一种RS1点突变小鼠模型的制备方法及其用途

技术领域

本文涉及RS1点突变小鼠模型的制备方法，尤其是导致出现视网膜劈裂症的小鼠模型的制备方法。本文还涉及该小鼠模型在研究视网膜劈裂症方面的应用。

背景技术

先天性视网膜劈裂症(congenital retinoschisis，RS)又称X染色体连锁视网膜劈裂症(X-linked retinoschisis,XLRS)，是一种临床常见的玻璃体视网膜变性疾病。最早由德国医生Hass J于1898年描述兄弟两人黄斑区放射状囊样改变，1913年报道为X染色体连锁，1935年Jager GM首次使用X-linked retinoschisis这个病名。劈裂病变主要累及双侧视网膜，造成视网膜神经纤维层和视网膜神经节细胞层之间劈裂[1]。文献报道该病在男性中的患病率为1:5000～1:25000，我国目前尚无确切患病率，初步估计我国至少有10万人患病，且每年均会有新增病例。XLRS典型的临床表现包括视力明显下降，眼底可见黄斑区辐状皱襞，OCT显示视网膜内层劈裂，以及ERG表现为负波形(b波振幅严重下降，a波振幅轻度下降)，视锥反应各波明显降低。

由于该病属于遗传性疾病，目前没有很好的治疗办法，基因治疗是可以从根本上治愈该疾病的方法，而进行临床前研究需要制作或选择恰当的动物模型。目前文献中报道的RS动物模型有限。2002年Weber BH等人通过基因重组的方法，将小鼠Rs1h基因部分3号外显子和4号外显子序列及全部3号内含子序列敲除，建立了第一个模拟RS的小鼠模型[2]。2004年Zeng Y等人也通过基因重组的方法，建立了1号外显子和1号内含子部分序列敲除的RS小鼠模型[3]。第三个44TNJ小鼠模型是2005年Jablonski MM等人利用诱导突变的方法，将由N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)诱变后的小鼠进行筛选后而获得的，此模型小鼠Rs1h基因2号内含子的第二个碱基存在T>C改变[4]。上述三个小鼠模型均可模拟人RS的表型，但这三个模型中的突变均未在人类RS患者中出现过。而Chen D等人在2017年通过TALENS基因编辑技术建立了一个小鼠模型，该模型携带患者特异性的无义突变：c.195T>G(p.Y65X)，这种具有患者特异性突变的敲入小鼠在精准机制研究和基因治疗探索领域具有重要的价值[5]。

发明内容

在一方面，本文提供了制备视网膜劈裂症动物的方法，包括遗传修饰来自非人类动物的细胞，使其RS1基因编码的RS1蛋白相对于野生型RS1蛋白包括氨基酸替换R213W。

在一些实施方案中，所述细胞为受精卵或胚胎干细胞。

在一些实施方案中，所述方法还包括将经遗传修饰的所述细胞培养为成体非人动物。

在一些实施方案中，所述成体非人动物为雄性。

在一些实施方案中，所述成体非人动物为雌性，优选对所述RS1基因为纯合子。

在一些实施方案中，所述非人动物为小鼠，优选C57BL/6J小鼠。

在一些实施方案中，所述遗传修饰通过向所述细胞中引入CRISPR基因编辑系统进行。

在一些实施方案中，所述CRISPR基因编辑系统包括靶序列为SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的sgRNA。

