEGWorks。根据供应商的说法，这种交联剂的Mw为5,000，并具有以下通用结构：

[化学式7]

AC-PEG-AC 1为包含两个丙烯酸酯基团和一个聚(乙二醇)链的交联剂，其以产品名称ACRL-PEG-ACRL-3400得自Laysan Bio Inc.。根据供应商的说法，这种交联剂的Mw为3,400，并具有以下通用结构：

[化学式8]

AC-PEG-MAL1为包含一个聚乙二醇链、一个丙烯酸酯基团和一个马来酰亚胺基团的交联剂，其以产品名称ACRL-PEG-MAL-3400得自Laysan Bio Inc.。根据供应商的说法，这种交联剂的Mw为3,400，并具有以下通用结构：

[化学式9]

AC-PEG-MAL2为包含一个聚乙二醇链、一个丙烯酸酯基团和一个马来酰亚胺基团的交联剂，其以产品名称ACRL-PEG-MAL-5000得自Laysan Bio Inc.。根据供应商的说法，这种交联剂的Mw为5,000，并具有以下通用结构：

[化学式10]

MAL-PEG-MAL为1,11-双马来酰亚胺基-三乙二醇，一种具有以下结构的来自Sigma-Aldrich的Mwt为352g/mol的市售可得的交联剂：

[化学式11]

FITC-葡聚糖150kD、4kD为得自Sigma-Aldrich的异硫氰酸荧光素-葡聚糖。

REC1(SEQ ID NO:1):

GAPGAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPPGAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPPGAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPPG

REC2(SEQ ID NO:2):

GAPGAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPPGAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPPGAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPPGAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPPGAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPPG

CREC1(SEQ ID NO:3):

GPQGARGQPGVMGFPGPKGANGEPGKAGEKGLPGAPGLRGLPGKDGEAGAAGPPGPAGPAGERGEQGAPGPPGFQGLPGPPGPPGEGGKPGDQGVPGEAGAPGLVGPRGERGFPGERGAPGAQGLQGPRGLPGAPGPDGPKGAAGPAGPPGAQGPPGLQGMPGERGAAGIAGPKGDRGDVGEKGPEGAPGKDGGRGLGGPIGPPGPAGANGEKGEVGPPGPAGAAGARGAPGERGEAGPPGPAGFAGPPGADGQPGAKGEQGEAGQKGDAGAPGPQGPGGAPGPQGPAGVAGPKGARGAQGPPGAAGFPGAAGRVGPPGLQGNPGPPGPPGPAGKDGPKGARGDAGPPGRAGEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPPGAEGPPGPQGLAGQRGIVGLPGQRGERGFPGLPGPAGEPGKQGAPGAAGDRGPPGPVGPPGLAGPAGEPGREGGPGADGPPGRDGAAGVKGDRGEAGAVGAPGAPGPPGAPGPAGPPGPQGDRGEAGAQGP

CREC2(SEQ ID NO:4):

GPPGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGPAGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGPAGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGPAGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGPAGG

测定

计算每克前体明胶的赖氨酸的微摩尔数

可以通过每克干明胶除以赖氨酸的微摩尔数，来计算重组明胶中存在的赖氨酸的μmol/g数。更具体地，在知晓含N氨基酸残基的重组明胶的氨基酸序列的情况下，可以进行以下计算：

1.首先，使用残基组成和已知的每个氨基酸的原子重量，来计算每个氨基酸残基的分子量(AA

2.然后，对于每种重组明胶，每个残基(AA

3.将明胶序列中所有残基种类的总分子量相加，得到值W(W＝Σ

4.然后从W值减去水分子量的(N-1)倍，以得到明胶总分子量W

5.最后，每摩尔明胶中的赖氨酸数n

改性明胶中存在的赖氨酸的μmol/g数可以类似的方式确定，并且可以在已知前体明胶中存在的赖氨酸和硫醇化剂的μmol/g数以及改性明胶的DS％的情况下计算得出。

每克前体明胶的赖氨酸的μmol数的测定

每克前体明胶的赖氨酸的数量可以使用分光光度测定，采用邻苯二甲醛(OPA测定)或三硝基苯磺酸(TNBS测定)来确定。OPA测定结果在当前文件中给出。TNBS测定结果与OPA测定结果一致且未给出。

