一种来源于富硒牡蛎的具有ACE抑制活性的肽及其应用

技术领域

本发明属于活性肽技术领域，具体涉及一种来源于富硒牡蛎的具有ACE抑制活性的肽及其应用。

背景技术

高血压是指以体循环动脉血压升高(收缩压/舒张压≥140mmHg/90mmHg)为主要临床特征的慢性疾病，其患病率逐年上升且呈现出年轻化的趋势，预计至2025年，全世界患高血压的人数将增加到近15.6亿。高血压并发症如卒中、心肌梗死、心力衰竭和慢性肾脏病等，致残致死率高，给家庭和社会造成沉重负担，已成为全球范围内一个巨大的公共卫生问题。因此，如何有效地预防和治疗高血压疾病已成为当前研究的焦点问题。

血管紧张素转化酶(Angiotensin I-converting enzyme，ACE)是肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system，RAS)和激肽释放酶-激肽系统(Kallikrein-kininsystem，KKS)两个血压调节系统中的关键酶。ACE能够将无活性的十肽血管紧张素Ⅰ(Angiotensin I，AngⅠ)的羧基端水解成有活性的八肽血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)，导致收缩压增加，此外，ACE还能作用于具有血管舒张作用的缓激肽(Bradykinin，BK)并使它水解为失活片段，从而引起血压升高。因此，有效抑制ACE活性被认为是预防和治疗高血压的关键方法。由于大部分化学合成的ACE抑制剂(卡托普利、依那普利、赖诺普利和贝那普利等)存在着潜在的肾功能损害、干咳、皮疹、血管神经性水肿等副作用，安全性高、易被吸收的天然来源的ACE抑制肽已经成为研究热点。食源性ACE抑制肽来源广泛，大量研究学者已经从乳源、海洋动物、谷物、大豆、坚果等众多动植物蛋白资源中获得了不同组成的ACE抑制肽。

专利CN102311484A公开了一种抑制血管紧张素转移酶的六肽，能有效抑制ACE活性。但相关研究还较少。

因此开发一种具有高抑制ACE活性的天然活性肽具有重要的研究意义。

发明内容

本发明的目的在于克服具有高抑制ACE活性的天然活性肽缺乏的缺陷或不足，提供一种来源于富硒牡蛎的具有ACE抑制活性的肽。本发明提供的具有ACE抑制活性的肽具有较高的硒含量，能够与ACE的S1、S2和S1′活性口袋中的多个氨基酸残基通过氢键和静电作用结合，可有效抑制ACE活性；且促进EA.hy926细胞NO的释放及抑制ET-1的分泌，在制备ACE抑制剂、功能性食品、药物等方面具有广泛的用途。

本发明的另一目的在于提供上述具有ACE抑制活性的肽在制备ACE抑制剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供上述具有ACE抑制活性的肽在制备功能性食品中的应用。

本发明的另一目的在于提供上述具有ACE抑制活性的肽在制备降血压的药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供上述具有ACE抑制活性的肽在制备保健品中的应用。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种来源于富硒牡蛎的具有ACE抑制活性的肽，所述具有ACE抑制活性的肽具有如SEQIDNO：1所示序列，且所述具有ACE抑制活性的肽中的蛋氨酸M中的硫元素被硒取代。

具体地，SEQIDNO：1所示序列的肽为MFRTSSK(Met-Phe-Arg-Thr-Ser-Ser-Lys)，蛋氨酸M中的硫元素被硒取代后的序列记为SeMFRTSSK，SeM代表蛋氨酸M中的硫元素被硒取代。

本发明的发明人从牡蛎中获得了该特定序列的具有ACE抑制活性的肽，分子量为903.3717Da。经测定，该具有ACE抑制活性的肽具有较高的硒含量，能够与ACE的S1、S2和S1′活性口袋中的多个氨基酸残基通过氢键和静电作用结合，可有效抑制ACE活性；且促进EA.hy926细胞NO的释放及抑制ET-1的分泌，在制备ACE抑制剂、功能性食品、药物等方面具有广泛的用途。