在一些实施方案中，所述CRISPR基因编辑系统还包括供体模板；优选地，所述供体模板包括SEQ ID NO：3所示序列。

在一些实施方案中，所述成体非人动物的RS1基因包括SEQ ID NO：9所示序列。

在一些实施方案中，所述成体非人动物具有视网膜劈裂表型。

在一些实施方案中，所述视网膜劈裂表型包括在视网膜层出现囊腔和/或视网膜电流图异常。

另一方面，本文提供了通过上述方法制备的视网膜劈裂症动物。

另一方面，本文提供了上述视网膜劈裂症动物在视网膜劈裂症研究中的应用。

另一方面，本文提供了鉴定用于治疗受试者中视网膜劈裂症的治疗剂的方法，包括：

1)以有效量的所述治疗剂向上述视网膜劈裂症动物给药；

2)确定所述视网膜劈裂症动物中是否存在与视网膜劈裂症相关的至少一个症状的改善；以及

3)当存在所述至少一个症状的改善时，将所述治疗剂确定为用于视网膜劈裂症的治疗剂。

在一些实施方案中，所述受试者为人。

在一些实施方案中，所述受试者的RS1基因存在突变，所述突变导致所述RS1基因编码的RS1蛋白相对于野生型RS1蛋白包括氨基酸替换R213W。

另一方面，本文提供了靶序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的sgRNA。

另一方面，本文提供了用于在非人动物中产生RS1蛋白突变体的CRISPR基因编辑系统，包括靶序列为SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的sgRNA以及包括SEQ ID NO：3所示序列的供体模板，其中所述RS1蛋白突变体相对于野生型RS1蛋白包括氨基酸替换R213W。

本文提供了一种携带我国临床患者致病突变的RS1小鼠动物模型的制备方法及其用途，该模型首次、创新性地将发明人在临床上发现的致病突变开发为动物模型，使其在应用和研究中更能代表我国临床患者的表型。该模型表型显著，传代稳定，是基因治疗研究的极佳选择。

附图说明

图1显示了gRNA-A1脱靶效应评估结果。CRISPRater得分：0.62。

图2显示了gRNA-B1脱靶效应评估结果。CRISPRater得分：0.68。

图3显示了F0代小鼠基因型鉴定测序结果。

图4显示了F1代小鼠基因型鉴定PCR结果。

图5显示了F1代小鼠基因型鉴定测序结果。

图6显示了F1代小鼠表型鉴定结果：OCT检查模型小鼠视网膜囊腔。

图7显示了F1代小鼠表型鉴定结果：ERG检查模型小鼠视觉功能。

具体实施方式

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。

“遗传修饰”在本文中指导致细胞或生物体的基因组、基因或其片段的核苷酸序列发生变化的任何手段或技术。本领域已知多种遗传修饰的方法，包括但不限于，同源重组和基因编辑技术，例如，锌指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFNs)基因编辑技术；转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)基因编辑技术；CRISPR基因编辑系统技术，例如，CRISPR/Cas9；单碱基编辑(base editing,BE)，如CBE和ABE；以及引导编辑(prime editing,PE)技术。

对于特定蛋白的编码基因来说，遗传修饰的结果可以是引起同义突变(例如，由于密码子的简并性，单个碱基的突变不导致蛋白氨基酸序列的突变)，也可以是错义突变(例如，单个碱基的突变导致蛋白氨基酸序列的突变)。

采用CRISPR基因编辑系统的CRISPR(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats)基因编辑技术是一种由RNA指导的通过Cas核酸酶对靶基因进行DNA编辑的技术。该技术所使用的CRISPR基因编辑系统包括Cas核酸酶和引导RNA(single-guide RNA,sgRNA)，视情况可还包括用于修复的作为供体模板的ssDNA或dsDNA。sgRNA的一部分序列可以与Cas核酸酶结合，另外部分序列可以与靶基因的部分序列互补，借助sgRNA的识别作用使得Cas核酸酶可以在靶基因特定位点形成单链或双链切口。细胞通常会通过两种方式对断裂链进行DNA修复，这两种方式分别是同源重组修复机制(homology-directed repair,HDR)和非同源末端连接修复机制(non-homologous end joining,NHEJ)。在向细胞提供修复用供体模板时，可以让细胞根据该修补模板进行切口修复。如果在修复模板(ssDNA)中加入突变核苷酸，则在同源重组修复后可以产生技术人员期望的突变，实现基因编辑目的。不提供修复模板情况下的NHEJ修复机制则可能会产生多种突变产物，也可以对这些突变产物进行筛选以获得技术人员期望的突变产物。最近，在上述CRISPR基因编辑系统上又发展了各种定点单碱基编辑器，例如CBE、ABE以及它们的各种改进变体等，这些碱基编辑器利用了改造的Cas酶与各种脱氨酶形成的融合蛋白，在sgRNA指导下在特定位点形成核苷酸定向改变。这种碱基编辑器可以认为是改进的CRISPR基因编辑技术，当本文提及CRISPR基因编辑时也将它们涵盖在内。另外，本领域技术人员还可预期可采用DNA同源重组、借助核酸内切酶(如ZFN和TALEN)进行特定位点剪切以引入基因变动。只要能够产生期望的抗原表位变化，利用这些以及其它的基因改造技术也应涵盖在本发明的保护范围内。

