一种壳寡糖稳态化制备方法

技术领域

本发明属于多糖制备技术领域，尤其是涉及一种壳寡糖稳态化制备方法。

背景技术

壳聚糖是由几丁质脱乙酰化得到的一种线性多糖，通过β-1,4-糖苷键。连接2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖和2-氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖而成。

壳寡糖是由2-10个D-氨基葡萄糖(或少量N-乙酰-D-氨基葡萄糖)以β-1,4-糖苷键连接而成的低聚糖(及其盐)。壳寡糖具有丰富的生理活性如双向免疫调节、抑制肿瘤、抗氧化等，在食品、农业、医药、化妆品等领域具有广阔的应用前景，且不同聚合度壳寡糖具有不同的生理活性。

壳寡糖的制备方法主要有物理法、化学法和酶解法三种。其中酶法工艺是目前壳寡糖制备工艺中最主要的方法，是用专一性酶活非专一性酶对寡聚糖进行降解得到壳寡糖的方法，具有反应条件温和、污染小等优点，是公认的比较理想的绿色制备方法。然而，在壳寡糖制备过程中存在壳寡糖易褐变的问题，影响壳寡糖产品品质。解决壳寡糖制备过程中产品稳定性问题是亟待解决的重要问题。

Zhang在文章(Zhang J,Mei Z,Huang X,et al.Inhibition ofMaillardreaction in production of low-molecular-weight chitosan by enzymatichydrolysis.Carbohydrate Polymers,2020,236,116059)中将壳聚糖酶解液超滤膜过滤并干燥得到壳寡糖样品，分别考察了温度、pH、湿度和氧含量对壳寡糖产品稳定性的影响，发现pH、温度和湿度对壳寡糖产品影响显著，认为这些因素加速了壳寡糖发生美拉德反应，然而该文没有进一步研究导致壳寡糖发生美拉德反应的深层原因。

Liu在文章(Liu L,Zheng J,X Zhang,et al.Interfacing phosphatecatalyticreaction with microbial metabolism for production of azaphilonealkaloids.ReactionChemistry&Engineering,2020,5,2048-2052)中发现弱酸型无机盐催化半缩醛类化合物与伯氨类化合物反应，该反应是美拉德反应的第一步反应。

因而，如何发掘壳寡糖产品制备过程中导致产品褐变的关键因素，实现稳态化制备壳寡糖是壳寡糖制备过程中的关键问题。

发明内容

基于现有技术在壳寡糖制备过程中存在壳寡糖易褐变的问题，本发明提供一种壳寡糖稳态化制备方法。

本发明的主要方案是：

壳聚糖酶降解壳聚糖形成壳寡糖溶液，该溶液经超滤膜预过滤后，利用电渗-超滤一体膜技术除去壳寡糖产品中夹带的缓冲盐，解决壳寡糖产品的褐变问题，同时去除溶液中的较高聚合度壳寡糖，制备出壳二糖到壳五糖含量在80％以上的窄分布壳寡糖。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供一种壳寡糖稳态化制备方法，对壳寡糖制备过程关键步骤进行稳态化控制，除去引起壳寡糖褐变的缓冲盐，获取壳二糖-壳五糖含量在80％以上的窄分布壳寡糖。

本发明壳寡糖稳态化制备方法，涉及的工艺流程为：壳聚糖溶解--酶解过程--超滤膜预过滤--电渗-超滤一体膜技术精制—浓缩干燥得壳寡糖产品。

进一步地，所述壳寡糖稳态化制备方法，包括以下步骤：

第一步、壳聚糖溶解：将壳聚糖溶解到缓冲盐溶液中，得到壳聚糖溶液；

第二步、壳聚糖酶解：在第一步所得的壳聚糖溶液中加入壳聚糖酶，进行酶解反应；

第三步、超滤膜预过滤：酶解结束后，酶解液迅速灭活，采用超滤膜预过滤；

第四步、电渗-超滤一体膜技术精制：预过滤后的壳寡糖混合液在电场作用下，根据其不同的分子量和荷电性迁移，在回收室中得到除去缓冲盐的窄分子量分布的壳寡糖溶液；

第五步、浓缩干燥，得到壳二糖到壳五糖含量在80％以上的窄分布壳寡糖。

在本发明的一些实施方式中，第一步中，壳聚糖与缓冲盐溶液的质量体积比为1：10-100；所述缓冲盐溶液的pH为3-8，所述缓冲盐选择为磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐或MES中的一种或两种组合。

