筋骨草类物质中总环烯醚萜的含量测定方法及应用

技术领域

本申请属于医药技术领域，具体涉及筋骨草类物质中总环烯醚萜的含量测定方法及应用。

背景技术

筋骨草提取物的原植物筋骨草产于福建，为唇形科植物筋骨草(金疮小草)Ajugadecumbens Thunb的干燥全草。筋骨草性味苦寒，具有清热泻火、消肿解毒的功效。在我国福建民间药用历史悠久。根据民间多年的用药经验，总结出筋骨草对多种细菌性疾病有消炎抗菌及抑制功能，在治疗盆腔炎、阴道炎、附件炎、宫颈糜烂、子宫肌瘤等妇科炎症以及尿道炎等方面，具有很好的临床疗效。筋骨草还具有很强的抗肿瘤作用，对不同时期的胃肠、肝、肺恶性肿瘤具有不同程度的改善症状、肿瘤缩小、缓解疼痛、延长生命的疗效。经研究发现，金疮小草中环烯醚萜类成分具有较强的抗炎及抗肿瘤活性。其中哈巴苷(harpagide)和8-乙酰哈巴苷(8-o-acetyharpagide,简称乙酰哈巴苷)表现出很强的抗炎、抗肿瘤活性。从金疮小草中分离得到的8-乙酰哈巴苷有较明显的体外抗炎作用。

根据文献报道，初步确定筋骨草中抗炎的活性成分是以乙酰哈巴苷为代表的环烯醚萜类成分，现有技术通常采用高相液相色谱法测量筋骨草中的环烯醚萜类成分的含量，其分离效果高，选择性好，但是其分析成本较高，且对检测环境要求较高。

因此，现在急需一种提高测量筋骨草中环烯醚萜类成分含量准确性的同时降低检测成本和难度的方法。

发明内容

本申请为了克服上述缺陷，提供了筋骨草类物质中总环烯醚萜的含量测定方法及应用，其能够拓宽筋骨草类物质中总环烯醚萜的含量的检测手段，且本申请的测定方法具有步骤简单、制备成本低，且含量测定准确度高的特点。

第一方面，本申请实施例提供种筋骨草类物质中总环烯醚萜的含量测定方法，包括如下步骤：

采用乙酰哈巴苷作为对照品，将含有筋骨草类物质的溶液进行水解反应、衍生化反应和显色反应后，将所得料采用可见分光光度法进行吸光度的检测，得到骨草类物质中总环烯醚萜的含量。

在一些实施方式中，所述含量测定方法包括：

提供含有乙酰哈巴苷的对照品溶液和含有筋骨草类物质的供试品溶液，其中，所述乙酰哈巴苷在所述对照品溶液中的浓度与筋骨草类物质在所述供试品溶液中的浓度相同，且对照品溶液中的乙酰哈巴苷的质量为m