“野生型RS1蛋白”指生物体(如人和非人哺乳动物)内天然产生的RS1蛋白。在存在蛋白多态性的情况下，“野生型”指其含量占优势的蛋白种类。例如，对于人野生型RS1蛋白，其序列如SEQ ID NO：7所示；对于小鼠野生型RS1蛋白，其序列如SEQ ID NO：8所示。

“蛋白突变体”或“突变蛋白”，指相对于对应的野生型蛋白，在氨基酸序列上存在改变的蛋白。该改变可体现在氨基酸残基的替换、缺失或添加。在一个实例中，本发明人发现，在RS1蛋白突变体中存在氨基酸替换R213W时，患者会出现视网膜劈裂症。本文在以“R213W”形式表示氨基酸替换时，数字之前的氨基酸单字母缩写符号指人野生型蛋白中的氨基酸残基，数字指蛋白中的氨基酸位置顺序编号，数字之后的氨基酸单字母缩写符号指突变体蛋白中的氨基酸残基。为了方便描述，该氨基酸替换也可用于表示其他非人哺乳动物中的相应突变，具体突变位置可通过将其他非人哺乳动物的RS1蛋白与人野生型RS1蛋白(SEQ ID NO：7进行氨基酸序列比对获得。

“受精卵”在本文中指来非人动物的单倍体雄性生殖细胞(精子)和雌性生殖细胞(卵子)经受精过程产生的二倍体细胞。受精卵在发育后(如通过代孕方式进行)可形成非人成体动物。这里所用的“成体动物”指完整动物个体，包括幼年个体和成熟个体。通过对受精卵进行遗传修饰，可获得携带该遗传修饰的非人成体动物。另外，由于胚胎干细胞(取自受精卵发育至桑椹胚之前的细胞)也具有发育全能性，也可对非人胚胎干细胞进行遗传修饰而获得携带该遗传修饰的非人成体动物。本发明人还预期可以对生殖细胞(精子或卵子)或甚至体细胞进行遗传修饰，随后产生携带该遗传修饰的非人成体动物(或转基因动物)，这些方法也包括在本发明的范围内。

“纯合子”在本文中指对于二倍体细胞或生物体来说，其细胞中两条同源染色体上等位基因在所关注的位点具有相同的核苷酸碱基或核苷酸序列。“杂合子”则指细胞中两条同源染色体上等位基因在所关注的位点具有不同的核苷酸碱基或核苷酸序列。由于本文所关注的RS1基因位于X染色体上，当提及纯合子或杂合子时，主要指纯合子或杂合子雌性动物。

“治疗剂”指能够治疗特定疾病的任何物质或手段。“治疗”指对受试者进行处理以获得有益的或所期望的临床结果。本文所用的“治疗”涵盖各种处理手段，包括以任何可能的药物向受试者给药、手术、辐射等。出于本发明的目的，有益或所期望的临床结果包括但不限于以下的任一种或多种：减轻一种或更多种症状、减弱疾病程度、预防或延迟疾病发展、预防或延迟疾病复发、延迟或减缓疾病进展、改善疾病病况、抑制疾病或疾病进展、阻滞其发展和缓解(无论部分抑或完全缓解)。因此，本文所述的“治疗剂”涵盖这些治疗方面中的任一种或多种。按照以上内容，“治疗”不需要完全去除病症或疾病的所有症状或完全缓解。