衍生自硫醇化剂的硫醇基团的量

(相当于包含带有硫醇基团的悬垂侧链的赖氨酸残基的量)

邻苯二甲醛(“OPA”)测定

使用包括邻苯二甲醛、和类似于2-巯基乙醇的低分子量硫醇辅助化合物、以及荧光检测的胺定量测定，间接确定改性明胶中存在的硫醇基团的量(μmol/g)。与原始前体明胶中赖氨酸胺基团的数量相比，改性明胶中赖氨酸胺基团数量的减少，与因硫醇化反应而结合到改性明胶中的硫醇基团的数量相关。

将Sensolyte

在这些测定结果中，在还原剂存在下，邻苯二甲醛(OPA)与前体明胶和改性明胶的赖氨酸残基中的伯胺基团(-NH

该测定根据制备商提供的方案(修订版1.1，2014年10月)进行。

[化学式12]

方案1.OPA与重组明胶(“REC”)中的伯胺基团的化学反应

OPA测定方案

首先，根据公开的方案绘制前体明胶的校准曲线。在Ex/Em＝340/460nm下，使用Biotek酶标仪FLX800，使用黑色孔板测定荧光强度。从空白对照物读取的的荧光读数为背景荧光。对于所有样品，从其他孔的读数中减去该背景读数，以得到相对荧光单位(RFU)。

对于每种明胶，使用该测定来记录校准曲线，参见下图表(图1和图2中所示)中的REC1的实例。我们从校准曲线可以推断，每摩尔赖氨酸的相对荧光强度近似于每μM浓度(1.44±0.07)x 10

由于样品的REC-SH分子量(未知)依赖于DS，不可能将样品重量直接转换为样品摩尔数。相反，我们有一组有两个未知数(即，REC-SH分子量(Z)和每分子REC的改性赖氨酸的数量(x))的两个方程，并对这两个未知数求解。

待解方程

[化学式13]

Z＝P+xQ方程3。

其中Z为改性REC的分子量，P为未改性REC的分子量，Q为由于每个REC分子的x个官能团的偶联而导致的REC分子量的增加。这取决于所使用的硫醇化试剂(SH1或SH2)。由每条链的残留伯胺所产生的溶液中(OPA标记的)胺的浓度(Nf)由下式给出：

[化学式14]

其中W为改性REC的干质量，W/V为最终稀释时的样品浓度，单位为克/升，且N

使用测得的发射结果方程4重新排列为：

[化学式15]

其中RFU

然后通过一些简单的数学运算出x，产生了方程6中x的解。

[化学式16]

/>

通过x，我们获知了MG的改性水平(DS％＝x/N

TNBS测定方案

自Okuyama和Satake在1960年首次合成TNBS以来，已经公开了许多TNBS测定方案。优选的方案为Bubnis和Ofner在Analytical Biochemistry,1992,第207卷,第129-133页公开的方案。在该方案中，在40℃将已知干重的明胶以溶液与过量的TNBS试剂在为8.5的碱性pH下混合4小时。在此期间，TNBS试剂与所有赖氨酸ε-胺基团反应，并用发色团对这些基团进行标记，该发色团可使用UV/VIS分光光度计在346nm波长处检测和定量。该方案可用于分析任何含有赖氨酸的明胶或多糖，但是存在硫醇的情况除外，原因是这些硫醇与赖氨酸胺竞争TNBS标记剂。

通过GPC-MALS测定MAWM

可以由本领域技术人员通过检查氨基酸序列，并对所有残基求和，而容易地得到重组明胶的理论分子量MW。改性明胶的MW则可以通过用所使用的硫醇化试剂针对改性赖氨酸残基数量对REC的MW进行校正来推导。然而，实际的重组明胶生产过程会产生具有少量切割片段的重组明胶，从而得到一些大分子多分散性。可以通过装配有多角度光散射检测器(MALS)的凝胶渗透色谱(GPC)检测和量化该多分散性。这种检测器测定色谱图中每种组分的绝对分子量。推导出数均分子量NAMW和重均分子量WAMW对于本领域技术人员来说则是直接的。此外，通常的做法是使用由关系式pD＝WAMW/NAMW定义的指数pD来描述多分散性。

