一种肿瘤免疫治疗预测生物标志物及其应用

技术领域

本发明涉及一种肿瘤免疫治疗预测生物标志物及其应用，属于肿瘤免疫治疗疗效预测技术领域。

背景技术

程序性细胞死亡1(PD-1)/程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的免疫检查点抑制剂(ICIs)在多种癌症类型中导致显著和持续的肿瘤消退。尽管取得了令人印象深刻的成就，但只有一小部分患者受益于PD-1/PD-L1的ICIs。

目前有几种生物标志物可以来评估ICIs的疗效，如肿瘤微环境(TME)中T细胞浸润和PD-L1表达水平以及其他共抑制受体或抑制分子的表达。由于PD-L1表达和反应之间的弱相关性，导致生物标志物的预测价值不大。此外，最近在TME进行的评估抗PD-1和其他共抑制途径组合的试验结果不太令人满意。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种肿瘤免疫治疗预测生物标志物及其应用，能够通过分析患者肿瘤免疫治疗前后的血清中IL14α的表达变化水平，预测肿瘤免疫治疗疗效。

为达到上述目的，本发明是采用下述技术方案实现的：

一方面，本发明提供一种肿瘤免疫治疗预测生物标志物，所述预测生物标志物为白细胞介素14α(IL14α)。

进一步地，所述肿瘤免疫治疗包括黑色素瘤、肺癌、妇科癌症、肺癌、消化道肿瘤、乳腺癌和淋巴瘤。

进一步地，所述肿瘤免疫治疗包括靶向程序性细胞死亡阻断治疗。

第二方面，本发明提供一种肿瘤免疫治疗预测生物标志物的应用，包括通过分析患者在肿瘤免疫治疗前和肿瘤免疫治疗后的血清中IL14α的表达变化水平，预测肿瘤免疫治疗疗效。

进一步地，所述肿瘤免疫治疗后包括2个周期治疗后。

进一步地，所述血清中IL14α的表达变化水平包括下式：

δIL14α％＝(肿瘤免疫治疗后患者的血清中IL14α的表达水平-肿瘤免疫治疗前患者的血清中IL14α的表达水平)/肿瘤免疫治疗前患者的血清中IL14α的表达水平*100％

式中，δIL14α为血清中IL14α的表达变化水平。

进一步地，血清中IL14α的表达水平的检测方法包括Western blot方法或ELISA方法或SDS PAGE方法。

进一步地，所述血清中IL14α的表达变化水平大于等于2.46％时，预测结果为肿瘤免疫治疗有效。

进一步地，所述血清中IL14α的表达变化水平越高，预测结果为肿瘤免疫治疗疗效越好。

进一步地，所述血清中IL14α的表达变化水平大于等于2.46％时，预测患者的无进展生存期概率减小。

与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：

本发明的肿瘤免疫治疗预测生物标志物，能够方便、容易地获得检测样本，经济、有效地获得检测结果，既能够缩短检测成本，还能提高检测效率和准确度，减少患者痛苦及经济费用，缩短预测疗效的周期；此外，本发明的肿瘤免疫治疗预测生物标志物能够重复检测，方便复检，能够提高检测结果的准确性；本发明根据肿瘤免疫治疗前后的IL14α的表达变化水平预测肿瘤免疫治疗疗效，能够为肿瘤免疫治疗结果的诊断提供数据支持。

附图说明

图1所示为本发明A、B、C、D组的无进展生存期和总生存期比较的折线图；

图2所示为本发明IL14α的表达变化水平的ROC曲线；

图3所示为本发明为癌症患者血清中IL14α的表达变化水平与接受PD-1抑制治疗的总体反应关系的柱状图；

图4所示为本发明E、F组的无进展生存期和总生存期比较的折线图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

白细胞介素14α(IL14α)是一种B细胞生长因子，最初被称为高分子量B细胞生长因子，最近也被称为taxilin。Ambrus等人首先从Burkitt淋巴瘤患者的体腔积液中发现，B细胞在抗肿瘤免疫反应中具有多种功能，肿瘤浸润性B淋巴细胞(TIBs)和肿瘤三级淋巴结构(TLS)在抗肿瘤治疗中发挥重要作用。B细胞的活化及其抗肿瘤免疫反应受肿瘤免疫微环境的影响。在免疫检查点治疗(ICIs)中，B细胞被T滤泡辅助细胞激活，随后促进T细胞并产生抗体，这成为免疫治疗反应的关键。ICIs改变了B细胞和T细胞的活性。因此，本发明通过IL14α水平监测B细胞活性以预测ICIs治疗疗效。

实施例1

本实施例提供一种肿瘤免疫治疗预测生物标志物。

本实施例的预测生物标志物为白细胞介素14α(IL14α)。

其中，肿瘤免疫治疗包括程序性细胞死亡1(PD-1)/程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的免疫检查点抑制剂(ICIs)。

应用中，IL14α能够用于黑色素瘤、肺癌、妇科癌症、肺癌、消化道肿瘤、乳腺癌以及淋巴瘤的肿瘤免疫治疗过程中的预测生物标志物。

实际应用时，白细胞介素14α能够通过酶联免疫吸附剂测定(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)，或者蛋白质印迹法(Western blot)，或者变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)检测。

