焦虑型抑郁症分类诊断的生物标记物及其应用

技术领域

本发明涉及临床医学精神病学技术领域，更具体地，涉及抑郁症技术领域，特别是指判断焦虑型抑郁症的鉴别与亚型分类辅助诊断检测技术。

背景技术

抑郁症(Major depressive disorder)是一种常见的严重精神疾病，具有高患病率、高复发率、高自杀率和高致残性的特点。

抑郁症被公认为一种异质性极大的疾病，患者间的症状模式、病程轨迹和治疗反应差异极大。具备不同核心症状群的抑郁障的病理机制不尽相同，治疗反应和预后也存在巨大的差异。因此，基于同质化的患者亚组或亚型，有助于减少抑郁症患者间的异质性，有利于结合患者的临床特征来优化治疗方案，进而实现抑郁症的“个体化治疗”，提高抑郁症的诊治水平，有助于患者的预后和社会功能的康复，故对抑郁症患者中具备某一类特征的特定临床亚型的精准识别具有极为重要的临床意义。

在众多的抑郁症临床亚型中，焦虑型抑郁症(anxious depression)被公认为“纯”亚型患者数目占比最多的抑郁亚型，研究显示，成年抑郁症患者中三分之二至四分之三为焦虑型抑郁症患者，我国的一项住院研究报告提示这一数字高达81％。焦虑型抑郁症障碍是指除抑郁症的核心特征之外，还伴随典型的焦虑痛苦特征，主要包括：感到激动或紧张、感到异常的坐立不安、因担心而难以集中注意力、害怕可能发生的极为恐怖的事情、感觉可能失去自我控制等。

焦虑型抑郁症患者病程迁延，自杀风险更高，所需治疗时间更长且临床治愈率更低。另一方面，虽然焦虑型抑郁症障碍患者的抑郁症状更严重，但相比其他亚型的患者，其认知功能更好。然而，焦虑型抑郁症因其症状叠加特性，临床识别比较困难，借助生物学识别将更为精准，

因此，寻找精准识别焦虑型抑郁症的客观生物标志，具有极为重要的临床应用价值。

发明内容

本发明目的是针对现有技术对抑郁症不同亚型识别不足，提供一种对焦虑型抑郁症进行精准筛查与亚型分类诊断的方法：即测量血浆IL-17R蛋白差异表达水平，提供临床诊断的客观指标。

为了实现上述的目的，本发明提供了一种生物标记物在制备抑郁症的筛查或亚型分类诊断的产品中的应用，其主要特点是，所述的生物标记物为IL-17R蛋白。

较佳地，所述的产品为用于筛查焦虑型郁抑症的产品。

较佳地，所述的产品为用于亚型分类诊断焦虑型抑郁症的产品。

本发明还提供了一种检测生物标记物含量的试剂在制备抑郁症的筛查或亚型分类诊断的试剂盒中的应用，其主要特点是，所述的生物标记物为IL-17R蛋白。

本发明还提供了一种试剂盒在抑郁症的筛查或亚型分类诊断方面的应用，其主要特点是，所述的试剂盒用于检测生物标记物含量，所述的生物标记物为IL-17R蛋白。

较佳地，检测样品为血浆。

本发明提供了一种通过检测IL-17R蛋白差异表达水平作为焦虑型抑郁症血浆生物标志的应用方法，本发明方法可用于筛查抑郁症，特别是焦虑型抑郁症，同时，还可以用于非诊断目的焦虑型抑郁症的亚型分类诊断，提高了焦虑型抑郁症筛查的灵敏度和特异性。

附图说明

图1为通过检测血浆IL-17R蛋白水平对焦虑型抑郁症进行亚型分类诊断的整体流程示意图。

图2为血浆IL-17R蛋白差异表达水平用于焦虑型抑郁症的亚型分类诊断，为焦虑型抑郁症患者与健康对照及忧郁型抑郁症(melancholic depression)、非典型抑郁症(atypical depression)患者的IL-17R蛋白表达水平(单位为pg/ml)的比较，中心点为中位数，误差线为均值的95％置信区间。图中“**”代表焦虑型抑郁症组的IL-17R表达水平经双对数转换后(log2)，与其他各组相比，差异具有统计学意义，即采用Bonferroni法校正后P<0.01。