“受试者”在本文中指动物，例如哺乳动物，包括(但不限于)人类、啮齿动物、猿猴、猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物、猪科动物、绵羊、山羊、哺乳类实验动物、哺乳类农畜、哺乳类运动动物和哺乳类宠物。受试者可为雄性或雌性且可为任何适龄受试者，包括婴儿、幼年、青年、成年和老年受试者。在一些实例中，受试者指需要治疗疾病或病症的个体。在一些实例中，接受治疗的受试者可为患者，其患有与该治疗有关联的病症，或有风险患上该病症。在特定实例中，受试者为人类，诸如人类患者。该术语通常可与“患者”、“检测对象”、“治疗对象”等互换使用。

本文提供了制备视网膜劈裂症动物模型的方法，包括在动物RS1蛋白中产生R213W突变。在优选的实施方案中，可通过对受精卵基因组进行基因编辑而获得核苷酸序列发生定点突变的RS1基因。本发明人发现，采用靶序列为SEQ ID NO：1和2的sgRNA以及序列为SEQID NO：3供体模板DNA对小鼠受精卵细胞进行基因编辑，具有高编辑效率和低脱靶效率的特点，用于建立动物模型时成功率高。本发明人还发现，经该基因编辑处理的卵细胞发育成的小鼠视网膜劈裂症症状明显，并且传代稳定，因此适合用于视网膜劈裂症症状或相关药物的研究。

以下通过具体实施例来进一步说明本发明。

实施例1RS1点突变小鼠模型的建立

RS1基因(人NCBI ID：6247，小鼠NCBI ID：20147)在X染色体上，全长约36kb。该基因编码一种细胞外分泌蛋白，该蛋白在视网膜的细胞组织中起着至关重要的作用。编码的蛋白质从光感受器和双极细胞中组装和分泌，作为同源低聚蛋白复合体，该基因的突变导致X-连锁视网膜劈裂症，这是一种在男性中常见的早发的黄斑变性，会导致视网膜内层的分裂和严重的视力丧失。

1.1小鼠品系选择

不同品系的小鼠，其在眼睛的功能及保守性方面可能有差异。为了确保所制备模型在模拟人的临床表型方面的一致性，选取C57BL/6J小鼠作为制备品系。

1.2靶点选择

选择一个新的靶点来进行模型制备，该靶点由本团队从临床患者中发现，且未应用于动物模型的制备，具体为p.R213W(CGG to TGG)，位于6号外显子上，该位点突变会造成一个同义突变p.I212＝(ATC to ATA)。

1.3Cas9/sgRNA设计及合成构建

针对靶突变位点，我们设计了多个gRNA序列，其中两个gRNA序列为高分gRNA，同时在编辑效率和脱靶效率方面最佳。

gRNA-A1(匹配基因的反向链)：GCTCCATCCGGATGGCAATTCGG(SEQ ID NO:1)

gRNA-B1(匹配基因的正向链)：TGTCCGAATTGCCATCCGGATGG(SEQ ID NO:2)。

同时设计donor oligo(ssDNA)，序列如下(红色为突变序列)：

CCCCATCATTTCCCGCTTCATCCGACTGATCCCTCTAGGCTGGCATGTCCGAATT GCCATATGGATGGAGCTGCTTGAGTGTGCCAGCAAGTGTGCCTGATGTCTATTTCAG CTCAGTTCTG(SEQ ID NO:3)

序列由金斯瑞生物科技股份有限公司合成。

不同的gRNA可以影响CRISPER-Cas9系统在细胞中的靶向效率以及脱靶效应，不同sgRNA的脱靶位点不同。如所报道的，准确度(如脱靶、识别度低等)和适应性(如毒性、特异性和耐药性等)成为采用CRISPER-Cas9系统进行靶向基因治疗研究的关键问题。因此，选择恰当的gRNA序列对于基因靶向研究至关重要。本申请也对gRNA-A1和gRNA-B1的脱靶效应进行了检测，结果如图1和图2所示，两个gRNA的脱靶效率都很低，证明特异性和安全性良好。