实施例2

本实施例介绍了一种检测白细胞介素14α的Western blot方法。

本实施例的Western blot检测，包括以下步骤：

S1-1稀释血清标本,取1ul血清标本加入99ul 1×PBS，混匀后取4ul稀释后的血清加入20ul1×PBS和6ul 5×Loading buffer混匀,在100℃恒温水浴锅中煮8min。

S1-2清洗、烘烤玻璃板，用SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(购于武汉谷歌生物技术有限公司)配制并灌注10％分离胶和5％浓缩胶。

S1-3灌注分离胶后，在上方以去ddH2O封胶，等待20～30min至分离胶聚合，倒除上方ddH2O，灌注浓缩胶并立即插入清洗干净的梳子，等待约30min至凝胶聚合完全。

S1-4配制电泳缓冲液，将聚合完全的胶板置入电泳槽，加入电泳缓冲液至快浸没胶板，胶板间电泳液高于胶板外侧，小心拔去梳子；加样：用加样针吸取3-5ul proteinmarker加入左右两侧胶孔，用1×Loading buffer(5×Loading buffer加四倍体积1×PBS配制)配平至15ul，中间各孔按照实验设计分别加入待测样本15ul。

S1-5电泳：连接电源，先以恒压60V电泳约30min至溴酚蓝进入分离胶，将电压调至120V，继续电泳至溴酚蓝到达分离胶最下缘。

S1-6配制电转缓冲液并置于4℃冰箱备用，准备合理大小的0.45um PVDF膜，用少量甲醇浸泡10S以激活膜，将电转缓冲液倒入盘中，转膜器浸润其中，取出凝胶，修整胶体并去除浓缩胶，制作三明治结构，除去各层间气泡，将凝胶与PVDF膜放入转膜器，置于冰盒中进行电转移，恒流350mA，120min。

S1-7转膜结束后将PVDF置于TBST中清洗3min。

S1-8封闭液封闭，配制5％BSA/5％脱脂牛奶，将膜正面向上放在其中，置于摇床上进行封闭2小时。

S1-9封闭结束后于TBST中洗膜3次，每次10min；一抗孵育过夜：剪膜后将目的条带置于1:2000/1:4000稀释的IL14a抗体中(5ulIL14a抗体原液加入5ml1×TBST混匀)，置于4℃冰箱孵育过夜。

S1-20第二天从冰箱中取出条带，用1×TBST洗涤液洗膜3次(置于摇床上)，每次洗膜时间为10min。

S1-21用5％脱脂牛奶1：5000稀释HRP-山羊抗鼠IgG抗体至工作浓度，室温摇床上孵育抗体2h，结束后用TBST清洗3次，每次10min。

S1-22显影：配制显影剂，调整拍摄时间，凝胶显像系统拍照并保存结果。

实施例3

在实施例1的基础上，本实施例介绍了一种肿瘤免疫治疗预测生物标志物的应用。

包括通过分析患者在肿瘤免疫治疗前和肿瘤免疫治疗后的血清中IL14α的表达变化水平，预测肿瘤免疫治疗疗效。

其中，肿瘤免疫治疗后包括2个周期治疗后，即为肿瘤免疫治疗早期。

应用时，血清中IL14α的表达变化水平包括下式：

δIL14α％＝(肿瘤免疫治疗后患者的血清中IL14α的表达水平-肿瘤免疫治疗前患者的血清中IL14α的表达水平)/肿瘤免疫治疗前患者的血清中IL14α的表达水平*100％

式中，δIL14α为血清中IL14α的表达变化水平，血清中IL14α的表达水平通过Western blot方法或ELISA方法或SDS PAGE方法检测。

实际应用时，血清中IL14α的表达变化水平大于等于2.46％时，预测结果为肿瘤免疫治疗有效，预测患者的无进展生存期概率明显减小；并且，血清中IL14α的表达变化水平越高，预测结果为肿瘤免疫治疗疗效越好。

实施例4

在实施例1或3的基础上，本实施例详细介绍了IL14α在预测肿瘤免疫治疗疗效时的应用。

S21收集样本

通过相关组织批准，抽取30例接受了PD-1抑制剂治疗的癌症患者的病例，并对其进行分析，详见表1。

结合表1可知，接受PD-1抑制剂治疗的30例癌症患者中最小患者年龄为27岁，最大患者年龄为80岁，患者的中位年龄为59.5岁。其中，6例癌症患者接受放疗，剩余的24例癌症患者未接受放疗。此外，30例癌症患者中包括12例肺癌患者(40％)，7例消化道肿瘤患者(23.3％)，4例乳腺癌患者(13.3％)，3例淋巴瘤患者(10％)，1例妇科肿瘤患者(3.3％)，1例肉瘤患者(3.3％)和1例肾癌患者(3.3％)。

表1.30例患者的临床特征

S22获取30例癌症患者在肿瘤免疫治疗前和肿瘤免疫治疗两周期后的血清中IL14α的表达水平，并计算患者在肿瘤免疫治疗前和肿瘤免疫治疗两周期后的血清中IL14α的表达变化水平。