上述ACE抑制活性的肽在制备ACE抑制剂中的应用也在本发明的保护范围内。

优选地，所述具有ACE抑制活性的肽在制备与ACE的氨基酸残基Ala354、Glu384、Tyr523、Gln281、His353、Lys511、His513通过氢键结合的ACE抑制剂中的应用。

研究发现，具有ACE抑制活性的肽能够与ACE的S1、S2和S1′活性口袋中的多个氨基酸残基通过氢键和静电作用结合，可有效抑制ACE活性。

一方面，SeMFRTSSK可与ACE活性口袋中的Ala354、Glu384、Tyr523、Gln281、His353、Lys511、His513氨基酸残基形成氢键，对稳定对接复合物和抑制ACE抑制活性起到最重要的作用。

优选地，所述具有ACE抑制活性的肽在制备与ACE的氨基酸残基Ala354、Glu384、Tyr523、Gln281、His353、Lys511、His513通过氢键结合的ACE抑制剂中的应用。

另一方面，SeMFRTSSK可与ACE活性口袋中的Glu162氨基酸残基形成静电作用，进而抑制ACE活性。

优选地，所述具有ACE抑制活性的肽在制备与ACE的氨基酸残基Glu162通过静电作用结合的ACE抑制剂中的应用。

本发明还请求保护具有ACE抑制活性的肽在制备功能性食品中的应用。

上述具有ACE抑制活性的肽在制备降血压的药物中的应用也在本发明的保护范围内。

研究发现，该具有ACE抑制活性的肽可促进EA.hy926细胞NO的释放及抑制ET-1的分泌，进而可用于制备降血压的药物。

优选地，所述具有ACE抑制活性的肽在制备促进NO的释放的药物中的应用。

优选地，所述具有ACE抑制活性的肽在制备抑制ET-1的分泌的药物中的应用。

上述具有ACE抑制活性的肽在制备保健品中的应用也在本发明的保护范围内。

优选地，所述具有ACE抑制活性的肽在ACE抑制剂、功能性食品、药物或保健品中的添加量为0.005～0.025μg/mL。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的具有ACE抑制活性的肽具有较高的硒含量，能够与ACE的S1、S2和S1′活性口袋中的多个氨基酸残基通过氢键和静电作用结合，可有效抑制ACE活性；且促进EA.hy926细胞NO的释放及抑制ET-1的分泌，在制备ACE抑制剂、功能性食品、药物等方面具有广泛的用途。

附图说明

图1为蛋白酶种类对富硒牡蛎蛋白酶解物的ACE抑制活性的影响；

图2为实施例2中具有ACE抑制活性的肽的纯化富集的结果，其中图2A为制备液相一次分离色谱图；图2B为一次分离各分离组分在1mg/mL浓度下的ACE抑制活性；图2C为制备液相二次分离色谱图；图2D为二次分离各分离组分在1mg/mL浓度下的ACE抑制活性；

图3为具有ACE抑制活性的肽与ACE的分子对接结果；其中图3A为ACE-SeMFRTSSK复合物；图3B为SeMFRTSSK与ACE的氨基酸残基相互作用的2D示意图。

图4为具有ACE抑制活性的肽对EA.hy926细胞活力的影响。

图5为具有ACE抑制活性的肽对EA.hy926细胞NO含量的影响。

图6为具有ACE抑制活性的肽对EA.hy926细胞ET-1含量的影响。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

各实施例中使用的主要材料与试剂说明如下：

富硒牡蛎蛋白由北部湾滨海富硒功能农业研究院提供；碱性蛋白酶(2×10

实施例1富硒牡蛎蛋白酶解物的制备

本实施例利用一系列的单一酶：碱性蛋白酶(55℃，pH8.5)、中性蛋白酶(45℃，pH7.0)、木瓜蛋白酶(55℃，pH6.5)、胰蛋白酶(37℃，pH8.0)对富硒牡蛎蛋白进行酶解，以得到活性较高的ACE抑制肽。

具体过程如下：将富硒牡蛎蛋白粉按5g/100mL的底物质量浓度溶于去离子水中，调节溶液pH至最适值。随后分别加入酶底比为0.3％的各类蛋白酶。在最适温度下酶解3h后，酶解液在95℃下加热10分钟以终止反应。冷却至室温后4000r/min离心20min，收集上清液，真空冷冻干燥后，-20℃保存备用。