压缩模量

在37℃在PBS溶液中平衡后，通过使用直径为8mm的平压头，用Anton-Paar MCR-301流变仪进行压头计(indenter)测试，来确定水凝胶的压缩模量E(kPa)。间隙尺寸以小且规律的步阶(应变)降低，并记录法向力(应力)。然后使用应力-应变曲线中的直线部分来找到压缩模量。

实施例1

使用硫醇化剂NAHCTL制备改性明胶MG1

将每克包含超过450μmol/g的赖氨酸的重组明胶(REC1，8.23g)称量到125ml的Corning(Costar)聚苯乙烯无菌瓶中，并添加CB10(82.28g)。将装有该混合物的瓶子剧烈摇动，然后放入50℃的水浴中。在约15至20分钟内，重组明胶完全溶解并且将瓶子从水浴中取出。然后将重组明胶在PB10中的溶液转移到三颈圆底烧瓶中。转移的结果是损失了2.32g(2.6wt％)的溶液。因此转移到三颈圆底烧瓶中的溶液量为88.19g。因此，实际转移到烧瓶中的重组明胶量为8.02g(不考虑初始水分含量)。添加EDTA(0.026g)在PBS(1.4cm

在40℃用氮气将烧瓶连续吹扫1小时。然后，在40℃以5000rpm搅拌烧瓶内容物并继续用氮气吹扫的同时，添加硫醇化剂(NAHCTL,1.572g)。在反应3小时后，将烧瓶从水浴中取出，并使用盐酸(1M)将烧瓶内容物的pH降低至pH为5.1(同时继续吹扫)。然后用净化水(约150cm

透析

在35℃，将滤液转移到透析管(30cm长，截留分子量为14k Da，获自Spectra/PorRC)中，且将透析管纤维素膜(D9402，平均平叠宽度为76mm(3.0英寸)，Sigma)放入装有10升用氮气吹扫的去离子水的10L玻璃烧杯中。继续进行氮气吹扫，同时稍稍加热烧杯中存在的水，以保持约35℃的水温。对于烧杯中的水，每3小时用10升用氮气吹扫的水更换一次，总共历时2天。

冷冻干燥

将透析管内容物收集在冷冻容器中，在-40℃冷冻，并在-15℃在Zirbus升华器中冻干4天。然后收集所得的改性明胶MG1的干燥样品，称重，分装在多个无菌Twirl采样袋中并储存在-20℃的冰箱中。以90％的收率得到改性明胶MG1，为白色纤维饼状材料。

发现MG1含有584.7μmol/g衍生自硫醇化剂的硫醇基团。

实施例2

使用硫醇化剂2-IT制备改性明胶MG2

将REC1(8.06g)装入125ml Corning瓶中。然后添加缓冲剂CB10(76.45g)，然后将瓶子置于50℃的浴中。手动定期摇动瓶子，直到得到REC1在缓冲剂中的均匀溶液。添加EDTA(0.022g)，然后将混合物转移到配有氮气吹扫入口的100ml三颈圆底烧瓶中。将磁力搅拌器(彗星型)与温度计一起放置在烧瓶中。将Schlenk型Liebig冷凝器安装到烧瓶上，顶部为带玻璃旋塞的适配器。在搅拌下用氮气吹扫烧瓶至少一小时后，在41℃的温度和搅拌下，将硫醇化剂(2-IT，897.6mg)在缓冲剂PB8(7.0g)中的溶液添加到烧瓶中。在41℃搅拌1小时后，用湿氮气连续吹扫，收集烧瓶内容物(90.52g)，并在室温下用氮气吹扫的无菌水(209.75g)稀释，然后使用0.22mu Corning瓶顶过滤器真空过滤以去除任何固体。滤液的体积为大约300cm

透析

在35℃，将滤液转移到透析管(30cm长，截留分子量为14kDa，获自Spectra/PorRC)中，且将透析管纤维素膜(D9402，平均平叠宽度为76mm(3.0英寸)，Sigma)放入装有10升用氮气吹扫的去离子水的10L玻璃烧杯中。继续进行氮气吹扫，同时稍稍加热烧杯中存在的水以保持约35℃的水温。对于烧杯中的水，每3小时用10升用氮气吹扫的水更换一次，总共历时2天。

