一种产色素假交替单胞菌接合转移用培养基及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种产色素假交替单胞菌接合转移用培养基及其应用。

背景技术

当前病原微生物的抗生素耐药性的迅速发展和蔓延，已经对人类的生命健康造成了巨大威胁。因此，为了解决该问题，我们迫切需求寻找新型的药物。一直以来，植物和微生物都是新型药物的主要来源，从微生物中发现的药物主要来源于陆地细菌，放线菌群。然而自20世纪60年代以来，发掘新型的抗生素和药物种类呈现断崖式下降，并在过去的20年里都没有新型的抗生物家族被引入。导致这一问题的一个重要的原因就是人们重复不断的对同一家族的细菌进行基因组挖掘，因此探索新环境中具有生物活性潜力的微生物为解决这一问题提供了良好的策略并且有可能弥补这20年的“缺口”。

随着人类社会的进步和科技的发展，人们越来越意识到海洋资源的重要性。海洋作为一个尚未得到充分开发的“药物储藏库”引起了人们的注意。假交替单胞菌(Pseudoalteromonas spp)，是海洋环境中一种普遍存在的革兰氏阴性菌。根据基因型和表型的不同可将其分为产色素的和不产色素的假交替单胞菌。通过对产色素的假交替单胞菌进行基因组挖掘，研究发现这一类菌具有强大的次级代谢产物生产的潜力，而这些次级代谢产物就是人类不可或缺的抗生素或新型药物的主要来源。

虽然产色素的假交替单胞菌具有很强次级代谢产物生产的潜力，但想要对该菌进行基因操作却很困难。一是因为这一类菌的基因组中存在多种耐药和药物外排基因，这样就使得即便有抗生素存在的情况下该菌也可生长，这对于工程化改造的筛选过程造成比较大的困难。二是因为该类菌可以产生限制修饰系统，该系统可以降解外源的DNA从而影响转化效率。最后就是由于海洋菌的生长需要高浓度的盐类，这使得电转化基本上无法应用到该类细菌上。而细菌接合转移作为一种遗传操作工具被应用到革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌的改造中，该方法通过供体细胞和受体细胞之间直接接触从而将遗传物质进行交换，对于其它类型的菌株细菌结合的方式比较容易实现，因为大部分的菌株都可以在LB培养基上正常生长，但海洋菌却需要高盐度的培养条件，这种苛刻的条件又会抑制大肠杆菌的生长。同时由于产色素的海洋假交替单胞菌可以产生具有抑菌活性的化学小分子，因此在使用细菌接合转移方法的时候又会抑制大肠杆菌的生长。目前接合转移的方法还没有应用到产色素的假交替单胞菌中。

发明内容

基于以上原因，我们迫切需要解决该问题并开发一种将外源质粒转移到假交替单胞菌中从而实现对该细菌基因编辑的方法。现有的细菌遗传操作方法多以化学转化、电转化为主，但是海洋假交替单胞菌由于它发达的限制修饰系统，使得外源转入的双链DNA很容易被降解掉，导致转化效率极低，甚至失败。另外，当前的细菌接合多用于海洋菌的遗传操作，但由于产色素假交替单胞菌可产生多种具有抗生素功能的化学小分子从而导致接合转移的效率不高。因此，针对以上问题，我们开发了可实现大肠杆菌与产色素假交替单胞菌接合转移的培养基和遗传操作方法。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种产色素假交替单胞菌(Pseudoalteromonas flavipulchra)接合转移用的培养基(APY培养基)，成分包括：19.45g/L NaCl、5.9g/L MgCl

本发明通过开发能使供体、受体菌正常生长的APY培养基实现了穿梭质粒从供体大肠杆菌到受体产色素假交替单胞菌的转移，为环境中分离的产色素假交替单胞菌株进行遗传操作提供了有力的支撑。

进一步地，为了让供体菌和受体菌结合培养时候能够更好的实现遗传物质的传递，申请人优化了可以让两株菌同时生长的培养基APY，人工海水(19.45g/L NaCl、5.9g/LMgCl