将所述对照品溶液和所述供试品溶液进行酸水解反应、衍生化反应和碱显色反应；

采用可见分光光度法，将碱显色反应后的所述对照品溶液和供试品溶液分别在400nm～700nm范围内进行检测，测定最大吸收处的吸光度值，对照品溶液的最大吸光度值为A

根据式(Ⅰ)计算得到筋骨草类物质中总环烯醚萜的质量m

m

所述式(Ⅰ)得到的总环烯醚萜的质量与所述筋骨草类物质的质量之比即为筋骨草类物质中总环烯醚萜的含量。

在一些实施方式中，所述对照品溶液和所述供试品溶液在586nm处存在最大吸收。

在一些实施方式中，所述水解反应的试剂包括盐酸。

在一些实施方式中，所述水解的温度为90℃。

在一些实施方式中，所述水解反应的时间为15min。

在一些实施方式中，在所述酸水解反应之后、碱显色反应之前还包括：对所述酸水解反应所得物进行衍生化反应。

在一些实施方式中，所述衍生化反应的试剂包括二硝基苯肼乙醇试液。

在一些实施方式中，所述衍生化反应之后还包括：将所述衍生化反应所得物进行保温。

在一些实施方式中，所述保温的温度为90℃。

在一些实施方式中，所述保温的时间为30min～45min。

在一些实施方式中，所述显色反应的试剂包括氢氧化钠。

在一些实施方式中，所述显色反应的时间为120min～300min。

在一些实施方式中，所述对照品溶液和供试品溶液中的溶剂为甲醇。

在一些实施方式中，所述筋骨草类物质包括筋骨草、筋骨草提取物和筋骨草制剂中的至少一种。

第二方面，本申请实施例提供筋骨草类物质中总环烯醚萜的含量测定方法在筋骨草质量控制或筋骨草制剂检测中的应用。

本技术方案与现有技术相比，至少具有以下技术效果：

本申请采用乙酰哈巴苷作为对照品，通过对含有筋骨草类物质的溶液进行水解反应和显色反应后，使得含有筋骨草类物质的溶液能够满足可见分光光度法检测的需求，从而得到筋骨草类物质中总环烯醚萜的含量。本申请的含量测定方法，通过简单的预处理使得筋骨草类物质可以通过可见分光光度法进行检测，其具有重复性好、准确度高、数据可靠以及可操作性强的优点。

本申请的含量测定方法能够全面地、快速地检测含有筋骨草的物质的质量，有利于其全面质量检测和整体质量控制，从而有助于提高筋骨草类药物使用的安全性和稳定性。同时，本申请建立筋骨草类物质中总环烯醚萜的含量测定方法，通过不同检测机构对同一样本检测数据对比，检测结果无明显差异，表明本申请的测定方法的重现性强，能有形成较系统全面、专属的质量标准，最后，本申请通过同一样本不同月份的检测结果大致相同，表明本申请的含量测定方法具有优异的稳定性。

应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性的，并不能限制本申请。

附图说明

图1为对照品溶液乙酰哈巴的水解、显色的可见光全波长扫描图；

图2为供试品溶液的水解、显色的可见光全波长扫描图；

图3为对照品溶液乙酰哈巴苷的紫外-可见光全波长扫描图；

图4为供试品溶液的紫外-可见光全波长扫描图；

图5为本申请筋骨草类物质进行水解反应、衍生化反应和显色反应的反应机理图；

图6为本申请乙酰哈巴苷对照品的总环烯醚萜测定标准曲线。

具体实施方式

为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明实施例进行详细描述。

应当明确，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其它含义。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

可以理解，本申请所有涉及的试剂均为分析纯或色谱纯。

本申请所有涉及的水均为高纯水。

现有技术中，由于含有筋骨草类物质的供试品在紫外-可见光区没有强的吸收，因此，常用高效液相色谱法(High Performance Liquid ChromatographyHPLC)进行检测，虽然高效液相色谱法检测的效率较高，然而，高效液相色谱法的仪器昂贵，导致成本较高。

鉴于此，本申请要解决的技术问题在于补充现有技术中的常见的液相检测方法，只有液相检测含量一种方法的缺陷，增加易操作且准确度高的可见分光光度法的方法。具体的：

筋骨草类物质中总环烯醚萜的含量测定方法，包括如下步骤：

采用乙酰哈巴苷作为对照品，将含有筋骨草类物质的溶液进行水解反应和显色反应后，将所得料采用可见分光光度法进行吸光度的检测，得到筋骨草类物质中总环烯醚萜的含量。

上述方案中，本申请采用乙酰哈巴苷作为对照品，通过对含有筋骨草类物质的溶液进行水解反应和显色反应后，使得含有筋骨草类物质的溶液能够满足可见分光光度法检测的需求，从而得到筋骨草类物质中总环烯醚萜的含量。本申请的含量测定方法，通过简单的预处理使得筋骨草类物质可以通过可见分光光度法进行检测，其具有重复性好、准确度高、数据可靠以及可操作性强的优点。

在一些实施方式中，筋骨草类物质包括筋骨草、筋骨草提取物和筋骨草制剂中的至少一种，筋骨草(学名：Ajuga ciliata Bunge)是唇形科，筋骨草属多年生草本植物，其分布于中国河北，山东，河南，山西，陕西，甘肃，四川及浙江，其生长在海拔340m～1800m的山谷溪旁，荫湿的草地上，林下湿润处及路旁草丛中。筋骨草提取物指的是双子叶植物药唇形科植物毛缘筋骨草的全草通过超声波提取法、酶提取法、微波辅助提取法、溶剂提取法和超临界流体萃取法等方法得到的固体物质。筋骨草制剂指的是含有筋骨草的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂等，上述筋骨草类物质均具有优良的抗菌、消炎作用。