图3为血浆IL-17R蛋白用于鉴别焦虑型抑郁症与健康对照及忧郁型抑郁症、非典型抑郁症的ROC曲线结果，其中，IL-17R蛋白分别用于鉴别焦虑型抑郁症与健康对照(A)及忧郁型抑郁症(B)、非典型抑郁症(C)的ROC曲线结果。横坐标为1-特异性，纵坐标为敏感性，AUC(Area Under Curve)为ROC曲线下与坐标轴围成的面积。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对发明权利要求的限制。

考虑抑郁症作为一种临床异质性极高的疾病，其临床症状、治疗策略、治疗效果及预后，乃至生物学表型都存在极大的异质性的特点，本发明提供了一种通过检测血浆IL-17R蛋白来达到对抑郁症患者数目最多的临床亚型焦虑型抑郁症的亚型分类诊断方法，可用于焦虑型抑郁症与健康对照，以及抑郁症其他临床亚型忧郁型抑郁症、非典型抑郁症的有效分类。为焦虑型抑郁症这一重要抑郁症临床亚型的辅助诊断提供客观标志，应用在常规精神检查确诊为抑郁症的病人中。通过血浆IL-17R蛋白的检测结果，计算其蛋白差异表达水平，得到一个焦虑型抑郁症辅助诊断的参考值，对精神检查为抑郁发作病人进一步确诊与亚型分类，对提高临床医生诊断的准确性提供帮助，避免误诊误治，改善疾病预后。

可以采用蛋白芯片技术检测患者的IL-17R蛋白，一方面，可有效区分焦虑型抑郁症患者与健康对照人群，以及抑郁症其他临床亚型患者，包括忧郁型抑郁症和非典型抑郁症，从而作为焦虑型抑郁症精准筛查与辅助诊断的客观指标；另一方面，还可对精神检查为抑郁症的病人进一步确诊和亚型分类，避免出现假阳性。

因此，通过血浆IL-17R蛋白差异表达水平的检测得到一个焦虑型抑郁症亚型的诊断提示，可直接提供给临床医生参考，使其在较短时间内，确定精准的治疗方案，从而缩短诊疗时间，提高了工作效率和诊疗方案的准确性。

在本发明中，所述生物标记物为IL-17R，适用于对焦虑型抑郁症的分类诊断。

本发明中，“抑郁症”、“抑郁症状”、“抑郁发作”等术语及其含义，如下所示：

抑郁症(Major depressive disorder)是一类以情绪或心境低落为主要表现的疾病总称，伴有不同程度的认知和行为改变，可伴有精神病性症状，如幻觉、妄想等，存在高患病率、高复发率、高自杀率和高致残性的特点，目前，临床上主要采用国际疾病分类第10版(ICD-10)、《精神疾病诊断与统计手册》第5版(DSM-5)等分类诊断系统对抑郁症进行诊断。

抑郁发作(major depressive episode)是以抑郁为特征的疾病状态，以情绪低落、兴趣减退、快感缺失为核心特点，还常常伴有其他认知、躯体以及行为学表现，如注意力不集中、反应迟钝、睡眠障碍、行为活动减少以及疲乏感等。单次抑郁发作至少持续2周，常会反复发作，每次发作大多数可以缓解，部分可有残留症状或转为慢性，可造成严重的社会功能损害。

抑郁症状(depressive symptoms)是指抑郁发作时患者的临床表现，主要可分为核心症状群、心理症状群与躯体症状群。其中，核心症状群包括情绪低落、兴趣减退和快感缺失；心理症状群包括焦虑、思维迟缓、认知症状、自罪自责、自杀未遂和行为、精神运动迟滞或激越、精神病性症状、自知力等；躯体症状群包括睡眠障碍、饮食及体重障碍、精力丧失、抑郁情绪昼重夜轻、性功能障碍、其他非特异性躯体症状等。