图1为不同蛋白酶对富硒牡蛎蛋白酶解物ACE抑制活性的影响图，其中，ACE抑制活性按照如下方法测定得到：

ACE抑制活性参照已有的方法稍作修改进行测定。首先，将富硒牡蛎蛋白酶解物冻干样品，用0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液(pH8.3，含0.3mol/L NaCl)配制成所需浓度的ACE抑制剂(ACEI)溶液。反应加样顺序如下：加入10μL ACE溶液(0.1U/mL)后，样品管加入10μLACEI，37℃水浴预热5min后加入30μL HHL溶液(5.0mmol/L)，37℃水浴反应1h后，加入80μLHCl溶液(1.0mol/L)震荡混匀以中止反应，冷却至室温后的反应产物，用于进样检测马尿酸的生成量。对照管用10μL 0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液(pH8.3，含0.3mol/L NaCl)代替ACEI，空白管则在ACE溶液加入前用80μL HCl溶液(1.0mol/L)灭活酶。反应液用0.45μm滤膜过滤后用于HPLC分析。高效液相色谱条件：Welch Ultimate LC-C18(HS)(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；洗脱程序为乙腈：超纯水＝25:75(含0.1％(v/v)TFA)；流速：1.0mL/min；检测波长：228nm；柱温：30℃；进样量：20μL。计算公式为：

式中：A为对照组中马尿酸的色谱峰面积；B为样品组中马尿酸的色谱峰面积；A

由图1可知，富硒牡蛎蛋白在各蛋白酶最适条件下水解3h，四种蛋白酶水解液的ACE抑制率均不相同，反映了蛋白酶具有特异性。其中，胰蛋白酶产生的水解产物具有最强的ACE抑制率活性，达到90.95±0.28％，木瓜蛋白酶水解产物最低(65.76±1.13％)。因此，以胰蛋白酶为最适用酶进行大量制备具有ACE抑制活性的富硒牡蛎蛋白酶解物，用于后续分析。

实施例2具有ACE抑制活性的肽的纯化鉴定及分子对接分析

(1)超滤

基于分子量，使用超滤管(Amicon Ultra-15，过滤膜分子量为10kDa)对富硒牡蛎蛋白酶解液进行分离，4000r/min离心30min。收集分子量小于10kDa的组分，-20℃保存用于后续分析。

(2)制备液相色谱分离

采用Shimadzu PRC-ODS(K)钢柱(30mm×250mm，15μm)对超滤组分(<10kDa)进行制备液相色谱分离。制备条件为：流动相(A：一级水+0.1％TFA；B：甲醇+0.1％TFA)；洗脱程序：0～45min，5％～10％流动相B；45～65min，10％～20％流动相B；65～75min，20％～50％流动相B；75～85min，95％～95％流动相B；85～90min，95％～5％流动相B；进样量5mL；洗脱流速10mL/min；检测波长为214nm和280nm。将相同洗脱峰汇集，蒸发浓缩后冻干，检测其ACE抑制活性，以ACE抑制活性最强的组分进行下一步分离纯化。

ACE抑制活性测试中，以洗脱峰汇集、蒸发浓缩后冻干得到的样品作为待测样，其余条件与与实施例1中的测试方法一致。

如图2A所示，用制备液相对超滤组分进行纯化后，分离出5个主要峰，命名为M1～M5组分。当样品浓度为1mg/mL时，M1～M5组分都表现出一定的ACE抑制活性(图2B)，其中M4组分的ACE抑制活性最高，达到34.20±0.41％，具有显著性差异(p<0.05)。故选择M4进行下一步的分离和分析。

采用Prep 150制备液相系统，反相柱SunFire Prep C18 OBD

ACE抑制活性测试中，以M4分离后的活性组分旋转蒸发浓缩及冻干得到的样品作为待测样，其余条件与与实施例1中的测试方法一致。

二次制备的色谱图如2C，M4组分被进一步分成3个峰(M4-1～M4-3)，收集各组分并浓缩冻干后评价其ACE抑制活性。如图2D所示，当样品浓度为1mg/mL时，M4-2组分的ACE抑制率提高至56.96±0.11％，显著高于其余两个组分(p<0.05)。然而，M4-1和M4-3组分不具有ACE抑制活性。因此，大量收集M4-2组分用于后续分析。