本发明还提供了所述培养基在通过接合转移的方法向产色素假交替单胞菌(Pseudoalteromonas flavipulchra)中进行转基因的应用。

本发明还提供了一种提高产色素假交替单胞菌(Pseudoalteromonasflavipulchra)接合转移效率的转基因方法，包括以下步骤：

(1)将目标基因先转入供体菌中获得带有目标基因的供体菌；

(2)将带有目标基因的供体菌与作为受体菌的产色素假交替单胞菌在所述培养基中共培养，得到转入目标基因的产色素假交替单胞菌。

步骤(1)中，目标基因通过穿梭质粒导入到供体菌中。在本发明实施例中，氯霉素抗性通过质粒pWD2-oriT导入到供体菌中。

共培养前，所述供体菌在LB培养基中37℃培养；所述产色素假交替单胞菌在MB培养基中25℃培养；所述供体菌为DAP缺陷型的大肠杆菌E.coli WM3064。

所述LB培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L和氯化钠10g/L；所述MB培养基为Difco

具体的，步骤(2)中，带有氯霉素抗性的供体菌与作为受体菌的产色素假交替单胞菌按照1：1的比例进行混合得到混合菌体，离心清洗后，再共培养。

所述离心清洗的具体步骤为：将1mL的受体菌液在6000×g离心1分钟后，加入含有DAP的LB培养基清洗，离心，去掉上清；再加入1mL的供体菌在6000×g离心1分钟后，加入含有DAP的MB培养基清洗，离心，去掉上清，留20-30μL的液体将两种菌体重悬。

优选的，步骤(2)中共培养的条件为：在20℃下培养24-48h；步骤(2)中，所述培养基还含有孔径为0.2μM的微膜和添加有DAP。

本发明的有益效果：

本发明提供的培养基结合接合转移的方法，包括：(1)获得带有目标基因供体E.coli；(2)供体与受体产色素假交替单胞菌在本发明培养基下混合生长；(3)转化子的筛选。该方法可将含有目的基因的穿梭质粒有效的通过供体菌株转入受体菌株，本发明的培养基能够更好的实现遗传物质的传递，转化效率为5.6×10

附图说明

图1为利用PCR检测转化子中的氯霉素基因；其中，M：1Kb marker；N：阴性对照；P：阳性对照；1-5：为接合转移后的转化子。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明进一步描述，以下实例仅仅为本发明的具体实施案例，但本发明的保护不仅仅局限于此。

案例中所用的水为超滤水。供体菌的液体培养基LB配方(1L)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g和氯化钠10g，固体培养基则另加15g琼脂粉。受体菌的培养基MB为Difco

接合转移效率计算＝转化子个数/受体菌个数×100％。

优化后的培养基APY包括以下成分：人工海水(19.45g/L NaCl、5.9g/L MgCl

实施例1

(1)供体菌的培养

将带有氯霉素(GenBank：MN623123.1)抗性的质粒pWD2-oriT采用电转化的方式导入到大肠杆菌E.coli WM3064中，具体步骤如下：挑取E.coli WM3064的单克隆在液体培养基LB中过夜培养，将过夜的菌液按照1：100倍稀释到新鲜的LB培养基中培养至OD

(2)受体菌的培养

将来自于中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)、保藏编号为MCCC 1A06709的野生型海洋金黄色假交替单胞菌(Pseudoalteromonas flavipulchra)在25℃过夜培养，将过夜菌液(1×10

(3)产色素的假交替单胞菌的接合转移

取OD

(4)接合转移的共培养

将一片0.2μM孔径(MF-Millipore，GSWP02500)微膜放置到APY+DAP的平板上，将重悬后的两种混合菌液滴到该微膜上。随后将该平板放置20℃，培养24小时。之后使用一次性接种环将微膜上的环形菌落取下，并接种到500mL的MB液体培养基中复苏1小时，之后将菌液离心、留下20-30μL的液体将菌液重悬并均匀的涂抹到含有氯霉素的MB平板上。将平板放置25℃，培养24-48小时直至出现肉眼可见的单菌落；

(5)转化子的鉴定

表1检测氯霉素基因PCR反应体系

通过菌落计数统计转化子的个数，并计算接合转移转化效率约为5.6×10

结果如图1电泳条带所示，M为1Kb的marker，N为阴性对照，P为阳性对照，1-5为随机选取的单克隆转化子，通过用引物Cm-F/R进行PCR扩增获得产物大小约500bp，即证明1-5号转化子已经成功获得了氯霉素抗性。

对比例1

将来自于中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)、保藏编号为MCCC 1A06709的野生型海洋金黄色假交替单胞菌(Pseudoalteromonas flavipulchra)分别在浓度为1％和2％的人工海水的APY固体培养基上培养。

结果发现，相同接种量(OD

所以本申请使用3％的人工海水配制APY培养基可实现大肠杆菌与产色素假交替单胞菌接合转移，结合本申请接合转移效率的转基因方法能够更好的实现遗传物质的传递，提高接合转移的效率。