在本发明中，所述的IL-17R为人源蛋白，其基本信息及其功能如下：

白介素17受体A(Interleukin-17receptor A，IL-17RA)，也称为IL-17R。人IL-17R(IL-17RA)蛋白是活化的T淋巴细胞分泌的促炎细胞因子，它是CD34阳性造血前体成熟为中性粒细胞的有效诱导剂。IL-17R是一种普遍存在的I型膜糖蛋白，IL-17R及其受体在许多炎症和自身免疫性疾病如类风湿性关节炎中发挥致病作用。像其他细胞因子受体一样，IL-17R可能具有多聚体结构，它选择性剪接导致编码不同亚型的多个转录变体，主要存在于血液、脑中。

本发明所用的术语“ROC曲线”(receiver operator characteristic curve)，工作特征曲线，是指展示二元分类系统的性能随着其辨别阈值变化的图形曲线，是基于在不同阈值设置的条件下绘制真阳性率对假阳性率的曲线来创建该曲线。此处，真阳性率被称为灵敏度；假阳性率则计为1-特异性。因此，ROC曲线是基于一系列截断值范围内的真阳性率(灵敏度)对假阳性率(1-特异性)的图形显示、进而选择最佳截断值的临床使用方式，其准确度表示为ROC曲线下面积(AUC)，从而为比较测试性能提供了切实可行的参数。在ROC曲线中，AUC值越接近1，表示该测试高度灵敏且具有高度特异性，而AUC值接近0.5，则表明该测试既不灵敏也不具有特异性。

当涉及测试样品与对照样品或参考样品之间的差异时，术语“统计学差异”或“统计学意义”涉及在使用适当的统计分析方法时，各组相同的概率小于5％(例如P<0.05)的情况，即在完全随机基础上获得相同结果的概率在100次尝试中少于5次。同理，若各组相同的概率小于1‰(例如P<0.001)的情况，即在完全随机基础上获得相同结果的概率在1000次尝试中少于1次。本发明中，我们选择了适当的统计分析方法，例如，根据研究变量是否为正态分布(采用Kolmogorov-Smirnov检验)，选择使用参数模型检验如t检验或ANOVA检验(正态分布)，或非参数模型如MannWhitney U检验或Kruskal-Wallis检验(非正态分布)。同时，对于IL-17R蛋白芯片检测数据还进行了双对数转换(log2转换)，使得经由log2转换后的IL-17R蛋白检测数据符合正态分布(由Kolmogorov-Smirnov检验确定)。

下面结合附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行实验操作。

实施例

S1临床医生首先纳入符合ICD-10/DSM-5中的抑郁症诊断标准，目前处于抑郁发作阶段的首发或复发的急性期患者，并纳入健康对照，进行精神评估及临床评估，请参阅图1所示。

本实施例中，共纳入120例研究对象，其中，健康对照人群、忧郁型抑郁症、非典型抑郁症及焦虑型抑郁症患者各30例。

本实施例中，健康对照人群及抑郁症及其三种不同临床亚型(忧郁型抑郁症、非典型抑郁症及焦虑型抑郁症)患者的纳入及排除标准分别为：

健康对照

入组标准：

(1)年龄18-55岁；

(2)无精神疾病及精神疾病家族史；

(3)HAMD-17量表总分≤5分；

(4)无神经系统变性类疾病、脑外伤或脑血管病史；

(5)无物质滥用或物质成瘾；

(6)无不稳定性心绞痛，心肌梗塞，充血性心衰，严重肝硬化，急慢性肾功能衰竭，严重糖尿病，再生障碍性贫血，癫痫，等严重心、肝、肾、内分泌、血液系统等躯体疾病或可能干扰试验评估的疾病(实验室异常指标高于正常值2倍以上)；