冷冻干燥

将透析管内容物收集在冷冻容器中，在-40℃下冷冻，并在-15℃在Zirbus升华器中冻干4天。然后收集所得的改性明胶MG2的干燥样品，称重，分装在多个无菌Twirl采样袋中并储存在-20℃的冰箱中。以93％的收率得到改性明胶MG2，为白色纤维饼状材料。

发现MG2含有605.2μmol/g衍生自硫醇化剂的硫醇基团。

实施例3至10和比较例CEx1至CEx4

重复实施例1的通用方法，不同之处在于，以所示量使用下表1中所示的重组明胶和硫醇化剂，得到改性明胶MG3至MG10和比较改性明胶CMG1至CMG4。在表1中，使用NAHCL硫醇化的重组明胶遵循上述实施例1的通用方法，使用2-IT硫醇化的重组明胶遵循上述实施例2的通用方法。为完整起见，表1还包括MG1和MG2。

[表1]

表1.重组明胶与硫醇化剂的反应

*这也是包含带有硫醇基团的悬垂侧链的赖氨酸残基的量。

实施例11-水凝胶(HG1)的制备

水凝胶的制备

第1阶段-制备含有改性明胶MG1的溶液

使用镊子，将MG1样品(115.6mg)推入容量为15cm

第2阶段-制备含有交联剂的溶液

将PEG-AC4(84.5mg)样品溶解在已用氮气吹扫以去除氧气的PBS缓冲剂(1.022cm

第3阶段-制备水凝胶HG1

在氮气气氛下将溶液2(1.111g)添加到溶液1(889mg)中并使用IKA涡旋器将这两种溶液充分混合。然后将所得混合物放入模具中，加盖以防止变干并在37℃储存16小时。随后，将水凝胶浸没在37℃的PBS溶液中再次历时24小时以达到平衡。所得水凝胶HG1具有下表2中所示的性能。

实施例12至26和比较例CEx5至CEx11-制备其他水凝胶

重复实施例11的通用方法，不同之处在于，以所示量使用下表2中所示的改性明胶和交联剂，得到如最后一列中所示的水凝胶HG2至HG13和比较改性水凝胶CHG1和CHG2。为完整起见，表2还包括HG1。每种水凝胶包含约90重量％的水和10重量％的由相关改性明胶和交联剂反应形成的化合物。

[表2]

表2.改性明胶与交联剂反应以形成化合物和水凝胶

§：凝胶-时间t的范围：

A：10分钟

B：45分钟

C：t<10分钟或t>2小时(不可接受)。

在37℃，包封的FITC-葡聚糖150kD从1mm厚的水凝胶中释放的分数；

A：R>90％(最优选)；

B：75％

C：R<75％(不可接受)；

！！：未凝胶化。

ND表示未确定。

水凝胶的测试

透明度

发现本发明的水凝胶具有优异的透明度。

压缩模量

下表3所列水凝胶的压缩模量通过上述方法测定，结果如下表3所示：

[表3]

表3.水凝胶的压缩模量

注1：明胶中lys-lys距离份标准偏差SD

注2：在表3中，

A：200

B：110

C：E<110kPa。

注3：这也是包含带有硫醇基团的悬垂侧链的赖氨酸残基的量。

本发明和比较性水凝胶的释放性能

在水溶性荧光标记物(FITC-葡聚糖150kD，4kD)的存在下制备上表2中描述的水凝胶。然后将包含标记物的水凝胶置于37℃的PBS溶液中，并通过荧光光谱测定标记物随时间从水凝胶中释放的速率。实验表明，与衍生自含有少于所要求的赖氨酸量的重组明胶的比较性水凝胶相比，根据本发明的水凝胶具有更快的释放性能。这意味着，与比较例相比，本发明的水凝胶在使溶质能够通过水凝胶网络扩散方面更好。因此，本发明的水凝胶更适合于医疗用途，诸如细胞包封。

