牡蛎壳固定化益生菌生物填料的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种牡蛎壳固定化益生菌生物填料的制备方法，属于环境工程领域。

背景技术

水产养殖的氮和磷排放量占陆源排放量的相当比例，有研究表明，我国海水池塘养殖的氮排放量达45万t，而我国每年城镇生活污水排放氨氮总量为90多万吨(董双林,高效低碳-中国水产养殖业发展的必由之路.水产学报,2011,(10):1595-1600)。养殖水体恶化给水产养殖业造成了严重损失，生物修复法中的微生物法因其成本低、污染小、修复效果好并且适用范围广等优点成为目前研究较多生物修复技术。但是游离的微生物易受水环境因子的影响，作用效果不稳定，甚至会产生毒性更强的产物。嵌入式固定化技术是现代生物工程领域一种新兴的微生物固定化技术。有研究表明，利用嵌入式固定化技术固定氨氧化污泥可以有效地防止厌氧氨氧化菌的流失，并且保持生物反应器中的生物量(Zhang,D.,Y.Zhang,F.Shen,et al.,Removal of cadmium and lead from heavy metals loadedPVA–SA immobilized Lentinus edodes.Desalination and Water Treatment,2014.52(25-27):4792-4801)。如何将这项技术应用于养殖水体修复中具有重要意义。

中国沿海地区广泛养殖牡蛎，但是食用牡蛎后形成的大量牡蛎壳随意堆放，大量有机物在堆放过程中会产生大量的难闻气体，已经成为严重的环境问题。2020年我国海水养殖牡蛎的产量达542.46万吨(农业农村部渔业渔政管理局,2021年渔业统计年鉴.2021:中国农业出版社)。牡蛎壳占牡蛎质量的70％，每年沿海地区的牡蛎壳高达数百万吨，大部分作为废弃物直接丢弃，造成严重的环境污染和资源浪费。牡蛎壳作为一种，经改良后可成为一种比表面积增加数倍的多孔材料。天然材料牡蛎壳的主要成分为CaCO

因此，将废弃的牡蛎壳改良后用于固定脱氮益生菌制备生物填料用于养殖水体修复，既可以实现牡蛎壳的资源化再利用，又可以提高生物滤器的水处理性能。

发明内容

为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种牡蛎壳固定化益生菌生物填料的制备方法，本发明的技术方案是：

一种牡蛎壳固定化益生菌生物填料的制备方法，包括以下步骤：

S1、对牡蛎壳优化处理，制成改性牡蛎壳粉；

S2、对步骤S1中制备的改性牡蛎壳粉固定化微生物的能力进行测试并制备填料原料；

S3、通过改性牡蛎壳粉完成生物填料的制备。

所述的步骤S1具体为：

1-1、用清水将牡蛎壳表面的泥沙附着物以及牡蛎肉渣清洗干净，然后置于烘箱干燥后在105℃下烘干2小时，经粉碎机过50-100目后形成牡蛎壳粉，存放在干燥器内备用；

1-2、将牡蛎壳粉置于马弗炉中在400℃下煅烧2h，制成改性牡蛎壳粉，制成标记为OS

所述的步骤S2具体为：

2-1、将在30℃，200rpm/min条件下培养16h的成都假单胞菌BF6菌液，在5000rpm的转速下离心10min，通过灭菌生理盐水冲洗2-3遍后，用灭菌生理盐水重悬，配置成100-120mL OD

2-2、分别于第1h、6h、24h和72h取1mL的A组混合液、B组混合液和C组菌悬液，然后在300rpm离心5min，用全波长酶标仪在OD600下测定上清菌液浓度，制作吸附动力学曲线，计算不同牡蛎壳粉对益生菌的吸附能力，对成都假单胞菌BF6菌液的固定数量计算方法如下：