具体的，下面详细介绍本申请的含量测定方法。

步骤S100、提供乙酰哈巴苷和筋骨草类物质，将乙酰哈巴苷和筋骨草类物质分别溶解在相同的溶剂中，得到含有乙酰哈巴苷的对照品溶液和含有筋骨草类物质的供试品溶液，其中，乙酰哈巴苷在对照品溶液中的浓度与筋骨草类物质在供试品溶液中的浓度相同，且对照品溶液中的乙酰哈巴苷的质量为m

在一些实施方式中，对照品溶液和供试品溶液中的溶剂均为甲醇。

在本申请中，筋骨草中含有7种环烯醚萜，包括哈巴苷(C

在本申请中，乙酰哈巴苷购买自中国中医科学院或中检院，其具体产品批号及纯度见表1。

表1.乙酰哈巴苷对照品的批号及纯度

步骤S200、将对照品溶液和供试品溶液进行酸水解反应。

在上述步骤中，筋骨草类物质中的环烯醚萜类化合物A环上的氧较活泼，经过酸水解开环形成2个不饱和醛基。

在一些实施方式中，酸水解反应的试剂包括盐酸，盐酸的浓度为1mol/L。

在一些实施方式中，酸水解的温度为50℃～90℃，具体的，酸水解的温度例如可以是50℃、60℃、70℃、80℃和90℃等，当然还可以是上述范围内的其他值，本申请在此不作限制。在上述限定范围内，有利于供试品溶液和对照品溶液的水解，提高筋骨草类物质中的总环烯醚萜含量测定的准确度。优选的，酸水解的温度为90℃。

在一些实施方式中，酸水解反应的时间为15min～45min，具体的，酸水解反应的时间具体可以是15min、20min、25min、30min、35min、40min和45min等，当然还可以是上述范围内的其他值，本申请在此不作限制。优选的，酸水解反应的时间为15min。

步骤S300、将步骤S200所得物进行衍生化反应。

在一些实施方式中，衍生化反应的试剂包括二硝基苯肼乙醇试液，在二硝基苯肼乙醇试液环境中，步骤S200得到的半缩醛基可进行衍生化反应生成2，4-二硝基苯腙。

在一些实施方式中，衍生化反应之后还包括：将衍生化反应所得物进行保温，保温温度为25℃～90℃，具体的，保温温度可以是25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、80℃和90℃等，当然还可以是上述范围内的其他值，本申请在此不作限制。优选的，保温温度为90℃。

在一些实施方式中，保温的时间为15min～45min，具体的，保温的时间可以是15min、20min、30min、35min、40min和45min等，当然还可以是上述范围内的其他值，本申请在此不作限制。优选的，保温的时间为30min。

步骤S400、将步骤S300所得物进行碱显色反应。

在本步骤中，步骤S300生成的2，4-二硝基苯腙在碱性环境下形成棕色溶液，从而使得对照品溶液和供试品溶液可以采用可见分光光度法进行含量测定。

在一些实施方式中，碱显色反应的试剂包括氢氧化钠。

在一些实施方式中，碱显色反应的时间为120min～300min，具体的，碱显色反应的时间例如可以是120min、150min、180min、200min、250min、280min和300min等，当然还可以是上述范围内的其他值，本申请在此不作限制。在上述范围内，对照品溶液和供试品溶液能够保证稳定，有利于提高可见分光光度法进行含量测定的精准性。

步骤S500、将碱显色反应后的对照品溶液和供试品溶液分别在400nm～700nm范围内进行可见分光光度法检测，测定最大吸收处的吸光度值。

由朗伯比尔定律可以得到：当一束平行单色光通过一定液层厚度的有色溶液时，由于溶质吸收了光能，光的强度就会减弱。溶液浓度越大，液层越厚，入射光越强，则光被吸收的就越多。则溶液的最大吸光度A可通过式(Ⅱ)计算：

A＝E*C*L(Ⅱ)

式(Ⅱ)中，A为最大吸光度，C为溶液浓度，L为液层厚度，E是物质在一定波长下的特征常数，与对光吸收的灵敏度呈正相关。含量测定时所用波长通常选择被测物质的最大吸收波长以避免其他物质的干扰。根据下列公式可以计算测定对照品溶液管中和供试品溶液管中的物质的含量，过程如下：