1.4显微注射

筛选3-4周C57BL/6J雌鼠，分别注射孕马血清(PMSG)与绒毛膜促性腺激素(hcg)，两者时间间隔46-48h。注射HCG后将雌鼠与成年的可育雄鼠交配，使雌鼠受精，次日将雌鼠安乐死后，从输卵管内收集受精卵，放置37℃恒温5％的CO

将gRNA-A1和gRNA-B1分别进行体外转录，制备RNP复合物(两gRNA同时使用)。

制备显微注射注射针和固定针，将制备好的mRNA注射液加样到显微注射针内。筛选形态正常的受精卵置于注射皿内，在200-400倍的倒置显微镜下，将外源基因注射溶液通过显微注射的方式注射到受精卵细胞核内。将注射完毕的受精卵转移到M16培养基中，并放入37℃恒温5％的CO

1.5代孕鼠制备及胚胎移植

准备假孕母鼠：选取适龄的可育母鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，刺激母鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠，作为受精卵转基因后的代孕鼠。将已经注射了外源基因的受精卵移植到见栓当天的代孕母鼠的输卵管内，移植后将代孕母鼠放在干净的笼盒中，并保温待其清醒后放回笼架饲养。输卵管移植成功后，母鼠一般会在手术后19-20d产仔；小鼠出生1周后，可对小鼠进行剪爪编号，同时进行PCR鉴定；小鼠出生3周后，可分笼独立饲养。

1.6F0代小鼠基因型鉴定

采集1-2周龄的幼鼠组织(尾巴或者脚趾组织)，对组织进行裂解和提取基因组，用针对目的基因的特异性引物进行PCR扩增及电泳检测，筛选出外源基因整合的后代。根据RS1基因的突变位点序列设计鉴定引物，序列如下：

Forward primer(F1):5’-TGCTGCAAGCTTTCTGTACTCAAT-3’(SEQ ID NO:4)

Reverse primer(R1):5’-AAATTACCCCTGCTATTTGGGTTTG-3’(SEQ ID NO:5)

采用LongAmp Taq DNA polymerase(NEB M0323L)，根据说明书进行相应的PCR检测，其中反应体系如下：

实验条件如下：

具有RS1点突变小鼠的F0代小鼠经过此轮PCR鉴定，将产生长度为746bp的片段，而野生型小鼠也会产生同样大小的片段，因此需要对小鼠基因型进行测序鉴定。

采用测序引物F2:5’-GCTGCAAGCTTTCTGTACTCAATA-3’(SEQ ID NO:6)对小鼠基因型进行测序鉴定，结果如图3所示，阳性动物产生了p.R213W(CGG to TGG)突变(ATC toATA)。

实施例2RS1点突变小鼠模型的传代和建系

将带有外源基因的小鼠与未经转基因的小鼠交配、传代，每只首建鼠都需要独立进行传代。对出生的F1小鼠进行鉴定，能正常生殖系传递的F0，其后代有50％机率带有整合的目的基因，可将获得的F1阳性小鼠用于实验和继续传代。如果需要获得纯合子，可能来源相同的的阳性F1进行同胞交配，出生的F2代小鼠，会有25％的概率为纯合子；将筛选出目的基因有表达的小鼠，建系稳定的传代，同时记录传代情况和谱系。

2.1F1代小鼠基因型PCR鉴定

将鉴定为阳性的F0代小鼠分别与野生型小鼠交配以产生F1代小鼠，并对获得的F1代小鼠的基因型通过PCR方法进行鉴定。

采用的引物如下：

F1:5’-TGCTGCAAGCTTTCTGTACTCAAT-3’(SEQ ID NO:4)

R1:5’-AAATTACCCCTGCTATTTGGGTTTG-3’(SEQ ID NO:5)