在本发明的一些实施方式中，第二步中，按照50-500U/g的加酶量加入壳聚糖酶。

在本发明的一些实施方式中，第二步中，进行酶解反应的条件为：30-60℃反应1-10h。

在本发明的一些实施方式中，第三步中，酶解液迅速灭活的条件为：100℃或沸水浴灭活。

在本发明的一些实施方式中，第三步中，所述超滤膜截留分子量为3000-10000Da。

在本发明的一些实施方式中，第四步所述电渗-超滤一体膜技术精制中，电场强度4-20V/cm，进料室、回收室和极室流速1-10L/min；超滤膜组件为螺旋卷式膜、中空纤维膜、板式膜，材质为醋酸纤维素类、醋酸纤维素酯类、聚乙烯类、聚砜类或聚酰胺类，其截留分子量为500-3000Da；超滤操作中的操作温度为15-45℃，操作压力为0.3-1.5MPa，膜面流速为1-5m/s。

在本发明的一些实施方式中，第五步中，将壳寡糖溶液浓缩至壳寡糖质量分数为30％-50％。

本发明将壳聚糖酶解反应液用超滤膜预过滤，滤液利用电渗-超滤一体膜技术精制，除去缓冲盐，制备得到壳二糖-壳五糖含量在80％以上的窄分布壳寡糖。本发明技术方案利用电渗-超滤一体膜技术去除了产品中夹带的缓冲盐，解决了壳寡糖产品褐变问题，同时获得壳二糖-壳五糖含量在80％以上的窄分布壳寡糖。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下方面：

1)采用电渗-超滤一体膜技术，既利用电场作用去除溶液中带负电荷的缓冲盐，又利用超滤膜截留较高分子量壳寡糖。

2)相对于通过对壳寡糖用保护基团保护、包埋等稳态化技术手段，本技术操作过程安全、简单，省去了其它试剂、材料的加入，节省了成本。

附图说明

图1、超滤膜预过滤得到壳寡糖溶液直接浓缩干燥的产品(含有缓冲盐的样品)和电渗-超滤一体膜技术精制后浓缩干燥得到壳寡糖产品(除去缓冲盐的样品)的光谱图。

图2、电渗-超滤一体膜技术精制前和精制后的HPLC图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

取1000g壳聚糖加入到50L磷酸盐缓冲液中，缓冲液浓度0.4mol/L，pH6，搅拌均匀。加入100000U壳聚糖酶，50℃反应5h。反应结束后，沸水浴灭酶，3000Da超滤膜预过滤。再经过电渗-超滤一体膜技术精制，电场强度10V/cm，进料室、回收室和极室流速8L/min；超滤膜组件截留分子量为500Da；超滤操作中的操作温度为30℃，操作压力为1.2MPa，膜面流速为5m/s。获得的溶液经过浓缩、喷雾干燥获得米白色粉末状产品，经HPLC检测，壳二糖-壳五糖的含量为85.1％。

实施例2

取1000g壳聚糖加入到30L醋酸盐缓冲液中，缓冲液浓度0.2mol/L，pH6，搅拌均匀。加入100000U壳聚糖酶，50℃反应4h。反应结束后，沸水浴灭酶，5000Da超滤膜预过滤。再经过电渗-超滤一体膜技术精制，电场强度8V/cm，进料室、回收室和极室流速4L/min；超滤膜组件截留分子量为800Da；超滤操作中的操作温度为30℃，操作压力为0.8MPa，膜面流速为4m/s。获得的溶液经过浓缩、喷雾干燥获得米白色粉末状产品，经HPLC检测，壳二糖-壳五糖的含量为83.3％。