A

A

A

上式中，A

由于对照品溶液液和供试品溶液中的物质相同，故E

C

由于对照品溶液液和供试品溶液测试的体积相等，物质质量m＝C*V*M(M为相对分子质量，V为体积)，则：

m

式(Ⅰ)中，m

总环烯醚萜的质量m

在一些实施方式中，可见分光光度法测试的设备包括721紫外可见分光光度计、普析通用T6新世纪紫外可见分光光度仪和UW-2600紫外分光光度计中的任意一种。

在一些实施方式中，以筋骨草提取物为例，取筋骨草提取物样品及乙酰哈巴苷对照品甲醇溶液适量，按总环烯醚萜测定方法经酸水解、二硝基苯肼乙醇试液-氢氧化钠甲醇水溶液显色后，照分光光度法(现行版中国药典)，经过400～700nm可见光全波长扫描，对照品溶液与筋骨草提取物样品溶液最大吸收均在586nm(图1为对照品溶液乙酰哈巴的水解、显色的可见光全波长扫描图，图2为供试品溶液的水解、显色的可见光全波长扫描图)，而未经水解、显色的筋骨草提取物样品溶液及对照品溶液，在586nm附近无吸收峰，(图3为乙酰哈巴苷对照品紫外-可见光全波长扫描图，图4为供试品溶液的紫外-可见光全波长扫描图)。因此选择586nm为检测波长。

综上所述，如图5所示，本申请通过筋骨草类物质中环烯醚萜类化合物A环上的氧较活泼，经过酸水解开环形成2个不饱和醛基，该半缩醛基与2，4-二硝基苯肼反应生成2，4-二硝基苯腙，在碱性环境下形成棕色溶液，可采用可见分光光度法进行含量测定。

实施例1：筋骨草提取物中总环烯醚萜含量测定

(1)对照品溶液的制备

精密称取乙酰哈巴苷对照品适量，甲醇溶解，配制成每1ml约含0.4mg的对照品溶液。

(2)供试品溶液的制备

取筋骨草提取物约25mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇50ml，称定重量，进行甲醇提纯10min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

(3)供试品溶液中总环烯醚萜含量测定

精密量取对照品溶液、供试品溶液及甲醇各0.4ml，置10ml量瓶中，加1mol/L盐酸溶液3ml，置90℃水浴中保温15min，放冷，加二硝基苯肼乙醇试液0.5ml，置90℃水浴保温30min，放冷，加1mol/L氢氧化钠甲醇水溶液(4g氢氧化钠，20ml水，80ml甲醇)4ml，加甲醇稀释至刻度，摇匀，常温放置2.0h后，照紫外-可见分光光度法(现行版中国药典)，以上述甲醇反应液为空白，在586nm处测定吸光度，计算，即得。

本品按干燥品计算，筋骨草提取物中总环烯醚萜的含量以乙酰哈巴苷(C

在一些实施方式中，溶解筋骨草提取物的溶剂为甲醇，相比于采用水或50％甲醇作为溶剂，本申请的甲醇溶剂的提取率高，具体的，取筋骨草提取物(两份样品，分别为编号1，编号2)0.025g，各3份，精密称定，分别精密量取水、50％甲醇、甲醇各50mL，称定重量，超声处理20min，按照步骤(2)和步骤(3)依次制成供试品溶液并进行吸光度测试，计算，筋骨草提取物中总环烯醚萜含量测试结果见表2。

表2.不同提取溶剂对于总环烯醚萜含量的影响

在一些实施方式中，本申请采用超声处理的方式提取筋骨草提取物中的环烯醚萜成分，超声处理的功率为250W，频率40KHz，相较于加热回流和冷浸提取方式，本申请的超声处理具有提取效率高、提取含量高的优点。具体的，取筋骨草提取物(编号1)0.025g，共3份，精密称定，分别精密加入甲醇50mL，称定重量，将三份样本依次进行超声处理20min、加热回流20min和冷浸20min，按照步骤(2)和步骤(3)依次制成供试品溶液并进行吸光度测试，计算，筋骨草提取物中总环烯醚萜含量测试结果见表3。