序列表

<110> 富士胶片株式会社

<120> 改性明胶

<130>　20F01035W1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 571

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：重组明胶

<400> 1

Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly

1 5 1015

Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu

202530

Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro

354045

Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly

505560

Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala

65707580

Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro

859095

Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly

100 105 110

Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val

115 120 125

Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro

130 135 140

Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly

145 150 155 160

Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala

165 170 175

Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro

180 185 190

Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly

195 200 205

Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp

210 215 220

Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln

225 230 235 240

Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly

245 250 255

Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys

260 265 270

Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg

275 280 285

Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly

290 295 300

Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu

305 310 315 320

Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro

325 330 335

Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly

340 345 350

Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala

355 360 365

Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro

370 375 380

Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly

385 390 395 400

Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro

405 410 415

Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro

420 425 430

Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly

435 440 445

Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val

450 455 460

Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala

465 470 475 480

Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly

485 490 495

Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro

500 505 510

Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln

515 520 525

Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly

530 535 540

Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys

545 550 555 560

Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly

565 570

<210> 2

<211> 949

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：重组明胶

<400> 2

Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly

1 5 1015

Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu

202530

Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro

354045

Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly

505560

Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala

65707580

Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro

859095

Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly

100 105 110

Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val

115 120 125

Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro

130 135 140

Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly

145 150 155 160

Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala

165 170 175

Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro

180 185 190

Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly

195 200 205

Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp

210 215 220

Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln

225 230 235 240

Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly

245 250 255

Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys

260 265 270

Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg

275 280 285

Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly

290 295 300

Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu

305 310 315 320

Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro

325 330 335

Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly

340 345 350

Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala

355 360 365

Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro

370 375 380

Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly

385 390 395 400

Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro

405 410 415

Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro

420 425 430

Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly

435 440 445

Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val

450 455 460

Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala

465 470 475 480

Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly

485 490 495

Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro

500 505 510

Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln

515 520 525

Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly

530 535 540

Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys

545 550 555 560

Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln

565 570 575

Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly

580 585 590

Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala

595 600 605

Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg

610 615 620

Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly

625 630 635 640

Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu

645 650 655

Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro

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Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly

675 680 685

Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro

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Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro

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Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly

725 730 735

Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val

740 745 750

Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro

755 760 765

Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly

770 775 780

Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala

785 790 795 800

Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala

805 810 815

Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly

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Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro

835 840 845

Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys

850 855 860

Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly

865 870 875 880

Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro

885 890 895

Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg

900 905 910

Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly

915 920 925

Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu

930 935 940

Ala Gly Pro Pro Gly

945

<210> 3

<211> 506

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：重组明胶

<400> 3

Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Gln Pro Gly Val Met Gly Phe Pro Gly

1 5 1015

Pro Lys Gly Ala Asn Gly Glu Pro Gly Lys Ala Gly Glu Lys Gly Leu

202530

Pro Gly Ala Pro Gly Leu Arg Gly Leu Pro Gly Lys Asp Gly Glu Ala

354045

Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly

505560

Glu Gln Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro

65707580

Pro Gly Pro Pro Gly Glu Gly Gly Lys Pro Gly Asp Gln Gly Val Pro

859095

Gly Glu Ala Gly Ala Pro Gly Leu Val Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly

100 105 110

Phe Pro Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Ala Gln Gly Leu Gln Gly Pro

115 120 125

Arg Gly Leu Pro Gly Ala Pro Gly Pro Asp Gly Pro Lys Gly Ala Ala

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Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Leu Gln Gly

145 150 155 160

Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile Ala Gly Pro Lys Gly Asp

165 170 175

Arg Gly Asp Val Gly Glu Lys Gly Pro Glu Gly Ala Pro Gly Lys Asp

180 185 190

Gly Gly Arg Gly Leu Gly Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly

195 200 205

Ala Asn Gly Glu Lys Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala

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Ala Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Glu Ala Gly Pro Pro

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260 265 270

Pro Gly Pro Gln Gly Pro Gly Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Pro Ala

275 280 285

Gly Val Ala Gly Pro Lys Gly Ala Arg Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly

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Ala Ala Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly Arg Val Gly Pro Pro Gly Leu

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Gln Gly Asn Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Lys Asp

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Gly Pro Lys Gly Ala Arg Gly Asp Ala Gly Pro Pro Gly Arg Ala Gly