(7)自愿参与研究，并签署知情同意书。

排除标准：

(1)排除有精神疾病、严重躯体疾病及脑血管疾病或脑外伤史；

(2)排除曾出现严重过敏反应或曾患有免疫系统疾病者；

(3)1个月内使用过抗炎药物或者免疫抑制剂；

(4)发生脑外伤，或伴有严重躯体疾病患者；

(5)怀孕、哺乳期妇女或计划妊娠者。

抑郁症患者

入组标准：

(1)符合ICD-10/DSM-5中的抑郁发作诊断标准，目前处于抑郁发作阶段的首发或复发的急性期患者；

(2)年龄18-55岁；

(3)17项汉密尔顿抑郁量表(HAMD-17)评分总分≥17分；

(4)入组前半年内未服用过任何抗抑郁药物，未接受过任何物理治疗及心理治疗；

(5)具有一定的文化程度，能理解研究相关内容；

(6)自愿参加本研究，并签署书面知情同意书。

排除标准：

(1)其他器质性疾病引起的继发性抑郁症；

(2)药物引起的继发性抑郁症；

(3)酒精或其他物质滥用及依赖；

(4)怀孕、哺乳期妇女或计划妊娠者；

(5)严重自杀企图(HAMD-17第3项“自杀”评分≥3分，或本次抑郁发作期间有自杀行为)；

(6)共病其他精神障碍；

(7)伴有严重躯体疾病患者。

其中，抑郁症患者的三个临床亚型(忧郁型抑郁症、非典型抑郁症和焦虑型抑郁症)主要根据30项抑郁症状自评量表(IDS-30)和HAMD-17量表进行临床亚型分类判定，具体如下所示：

(1)忧郁型抑郁症

主要通过IDS-30中相关条目的得分来进行判定，要求同时满足：

①IDS-30第9项(情绪变化)或第21项(愉快或享乐的能力(性活动除外))中，至少有1项得分≥2分

②以下5项特征中至少存在3项：极度绝望或忧郁，或情绪空虚、极其明显的抑郁情绪；抑郁症状早晨更严重；易怒；精神运动激越或迟缓；严重厌食或体重减轻。

(2)非典型抑郁症

主要通过IDS-30中的相关条目来进行判定，要求同时满足：

①IDS-30的第21项≥2分；

②食欲增加或体重显著增加；

③人际关系敏感；

④铅性麻痹(沉重，或手臂或腿部感觉沉重)。

(3)焦虑型抑郁症

焦虑型抑郁的判定主要依据HAMD-17量表相关条目，要求同时满足：

①HAMD-17量表的焦虑/躯体因子分(包括第10、11、12、13、15和第17项)≥7分；

②以下5项中至少存在2项：感到紧张或不安；感到异常不安；由于担心而难以集中注意力；害怕可怕的事情发生；以及害怕失去对自己的控制。

S2采集血浆样本，并采用蛋白芯片技术测量患者血浆IL-17R蛋白水平。

在本实施例中，使用定量蛋白芯片试剂盒对血浆样本的IL-17R蛋白表达水平进行检测。

该试剂盒包含以下物品：定量蛋白玻璃芯片(QAH-CUSTOM)、样品稀释液、20×洗液I、20×洗液II、标准品混合物、IL-17R蛋白的免疫球蛋白G抗体、Cy3-链霉亲和素、玻片清洗和干燥器、密封条等。