表3.不同提取方法对于总环烯醚萜含量的影响

在一些实施方式中，本申请采用超声处理的时间为10min，在上述超声处理时间内，能够保证筋骨草提取物提取完全，若超声处理的时间大于10min，无法进一步提高筋骨草提取物中的环烯醚萜成分的含量，且浪费时间。具体的，取筋骨草提取物(编号1)0.025g，共3份，精密称定，分别精密加入甲醇50mL，称定重量，超声处理10、20、30min，按上述方法制成供试品溶液，见表4。

表4.不同提取时间对于总环烯醚萜含量的影响

在一些实施方式中，本申请的供试品溶液加盐酸后的水浴温度为90℃，若水浴温度低于90℃，则导致供试品溶液水解不完全，影响供试品溶液中总环烯醚萜含量测定的精准性。具体的，分别精密量取对照品溶液、供试品溶液及甲醇溶液各0.4mL，置10mL量瓶中，加入1mol/L盐酸3mL，分别置50℃，70℃，90℃水浴中水解15min，加入二硝基苯肼乙醇试液0.5mL，90℃水浴30min，取出放冷，加入1mol/L氢氧化钠甲醇水溶液(4g氢氧化钠，20mL水，80mL甲醇)4mL，甲醇定容至刻度，摇匀，常温放置3h后，照分光光度法(中现行版中国药典)，于586nm处测定吸光度，测试结果见表5。

表5.不同的水解温度对于总环烯醚萜含量的影响

在一些实施方式中，本申请的供试品溶液加盐酸后的水浴的时间为15min，若水浴时间高于15min，则供试品溶液中总环烯醚萜含量增加不明显，影响含量测定的效率。具体的，根据水浴温度测定结果，其他条件不变，选择90℃水浴水解，于586nm处分别考察对照品溶液与供试品溶液水解15、30、45min的吸光度，测试结果见表6。

表6.不同水解时间对于总环烯醚萜含量的影响

在一些实施方式中，本申请中对照品溶液和供试品溶液中加入盐酸的量为3mL，若加入盐酸的量低于3mL，则导致水解不完全；若加入盐酸的量高于4mL，则造成部分盐酸没有起到水解作用。具体的，根据水浴温度和水浴时间测定结果，其他条件不变，对照品溶液与供试品溶液分别加入1mol/L盐酸1mL、2mL、3mL和4mL，在90℃水解15min，于586nm处测定吸光度，测试结果见表7。

表7.不同的加酸量对于筋骨草提取物最大吸光度的影响

在一些实施方式中，本申请中对照品溶液和供试品溶液中加入二硝基苯肼乙醇试液的量为0.5mL～1mL，若加入二硝基苯肼乙醇试液的量低于0.5mL，则导致显色不完全，影响筋骨草提取物中环烯醚萜成分的含量的测定。具体的，其他条件不变，对照品溶液与供试品分别加入二硝基苯肼乙醇试液0.2mL、0.5mL和1mL，考察586nm处的吸光度，测试结果见表8。

表8.不同二硝基苯肼乙醇试液用量对于筋骨草提取物最大吸收度的影响

在一些实施方式中，本申请中对照品溶液和供试品溶液中加入二硝基苯肼乙醇试液后进行保温，保温的温度为90℃，保温的时间为30min～45min，若保温时间太短或保温温度太低，则不利于供试品溶液的稳定，导致测试筋骨草提取物中环烯醚萜成分的含量值较低，具体的，控制其他条件不变，对照品溶液与供试品溶液加入0.5mL显色剂后，分别考察条件Ⅰ直接加入1mol/L氢氧化钠甲醇水溶液4mL；Ⅱ常温放置30min后加入1mol/L氢氧化钠甲醇水溶液4mL；Ⅲ90℃水浴30min后加入1mol/L氢氧化钠甲醇水溶液4mL。于586nm处测定吸光度，测试结果见表9。

表9.不同的保温条件对于筋骨草提取物最大吸收度的影响

控制其他条件不变，对照品溶液与供试品溶液加入0.5mL显色剂后，其他条件不变，分别考察90℃水浴15min、30min、45min的含量。于586nm处测定吸光度，测试结果见表10。