S23数据分析

本实施例使用Prism(8.0版，GraphPad软件)对步骤S22的数据以及S21的病例中癌症患者的临床特征参数进行统计分析，数据以平均±标准差(SD)表示,此外,为了比较两组间的差异，采用双尾t检验。

应用时，使用Kaplan Meier法计算无进展生存期(Progression-Free-Survival，PFS)和总生存期(Overall survival,OS)的受试者工作特征曲线(receiver operatingcharacteristic curve，ROC)，以寻找作为预测生物学标志物IL14α，在具有显著差异时的表达水平和表达变化水平。

聚类分析时，采用log-rank检验，双侧检验以p<0.05被认为具有统计学意义。使用IBM SPSS Statistics 27进行统计学分析，Graphpad Prism 8.0绘制统计相关图形。

S24结果

4.1患者的特征

接受PD-1抑制剂治疗的30例癌症患者的临床结局如下：

根据对PD-1治疗的反应：56.7％的癌症患者应答，43.3％的癌症患者无应答。实际应用时，所有患者中有8例癌症患者(26.6％)死亡。

PD-1治疗疗效为：在30例癌症患者中，30％的癌症患者部分缓解(PR)，26.7％的癌症患者病情稳定(SD)，43.3％的癌症患者疾病进展(PD)。

4.2IL14α表达水平与PD-1治疗的临床结果之间的相关性分析

在这30例癌症患者中，治疗前，癌症患者的血清中IL14α的表达水平平均值为2.1±1.21；治疗2周期后，癌症患者的血清中IL14α的表达水平平均值为1.99±0.82。

现根据接受PD-1抑制治疗前、后癌症患者血清中的IL14α的表达水平，将癌症患者分为A、B、C、D组，并对A、B、C、D组的IL14α的表达水平进行分析详见表2。

表2:IL14α表达水平和临床特征的相关性。

应用中，根据接受PD-1抑制治疗前癌症患者血清中的IL14α的表达水平，将癌症患者分为低表达组(A组)和高表达组(B组)，结合表2和图1可知，不考虑癌症患者的年龄、性别、疾病类型、放疗和应答的差异，高表达组和低表达组的癌症患者的无进展生存期(Progression-Free-Survival，PFS)和总生存期(Overall survival,OS)的差异均无显著性意义。

根据接受PD-1抑制治疗2周期后癌症患者血清中的IL14α的表达水平，将癌症患者分为低表达组(C组)和高表达组(D组)，结合表2和图1可知，不考虑癌症患者的年龄、性别、疾病类型、放疗和应答的差异，低表达组和高表达组的癌症患者的PFS差异无显著性意义(P＝0.891)，但低表达组的癌症患者的OS比高表达组好(P＝0.0323)。

实际应用时，A组和B组划分的IL14α的表达水平截断值根据IL14α的表达水平的ROC曲线确定，C组和D组划分的IL14α的表达水平截断值也根据IL14α的表达水平的ROC曲线确定。

综上可知，单独考虑治疗前，或单独考虑治疗后的参数，无法明显地预测治疗疗效。

4.3IL14α的表达变化水平与PD-1治疗后临床结局的相关性

现根据接受PD-1抑制治疗前、后癌症患者血清中的IL14α的表达变化水平，将癌症患者分为E、F组，并对E、F组的IL14α的表达变化水平进行分析详见表3。

高表达变化组(F组)和低表达变化组(E组)

表3:IL14α变化水平和临床特征相关性

参考图2，根据IL14α的表达变化水平的ROC曲线得出癌症患者治疗前后血清中IL14α的表达变化水平的截断值为2.46％(敏感性85.71％，特异性62.5％，AUC＝0.7277，P＝0.034)。应用时，经过Kaplan-Meier分析验证，获得的IL14α的表达变化水平的截断值与ROC曲线分析结果一致。

结合表3和图4可知，IL14α的表达变化水平越大，癌症患者的PFS差异具有显著性(P＝0.0039)，但是癌症患者的OS差异无显著性(P＝0.499)。此外，参考图3，IL14α的表达变化水平与PD-1抗肿瘤治疗的总体反应(Overall response rate，ORR)显著相关，应用中，在两个治疗周期后，F组患者的ORR得到改善。

实际应用时，总体反应(ORR)＝完全缓解(Complete response，CR)+部分缓解(Partial response，PR)，总体反应在IL14α表达水平变化更大。

综上实施例可知，本发明的肿瘤免疫治疗预测生物标志物，能够方便、容易地获得检测样本，经济、有效地获得检测结果，既能够缩短检测成本，还能提高检测效率和准确度，减少患者痛苦及经济费用，缩短预测疗效的周期；此外，本发明的肿瘤免疫治疗预测生物标志物能够重复检测，方便复检，能够提高检测结果的准确性；本发明根据肿瘤免疫治疗前后的IL14α的表达变化水平预测肿瘤免疫治疗疗效，能够为肿瘤免疫治疗结果的诊断提供数据支持。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。