(3)硒含量的测定

本实施例对具有ACE抑制活性的肽的纯化富集过程中的活性组分的硒含量进行测定，测试结果如表1。测试过程如下：样品的硒含量测定参照GB5009.93-2017《食品中硒的测定氢化物原子荧光光谱法》方法。试样消解采用湿法消解，称取适量样品置于锥形瓶中，加10mL硝酸-高氯酸混合酸(v/v，9:1)及几粒玻璃珠，盖上表面皿冷消化过夜。次日于电热板上加热，并及时补加硝酸。当溶液变为清亮无色并伴有白烟产生时，再继续加热至剩余体积为2mL左右，切不可蒸干。冷却，再加5mL盐酸溶液(6.0mol/L)，继续加热至溶液变为清亮无色并伴有白烟出现。冷却后转移至10mL容量瓶中，加人2.5mL铁氧化钾溶液(100g/L)，用水定容，混匀待测。同时做试剂空白试验。

仪器条件为：负高压280V；硒灯电流80mA；载气流量为300mL/min；屏蔽气流量为800mL/min；读数时间12s；延迟时间3s；测量方式标准曲线法。

表1硒含量及ACE抑制活性的IC

由表1可知，经胰蛋白酶酶解优化后，所得酶解物的硒含量明显增加，达到2.44±0.71mg/kg。经过两次分离纯化后，ACE抑制活性最高的组分M4-2的硒含量高达37.00±0.56mg/kg，相比酶解物硒含量增加了15.4倍，表明分离纯化过程中硒得到了极好地富集。

IC

除盐后的具有ACE抑制活性的肽组分经离心干燥后，重新溶解于含0.1％甲酸的去离子水中进行在线LC/MS分析。液相为Easy nLC 1200纳升液相系统(ThermoFisher,USA)，样品在nanoViper C18预柱上(3μm，

活性组分M4-2中共鉴定出91个ALC(％)≥60的硒肽序列，且肽序列均由4-13个氨基酸残基构成。

(5)分子对接筛选具有ACE抑制活性的肽单体

分子对接技术是一种直观有效的研究小分子配体和受体之间相互作用的方法，结合能是对接结果最直观的体现，配体与受体的结合能越低，配体-受体复合体构象结构的稳定性越高。

本实施例基于分子对接技术筛选潜在的ACE抑制活性的肽。过程如下：受体分子1O8A蛋白的晶体结构从RCSB Protein Data Bank(www.rcsb.org)下载得到。用PyMol软件去除受体分子中含有的水分子和原始配体，在ACE中的Zn

结果表明，91条肽中SeMFRTSSK(903.3717Da)与ACE的结合亲和力最低，为-9.8kcal/mol，推测其具有潜在ACE抑制活性。SeMFRTSSK中的硒元素以SeMet的形式存在(该肽中蛋氨酸M上的硫元素被硒元素取代)，其结构鉴定及分子对接筛选结果如表2。