表10.不同的显色时间对于筋骨草提取物最大吸收度的影响

根据表9和表10数据可知：结果表明，对照品溶液与供试品溶液在90℃水浴并保温30min～45min，能够获得较高的最大吸光度值，测出的总环烯醚萜含量较高。

在一些实施方式中，本申请中对照品溶液和供试品溶液中加入氢氧化钠的体积为4mL，浓度为mol/L，若氢氧化钠的添加量太少，则导致部分筋骨草提取物中环烯醚萜成分未显色，导致测试筋骨草提取物中环烯醚萜成分的含量值较低，具体的，控制其他条件不变，考察不同加碱量对对照品溶液和供试品溶液吸光度的影响。于586nm处测定吸光度，测试结果见表11。

表11.不同的氢氧化钠用量对于筋骨草提取物最大吸收度的影响

在一些实施方式中，本申请中对照品溶液和供试品溶液中加入氢氧化钠后放置时间为120min～300min，在上述放置时间内，对照品及供试品的RSD值(吸光度值的相对平均偏差)均为1％，表明样品溶液基本稳定，可在此期间内进行测量。若加入氢氧化钠放置时间小于120min，样品溶液不稳定，不利于筋骨草提取物中环烯醚萜成分的测量。具体的，控制其他条件不变，样品加入4mL氢氧化钠甲醇水溶液后分别于0min、15min、30min、60min、75min、90min、120min、150min、180min、210min、240min、270min和300min测量吸光度，测试结果见表12。

表12.氢氧化钠显色后溶液稳定性考察

(4)阴性干扰试验

筋骨草提取物中除环烯醚萜类成分外，还含有黄酮、糖及甾酮类成分，分别以筋骨草提取物中的总黄酮部分、葡萄糖对照品及20-羟基蜕皮甾酮对照品为阴性对照，按总环烯醚萜测定方法测定吸光度，吸光度分别为0.038(相当于10倍样品浓度)、0.000及0.009，对总环烯醚萜测定基本无干扰；且用HPLC测定的3个环烯醚萜成分之和与比色法测定的总环烯醚萜质量分数的比值(平均值)已达到了92％以上，进一步说明非环烯醚萜成分对测定无干扰。

(5)线性关系考察

取干燥至恒重的乙酰哈巴苷对照品，加甲醇配制成0.406mg/mL乙酰哈巴苷对照品溶液，分别精密吸取0.04mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL以及甲醇溶液0.4mL，分别置10mL量瓶中，加1mol/L盐酸溶液3mL，置90℃水浴中15min，取出，放冷，加入二硝基苯肼乙醇试液0.5mL，90℃水浴30min，放冷，加入1moL/L氢氧化钠甲醇水溶液(4g氢氧化钠、20mL水和80mL甲醇)4mL，甲醇定容至刻度，摇匀，常温放置2.0h后，照分光光度法(现行版中国药典)，以上述甲醇反应液为空白，在586nm处测定吸光度，以取样量(mg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表13和图6。

表13.总环烯醚萜线性关系考察(以乙酰哈巴苷计)

根据表13数据可知：乙酰哈巴苷在0.0162mg～0.3248mg线性关系良好，A＝3.7102C+0.0353，r＝0.9997。

(6)精密度试验

精密称取筋骨草提取物供试品溶液0.4mL，按步骤(3)中测定方法测定586nm处的吸光度，重复测定6次，结果见表14。

表14.精密度试验

根据表14数据可知：6次最大吸光度的相对标准偏差RSD＝0.15％，说明本申请的含量测定方法精密度良好。

(7)稳定性试验

精密称取筋骨草提取物供试品溶液0.4mL，按(3)中测定方法测定586nm处的吸光度，放置不同时间分别测定，结果见表15。

表15.稳定性试验

根据表15数据可知：本申请的筋骨草供试品溶液在4h内稳定(RSD＝0.51％)。

(8)重复性试验

取筋骨草提取物6份，按步骤(2)所述方法制成供试品溶液，再按照(3)中方法进行测定筋骨草提取物中的总环烯醚萜的含量，结果见表16。

表16.重复性试验

根据表16数据可知，六次实验筋骨草提取物中的总环烯醚萜的平均含量为62.87％,RSD＝0.74％，表明本申请筋骨草提取物中总环烯醚萜的含量测定方法重复性良好。

(9)回收率试验

采用加样回收法，精密称取已知含量同一批样品(例如含总环烯醚萜62.87％的筋骨草提取物)0.0125g，共9份，1-3#分别精密加乙酰哈巴苷对照品约6.2mg，4-6#分别精密加乙酰哈巴苷对照品约7.8mg，7-9#分别精密加乙酰哈巴苷对照品约9.4mg，按步骤(2)中供试品溶液的制备方法制备以及步骤(3)中总环烯醚萜的含量测定方法进行测定，结果如表17所示，并按照下式(Ⅶ)计算回收率：