实施例3

取1000g壳聚糖加入到40L柠檬酸盐缓冲液中，缓冲液浓度0.1mol/L，pH5.5，搅拌均匀。加入100000U壳聚糖酶，50℃反应3h。反应结束后，沸水浴灭酶，8000Da超滤膜预过滤。再经过电渗-超滤一体膜技术精制，电场强度9V/cm，进料室、回收室和极室流速6L/min；超滤膜组件截留分子量为1000Da；超滤操作中的操作温度为30℃，操作压力为1.0MPa，膜面流速为5m/s。获得的溶液经过浓缩、喷雾干燥获得米白色粉末状产品，经HPLC检测，壳二糖-壳五糖的含量为81.4％。

实施例4

取800g壳聚糖加入到30L磷酸盐缓冲液中，缓冲液浓度0.2mol/L，pH5，搅拌均匀。加入60000U壳聚糖酶，50℃反应6h。反应结束后，沸水浴灭酶，5000Da超滤膜预过滤。再经过电渗-超滤一体膜技术精制，电场强度5V/cm，进料室、回收室和极室流速5L/min；超滤膜组件截留分子量为800Da；超滤操作中的操作温度为30℃，操作压力为1.0MPa，膜面流速为4m/s。获得的溶液经过浓缩、喷雾干燥获得米白色粉末状产品，经HPLC检测，壳二糖-壳五糖的含量为82.9％。

实施例5

取900g壳聚糖加入到30L醋酸盐缓冲液中，缓冲液浓度0.4mol/L，pH5，搅拌均匀。加入180000U壳聚糖酶，50℃反应3h。反应结束后，沸水浴灭酶，3000Da超滤膜预过滤。再经过电渗-超滤一体膜技术精制，电场强度10V/cm，进料室、回收室和极室流速10L/min；超滤膜组件截留分子量为500Da；超滤操作中的操作温度为30℃，操作压力为1.2MPa，膜面流速为9m/s。获得的溶液经过浓缩、喷雾干燥获得米白色粉末状产品，经HPLC检测，壳二糖-壳五糖的含量为84.2％。

实施例6

取700g壳聚糖加入到50L柠檬酸盐缓冲液中，缓冲液浓度0.3mol/L，pH5，搅拌均匀。加入140000U壳聚糖酶，50℃反应4h。反应结束后，沸水浴灭酶，5000Da超滤膜预过滤。再经过电渗-超滤一体膜技术精制，电场强度5V/cm，进料室、回收室和极室流速6L/min；超滤膜组件截留分子量为800Da；超滤操作中的操作温度为30℃，操作压力为0.8MPa，膜面流速为3m/s。获得的溶液经过浓缩、喷雾干燥获得米白色粉末状产品，经HPLC检测，壳二糖-壳五糖的含量为80.9％。

对比例1

与实施例1相比，区别在于，对比例1未经电渗-超滤一体膜技术处理，超滤膜预过滤得到壳寡糖溶液直接浓缩干燥获得壳寡糖。

对比例1与实施例1所得壳寡糖的光谱图如图1所示，其中，图1中含有缓冲盐的样品是指采用对比例1的方法，超滤膜预过滤得到壳寡糖溶液直接浓缩干燥的产品。除去缓冲盐的样品是指采用实施例1的方法，超滤膜预过滤后，经过电渗-超滤一体膜技术精制后浓缩干燥得到壳寡糖产品。

对比例1与实施例1所得壳寡糖的HPLC图如图2所示，其中，图2中A是指采用对比例1的方法，超滤膜预过滤得到壳寡糖溶液(壳寡糖浓度10g/L)的HPLC图。B是指采用实施例1的方法，超滤膜预过滤后，经过电渗-超滤一体膜技术精制后壳聚糖溶液(壳寡糖浓度10g/L)的HPLC图。

对按照实例1-6的方法制备得到的壳寡糖与对比例1获得的壳寡糖进行灰分及壳二糖-壳五糖含量进行比较，结果见表1：

表1.不同实施例制备的壳寡糖指标检测：

可见，采用电渗-超滤一体膜技术，既可以利用电场作用去除溶液中带负电荷的缓冲盐，又利用超滤膜截留较高分子量壳寡糖，实施例1-6的方案所得壳寡糖灰分更低，同时壳二糖-壳五糖的含量更高。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。