采用LongAmp Taq DNA polymerase(NEB M0323L)，根据说明书进行相应的PCR检测，其中反应体系如下：

实验条件如下：

两个上游引物分别与下游引物同时进行PCR扩增，产生746bp大小的产物，结果如图4所示。

2.2F1代小鼠基因型测序鉴定

用测序引物F2:5’-GCTGCAAGCTTTCTGTACTCAATA-3’(SEQ ID NO:6)进行测序鉴定，分别得到野生型、杂合子、纯合子，结果如图5所示。

实施例3.RS1点突变小鼠模型的表型

3.1小鼠光相干断层扫描(OCT)检查

选取适龄小鼠(雄性)进行光相干断层扫描(OCT)检测(Phoenix TechnologyGroup，型号：micro IV)。小鼠经复方托吡卡胺滴眼液点眼散瞳后腹腔注射阿佛丁进行麻醉。在散瞳完成的小鼠眼球上涂抹透明的左氧氟沙星凝胶，将小鼠置于鼠台暖垫上，调整鼠台角度使小鼠角膜位于镜头正中，推近镜头，直至屏幕上出现眼底像，适当调整亮度和镜头位置，使眼底像变清晰。将OCT照射位置调节至视盘正中。通过调节对比度等参数，选择叠加次数，即可进行图像采集。

通过OCT检查纯合小鼠视网膜，可以看到视网膜层有很多囊腔，呈现出显著的视网膜劈裂的表型，如图6所示。

3.2小鼠视网膜电流图(electroretinogram，ERG)检查

实验前一晚对小鼠进行暗适应，在暗红光下用复方托吡卡胺滴眼液散瞳三次，每10分钟一次，共三次，使小鼠瞳孔散到最大。1.25％三溴乙醇腹腔麻醉，待小鼠完全麻醉后置于CELERIS电生理动物实验台(美国Diagnosys公司)，调节恒温37℃，滴盐酸奥布卡因滴眼液至角膜，以保持角膜湿润并增加导电性。将角膜刺激器接触到小鼠角膜上，各电极阻抗小于10千欧，记录不同光强暗适应ERG(-2.5，-2，-1，0，1log cd·s/m

通过ERG检查小鼠的明反应和暗反应，可以看到和正常小鼠相比，模型小鼠对光的反应都明显降低，a波和b波的振幅显著下降，呈现出视觉功能损伤，表型显著，如图7所示。

本文及附图中提到的一些氨基酸和核苷酸序列如下。

人野生型RS1蛋白序列(SEQ ID NO：7)

MSRKIEGFLLLLLFGYEATLGLSSTEDEGEDPWYQKACKCDCQGGPNALWSAGATSLDCIPECPYHKPLGFESGEVTPDQITCSNPEQYVGWYSSWTANKARLNSQGFGCAWLSKFQDSSQWLQIDLKEIKVISGILTQGRCDIDEWMTKYSVQYRTDERLNWIYYKDQTGNNRVFYGNSDRTSTVQNLLRPPIISRFIRLIPLGWHVRIAIRMELLECVSKCA

小鼠野生型RS1蛋白序列(SEQ ID NO：8)

MPHKIEGFFLLLLFGYEATLGLSSTEDEGEDPWYQKACKCDCQVGANALWSAGATSLDCIPECPYHKPLGFESGEVTPDQITCSNPEQYVGWYSSWTANKARLNSQGFGCAWLSKYQDSSQWLQIDLKEIKVISGILTQGRCDIDEWVTKYSVQYRTDERLNWIYYKDQTGNNRVFYGNSDRSSTVQNLLRPPIISRFIRLIPLGWHVRIAIRMELLECASKCA

包括TGG(R213W)和ATA突变的小鼠RS1基因片段(SEQ ID NO:9)

CGACTGATCCCTCTAGGCTGGCATGTCCGAATTGCC

与上述小鼠RS1基因片段(SEQ ID NO:9)对应的野生型片段序列(SEQ ID NO:10)：

CGACTGATCCCTCTAGGCTGGCATGTCCGAATTGCCATCCGGATGGAGCTGCTTGAGTGTGCCAGCAAGTGTGCCTGATG

参考文献：

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