表17.总环烯醚萜回收率测定试验

根据表17数据可知：九组样本的平均回收率为98.8％，相对标准偏差为1.9％，表明本申请筋骨草提取物中总环烯醚萜的含量测定方法是可靠的。

(10)筋骨草提取物稳定性质量研究

随机采用两批筋骨草提取物(编号1和编号2)进行不同月份的放置后再按照步骤(2)和步骤(3)的方法对筋骨草提取物中总环烯醚萜的含量进行测定，测定结果见表18。

表18.筋骨草提取物稳定性质量研究

根据表18数据可知：本申请的两批样品在放置0、3、6、9、12、18、26和36月后进行总环烯醚萜的含量测定，其结果基本无差别。

(11)筋骨草提取物不同检测机构同一样本质量研究

随机采用三批筋骨草提取物样本通过不同的检测结构进行测定，其均是按照步骤(2)和步骤(3)的方法对筋骨草提取物中总环烯醚萜的含量进行测定，测定结果见表19。

表19.筋骨草提取物不同检测机构同一样本质量研究

根据表19数据可知：不同检测结构测的总环烯醚萜结果一致，表明本申请的筋骨草提取物中总环烯醚萜的紫外检测方法准确度高，可重复性强，可操作性强。

实施例2：筋骨草片中总环烯醚萜含量测定

(1)对照品溶液的制备

精密称取乙酰哈巴苷对照品适量，甲醇溶解，配制成每1ml约含0.4mg的对照品溶液。

(2)供试品溶液的制备

取筋骨草片20片，除去包衣，研细，取约50mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40KHz)10min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

(3)供试品溶液中总环烯醚萜含量测定

精密量取对照品溶液、供试品溶液及甲醇各0.4ml，置10ml量瓶中，加1mol/L盐酸溶液3ml，置90℃水浴中保温15min，放冷，加二硝基苯肼乙醇试液0.5ml，置90℃水浴保温30min，放冷，加1mol/L氢氧化钠甲醇水溶液(4g氢氧化钠，20ml水，80ml甲醇)4ml，加甲醇稀释至刻度，摇匀，常温放置2.0h后，照紫外-可见分光光度法(现行版中国药典)，以上述甲醇反应液为空白，在586nm处测定吸光度，计算，即得。

本品每片含总环烯醚萜范围以乙酰哈巴苷(C

在一些实施方式中，本申请采用超声处理的方式提取筋骨草片中的环烯醚萜成分，相较于加热回流和冷浸提取方式，本申请的超声处理具有提取效率高、提取含量高的优点。具体的，取筋骨草片的粉末0.05g，共3份，精密称定，分别精密加入50mL甲醇，称定重量，将三分样板依次进行超声处理20min、加热回流20min和冷浸40min，按照步骤(2)和步骤(3)依次制成供试品溶液并进行吸光度测试，计算，筋骨草片中总环烯醚萜含量测试结果见表20。

表20.不同提取溶剂用量对于总环烯醚萜含量的影响

在一些实施方式中，溶解筋骨草提取物的溶剂为甲醇，相比于采用水或50％甲醇作为溶剂，本申请的甲醇溶剂的提取率高，具体的，取筋骨草片粉末三份0.05g，各3份，精密称定，分别精密量取水、50％甲醇、甲醇各50mL，称定重量，按照步骤(2)和步骤(3)依次制成供试品溶液并进行吸光度测试，计算，筋骨草片中总环烯醚萜含量测试结果见表21。