具体检测实施方法如下所述：

(1)干燥定量蛋白芯片：

取出定量蛋白芯片，在室温下平衡20-30分钟后，将芯片置于真空干燥器干燥中1-2小时，即可完全干燥蛋白芯片。

(2)配置标准品：

①添加500μL的样品稀释液到细胞因子标准混合物的小管中，重新溶解标准品。打开小管前，先快速的离心，轻轻的上下吹打溶解粉末，标记这个小管为Std 1。

②分别标记6个干净的离心管为Std2、Std3到Std7，添加200μL的样品稀释液到每个小管中。

③抽取100μL的Std 1加入到Std2中轻轻混合，然后从Std 2中抽取100μL加入到Std 3中，如此梯度稀释至Std7，从而得到标准液。

(3)抽取100μL的样品稀释液到另一个新的离心管中，标记为CT，作为阴性对照。

(4)取出完全干燥的玻片芯片，往每个孔中加100μL的样品稀释液，于室温条件下载摇床上孵育1小时，封闭定量抗体芯片。继而采用缓冲液洗涤。

(5)吸去每个孔中的缓冲液，添加60μL的标准液和样品(样品2倍稀释上样)到孔中，4℃过夜孵育。

(6)使用芯片洗板机清洗玻片。在本申请中使用Thermo Scientific Well WashVersa芯片洗板机来进行玻片清洗，主要分为两步，首先用1×洗液I进行清洗，每孔250μL的1×洗液I，清洗10次，每次震荡10s，震荡强度选择高，用去离子水稀释20×洗液I。然后换用1×洗液II通道进行清洗，每孔250μL的1×洗液II，清洗6次，每次震荡10s，震荡强度选择高，用去离子水稀释20×洗液II。

(7)孵育抗体混合物

离心装有IL-17R抗体的混合物eppendorf管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心，继而添加80μL的IL-17R抗体到每个孔中，室温下于摇床上孵育2小时。

(8)再次清洗，步骤同(6)。

(9)孵育Cy3-链霉亲和素

离心Cy3-链霉亲和素eppendorf管，继而加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μL的Cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住定量蛋白芯片避光孵育，室温摇床上孵育1个小时。

(10)再次清洗，步骤同(6)。

(11)将芯片放在洗干仪中，采用1000rpm转速离心并进行充分干燥。

(12)对干燥后的玻璃芯片进行荧光检测。在本实施例中，采用InnoScan300Microarray Scanner荧光扫描仪来扫描仪扫描信号，扫描参数为：WaveLengh：532nm；Resolution：10μm。采用Cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm)，使用Mapix软件捕获信号值。

S3采用QAH-CUST的数据分析软件来进行数据分析，以获取血浆样本中IL-17R蛋白表达水平。具体如下：

首先对蛋白芯片实验原始检测数据做归一化处理，即芯片扫描得到的原始数据经芯片背景去除、将标准品的数据取平均值，做归一化处理。因原始测量数据呈偏态分布，故对原始测量数据做双对数转换(log2)后即呈正态分布，再用于后续统计分析。此外，还对数据的离散程度进行分析，对于偏离均值±2标准误差(SD)之外的数据，不计入数据统计。本实施例中，健康对照人群及忧郁型抑郁症、非典型抑郁症、焦虑型抑郁症组的离散数据(均值±2SD)个数分别为3例、1例、2例、1例，IL-17R原始测量值及离散值具体如下表1所示。

表1血浆IL-17R蛋白的原始测量值及经双对数转换后的数值

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注：斜体显示的为离群值，即测量值在均值±2SD之外，视为离群值。

S4本发明的统计结果如图2所示，焦虑型抑郁症组与健康对照以及非典型抑郁症、忧郁型抑郁症组的“**”表示IL-17R蛋白表达水平的统计学差异P<0.01。因此，焦虑型抑郁症组中血浆IL-17R蛋白水平显著升高，且与健康对照及抑郁症其他两种患者数目较多的临床亚型(非典型抑郁症、忧郁型抑郁症)患者组之间的差异具有统计学意义。

此外，更进一步对数据进行分析，ROC曲线的结果如图3所示，焦虑型抑郁症患者的IL-17R蛋白相较于健康对照及忧郁型抑郁症、非典型抑郁症患者的AUC值分别为0.829、0.749和0.773，说明IL-17R均可作为焦虑型抑郁症的客观生物标志，具备极其优异的亚型分类诊断效能。

通过本发明中对IL-17R蛋白水平检测可精准诊断焦虑型抑郁症患者，避免因误诊漏诊而影响治疗方案的准确性和针对性，提高了工作效率。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。