表2具有ACE抑制活性的肽的结构鉴定及分子对接筛选

(6)分子对接分析具有ACE抑制活性的肽与ACE的相互作用

为进一步探究具有ACE抑制活性的肽SeMFRTSSK的活性作用模式，本实施例采用分子对接技术探究SeMFRTSSK与受体ACE之间的结合模式和作用位点。ACE有三个主要的活性位点区(S1、S2和S1′)。S1活性口袋包含Ala354、Glu384和Tyr523氨基酸残基，S2活性口袋包含Gln281、His353、Lys511、His513和Tyr520氨基酸残基，S1′包含Glu162氨基酸残基。研究报道，氢键和疏水相互作用是影响ACE和抑制药物复合物稳定性和抑制效果的两种主要相互作用。图3A显示了SeMFRTSSK与ACE的最佳对接构象，该肽能与ACE形成稳定的复合物，图3B则为SeMFRTSSK与ACE的氨基酸残基相互作用的2D示意图。如表3所示，氢键、疏水相互作用和静电作用是SeMFRTSSK与ACE的主要作用方式。SeMFRTSSK与S1、S2和S1′活性口袋中的氨基酸残基均有结合，这与已报道研究结果相吻合。SeMFRTSSK与ACE活性口袋中的Ala354、Glu384、Tyr523、Gln281、His353、Lys511、His513氨基酸残基形成了氢键，而抗高血压药物卡托普利也与ACE的Gln281、His353、His513、Lys511氨基酸残基形成氢键，这表明SeMFRTSSK可能与卡托普利存在某些相似的作用位点和活性机制。此外，SeMFRTSSK的SeMet与ACE的氨基酸残基Val379、Phe527形成疏水相互作用，结果表明硒元素的存在可能对具有ACE抑制活性的肽与ACE间的结合有促进作用，但硒元素在其中所起具体作用有待后续深入研究。

(7)具有ACE抑制活性的肽的合成

筛选出的具有ACE抑制活性的肽SeMFRTSSK由南京杰肽生物科技有限公司合成，经高效液相色谱(HPLC)分析，纯度大于98％，在-20℃下保存。

实施例3具有ACE抑制活性的肽的细胞降血压活性

(1)具有ACE抑制活性的肽对HepG2细胞毒性作用(MTT)检测

EA.hy926细胞的培养参考现有的方法，并稍做修改。将EA.hy926细胞接种于添加20％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基中，置于含5％CO

如图4所示，当浓度小于0.5mg/mL时，SeMFRTSSK处理组细胞活力在90％以上，对EA.hy926细胞无明显毒性作用。在0.01-0.05mg/mL浓度范围内，SeMFRTSSK还能促进细胞增殖。因此，SeMFRTSSK在0.001-0.25mg/mL浓度范围内可以作为安全的ACE抑制剂，对EA.hy926细胞没有细胞毒性。

(2)具有ACE抑制活性的肽对细胞分泌NO的影响

EA.hy926细胞是降血压活性研究中常用的经典细胞评价模型。NO是调节内皮细胞功能的一种重要介质，对血管平滑肌具有舒张效应，在平衡人体血压和维持血管张力恒定方面具有非常重要的作用。使用不同浓度具有ACE抑制活性的肽(SeMFRTSSK)对EA.hy926细胞进行处理，卡托普利作为阳性对照，结果见图5。与空白对照组相比，随着处理浓度的升高，SeMFRTSSK处理组NO含量逐渐增加，且当肽浓度达到0.025mg/mL时，SeMFRTSSK处理组的NO含量提高了202.65％，且显著高于卡托普利阳性对照组(p<0.05)。因此，该具有ACE抑制活性的肽能促进EA.hy926细胞产生NO，从而发挥抗高血压作用，且具有剂量效应。

(3)具有ACE抑制活性的肽对细胞分泌ET-1的影响

除了肾素血管紧张素系统，内皮素系统在血压调节中的作用日益被人们认可，其中ET-1具有强大的血管收缩和升压特性。本实施例采用具有ACE抑制活性的肽(SeMFRTSSK)处理EA.hy926细胞，通过检测ET-1水平的变化可以SeMFRTSSK的降血压活性。由图6可知，处理24h后，与空白对照组相比(109.72±1.66pg/mL)，当样品浓度≥0.01mg/mL时，SeMFRTSSK处理组对细胞ET-1的产生具有显著抑制效果(p<0.05),与卡托普利阳性对照组(88.67±0.91pg/mL)接近。本实验结果表明具有ACE抑制活性的肽在细胞水平上具有良好的降血压作用。综上，SeMFRTSSK在一定浓度下对EA.hy926细胞无明显毒害作用，且能够促进NO的产生，抑制ET-1的分泌。表明具有ACE抑制活性的肽可能通过增加NO的释放量，降低ET-1的分泌来发挥降血压作用。

最后应当指出的是，以上实施例仅是本发明的具有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明内容直接导出或联想到所有变形，均应认为是本发明的权利要求的保护范围。