表21.不同提取时间对于总环烯醚萜含量的影响

(4)空白试验

将去离子水制成空白制剂，再按照步骤(2)和步骤(3)制备供试品溶液并进行最大吸光度测定，结果空白溶液在586nm处无吸收，故认为无干扰。

(5)精密度试验

精密称取筋骨草片供试品溶液0.4mL，按步骤(3)中测定方法测定586nm处的吸光度，重复测定6次，测试结果见表22。

表22.精密度试验

根据表22内容可知：重复测定6次的最大吸光度均为130.546，说明本申请的含量测定方法精密度良好。

(6)稳定性试验

取同一批样品按步骤(2)制成供试品溶液，按照步骤(3)的分光光度法取样品溶液分别在0～4h内每间隔0.5h～1h测量一次586nm处的吸光度，测试结果见表23。

表23.稳定性试验

根据表23结果可知：供试品溶液在4h内稳定(RSD＝0.82％)。

(7)重复性试验

取筋骨草片粉末6份，按步骤(2)所述方法制成供试品溶液，再按照(3)中方法进行测定筋骨草提取物中的总环烯醚萜的含量，结果见表24。

表24.重复性试验

根据表24数据可知：筋骨草片中的总环烯醚萜的平均含量31.58mg/片，相对标准偏差为1.91％，说明本申请的含量测定方法重现性良好。

(8)回收率试验

采用加样回收法，精密称取已知含量同一批样品(含总环烯醚萜31.58mg/片)0.025g，共9份，1-3K分别精密加乙酰哈巴苷对照品约6.5mg，4-6#分别精密加乙酰哈巴苷对照品约7.8mg，7-9#分别精密加乙酰哈巴苷对照品约9.4mg，按步骤(2)中供试品溶液的制备方法制备以及步骤(3)中总环烯醚萜的含量测定方法进行测定，结果如表25所示，并按照下式(Ⅶ)计算回收率：

表25.总环烯醚萜回收率测定结果

根据表25数据可知：筋骨草片的总环烯醚萜的平均回收率为100.98％，相对标准偏差为1.33％，说明本申请的含量测定方法是可靠的。

(9)筋骨草片多批样本研究

随机采用八批筋骨草提取物按照步骤(2)和步骤(3)的方法对筋骨草提取中总环烯醚萜的含量进行测定，测定结果见表26。

表26.筋骨草片多批次样本研究

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根据表26数据可知：不同批次的筋骨草片中的总环烯醚萜的含量的测定结果差异不大，表明本申请的含量测定方法是可靠的。

(10)筋骨草片稳定性研究

随机采用两批筋骨草片(编号1和编号2)进行不同月份的放置后再按照步骤(2)和步骤(3)的方法对筋骨草片中总环烯醚萜的含量进行测定，测定结果见表27。

表27.筋骨草片多批次样本研究

根据表27数据可知：本申请的两批样品在放置0、3、6、9、12、18、26和36月后进行总环烯醚萜的含量测定，其结果基本无差别。

(11)筋骨草片不同检测机构同一样本质量研究

随机采用三批筋骨草片样本通过不同的检测结构进行测定，其均是按照步骤(2)和步骤(3)的方法对筋骨草片中总环烯醚萜的含量进行测定，测定结果见表28。

表28.筋骨草片不同检测机构同一样本样本研究

根据表28数据可知：不同检测结构测的总环烯醚萜结果一致，表明本申请的筋骨草片中总环烯醚萜的紫外检测方法准确度高，可重复性强，可操作性强。

其他剂型的筋骨草类物质采用类似的方法进行总环烯醚萜含量的测定，结果基本一致。

实施例3：环烯醚萜含量测定(药材)

对照品溶液的制备

精密称取乙酰哈巴苷对照品适量，甲醇溶解，配制成每1ml约含0.4mg的对照品溶液。

(1)供试品溶液的制备

取本品粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇50ml，称定重量，进行甲醇提纯30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

(3)供试品溶液中总环烯醚萜含量测定

精密量取对照品溶液、供试品溶液及甲醇各0.4ml，置10ml量瓶中，加1mol/L盐酸溶液3ml，置90℃水浴中保温15min，放冷，加二硝基苯肼乙醇试液0.5ml，置90℃水浴保温30min，放冷，加1moL/L氢氧化钠甲醇水溶液(4g氢氧化钠，20ml水，80ml甲醇)4ml，加甲醇稀释至刻度，摇匀，常温放置2.0h后，照紫外-可见分光光度法(现行版中国药典)，以上述甲醇样品反应液为空白，在586nm处测定吸光度，计算，即得。

本品按干燥品计算，含总环烯醚萜范围以乙酰哈巴苷(C

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。