340 345 350

Glu Pro Gly Leu Gln Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Glu

355 360 365

Pro Gly Asp Asp Gly Pro Pro Gly Ala Glu Gly Pro Pro Gly Pro Gln

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Gly Leu Ala Gly Gln Arg Gly Ile Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg Gly

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Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly Lys

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Gln Gly Ala Pro Gly Ala Ala Gly Asp Arg Gly Pro Pro Gly Pro Val

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Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly Arg Glu Gly

435 440 445

Gly Pro Gly Ala Asp Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly Ala Ala Gly Val

450 455 460

Lys Gly Asp Arg Gly Glu Ala Gly Ala Val Gly Ala Pro Gly Ala Pro

465 470 475 480

Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly

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Asp Arg Gly Glu Ala Gly Ala Gln Gly Pro

500 505

<210> 4

<211> 821

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：重组明胶

<400> 4

Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Pro Thr Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly

1 5 1015

Glu Arg Gly Gly Pro Gly Ser Arg Gly Phe Pro Gly Ala Asp Gly Val

202530

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Gly Pro Lys Gly Ser Pro Gly Glu Ala Gly Arg Pro Gly Glu Ala Gly

505560

Leu Pro Gly Ala Lys Gly Leu Thr Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Pro

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Arg Gly Val Pro Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Pro Ala Gly Lys Asp

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Glu Arg Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Phe Gln Gly Leu

165 170 175

Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Glu Gln

180 185 190

Gly Val Pro Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly

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210 215 220

Pro Gly Ser Arg Gly Phe Pro Gly Ala Asp Gly Val Ala Gly Pro Lys

225 230 235 240

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245 250 255

Ser Pro Gly Glu Ala Gly Arg Pro Gly Glu Ala Gly Leu Pro Gly Ala

260 265 270

Lys Gly Leu Thr Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Pro Asp Gly Lys Thr

275 280 285

Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln Asp Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly

290 295 300

Pro Pro Gly Ala Arg Gly Gln Ala Gly Val Met Gly Phe Pro Gly Pro

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Lys Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly Lys Ala Gly Glu Arg Gly Val Pro

325 330 335

Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Pro Ala Gly Lys Asp Gly Glu Ala Gly

340 345 350

Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Glu

355 360 365

Gln Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ala

370 375 380

Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Glu Gln Gly Val Pro Gly

385 390 395 400

Asp Leu Gly Ala Pro Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly Pro

405 410 415

Thr Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Ser Arg

420 425 430

Gly Phe Pro Gly Ala Asp Gly Val Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ala Gly

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Ala Gly Arg Pro Gly Glu Ala Gly Leu Pro Gly Ala Lys Gly Leu Thr

465 470 475 480

Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Pro Asp Gly Lys Thr Gly Pro Pro Gly

485 490 495

Pro Ala Gly Gln Asp Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala

500 505 510

Arg Gly Gln Ala Gly Val Met Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Ala Ala

515 520 525

Gly Glu Pro Gly Lys Ala Gly Glu Arg Gly Val Pro Gly Pro Pro Gly

530 535 540

Ala Val Gly Pro Ala Gly Lys Asp Gly Glu Ala Gly Ala Gln Gly Pro

545 550 555 560

Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Glu Gln Gly Pro Ala

565 570 575

Gly Ser Pro Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly

580 585 590

Glu Ala Gly Lys Pro Gly Glu Gln Gly Val Pro Gly Asp Leu Gly Ala

595 600 605

Pro Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly Pro Thr Gly Leu Pro

610 615 620

Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Ser Arg Gly Phe Pro Gly

625 630 635 640

Ala Asp Gly Val Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ser

645 650 655

Pro Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Ser Pro Gly Glu Ala Gly Arg Pro

660 665 670

Gly Glu Ala Gly Leu Pro Gly Ala Lys Gly Leu Thr Gly Ser Pro Gly

675 680 685

Ser Pro Gly Pro Asp Gly Lys Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln

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Asp Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Gln Ala

705 710 715 720

Gly Val Met Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly

725 730 735

Lys Ala Gly Glu Arg Gly Val Pro Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Pro

740 745 750

Ala Gly Lys Asp Gly Glu Ala Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala

755 760 765

Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly

770 775 780

Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Lys

785 790 795 800

Pro Gly Glu Gln Gly Val Pro Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gly Pro Ser

805 810 815

Gly Pro Ala Gly Gly

820