OD＝C-T，其中，C为空白对照组OD值，T为实验组OD值；

2-3、第72h后，分别将A组混合液、B组混合液和C组菌悬液在5000rpm下离心10min，弃上清；所得A组混合液、B组混合液和C组菌悬液沉淀分别用灭菌磷酸盐缓冲液漂洗后，弃PBS加入2.5％戊二醛，在4℃下固定2h形成A组样品、B组样品和C组样品；固定好的A组样品、B组样品和C组样品，经pH7.4的0.1M磷酸缓冲液漂洗3次，每次15min；再分别经30％、50％、70％、85％、90％、95％乙醇各脱水1次，经100％乙醇脱水次，每次15min，分别形成A组样品原料、B组样品原料和C组样品原料，使用扫描电子显微镜观察并分析其微观形态。

所述的步骤S3具体为：

3-1、使用电子万用电炉熔化聚丁二酸丁二醇酯，将聚丁二酸丁二醇酯分别与A组样品原料、B组样品原料和C组样品原料按照1:1的比例混合，分别制作成片状的OS生物填料、OS

3-2、将在30℃，200rpm/min的条件下培养16h的成都假单胞菌BF6和恶臭假单胞菌DS2，分别经5000rpm离心10min，灭菌生理盐水冲洗2-3遍后，用灭菌生理盐水重悬，分别配置成3000-3500mL OD

3-3、取500g灭菌的OS生物填料加入300ml OD

一种牡蛎壳固定化益生菌生物填料，通过牡蛎壳固定化益生菌生物填料的制备方法制备而成。

一种牡蛎壳固定化益生菌生物填料在养殖水体处理中的应用。本发明的优点是：与生产中用的PE填料相比，经400℃和600℃高温处理后的牡蛎壳固定化益生菌生物填料在生物滤器中运行18d后，其表面微生物的群落多样性增加，并且所固定的微生物在生物膜中的相对丰度提高。表明经400℃和600℃高温处理的牡蛎适宜用于微生物的固定化材料，牡蛎壳固定化益生菌生物填料可以提高所固定微生物在属水平的相对丰度，对养殖水体具有高效的净化作用，可以应用于改善养殖水体环境。

附图说明

图1为本发明的热处理前后牡蛎壳微观结构；

图2为本发明的不同处理牡蛎壳对微生物的固定化能力；

图3为本发明的不同处理牡蛎壳固定微生物的微观结构；

图4为本发明的不同生物填料在生物滤器中NH

图5为本发明的不同生物填料在生物滤器中NO

图6为本发明的不同生物填料在生物滤器中NO

图7为本发明的不同生物填料在生物滤器中TN处理效果；

图8为本发明的为不同生物填料在生物滤器中运行18d后表面生物膜的微生物群落的多样性；

图9为本发明的为不同生物填料在生物滤器中运行18d后表面生物膜的微生物相对丰度。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：发明涉及一种牡蛎壳固定化益生菌生物填料的制备方法，包括以下步骤：

S1、对牡蛎壳优化处理，制成改性牡蛎壳粉；

S2、对步骤S1中制备的改性牡蛎壳粉固定化微生物的能力进行测试并制备填料原料；

S3、通过改性牡蛎壳粉完成生物填料的制备。

所述的步骤S1具体为：

1-1、用清水将牡蛎壳表面的泥沙附着物以及牡蛎肉渣清洗干净，然后置于烘箱干燥后在105℃下烘干2小时，经粉碎机过50目后形成牡蛎壳粉，存放在干燥器内备用；

1-2、将牡蛎壳粉置于马弗炉中在400℃下煅烧2h，制成改性牡蛎壳粉，制成标记为OS

所述的步骤S2具体为：

2-1、将在30℃，200rpm/min条件下培养16h的成都假单胞菌BF6菌液，在5000rpm的转速下离心10min，通过灭菌生理盐水冲洗2遍后，用灭菌生理盐水重悬，配置成100mL OD

2-2、分别于第1h、6h、24h和72h取1mL的A组混合液、B组混合液和C组菌悬液，然后在300rpm离心5min，用全波长酶标仪在OD600下测定上清菌液浓度，制作吸附动力学曲线，计算不同牡蛎壳粉对益生菌的吸附能力，对成都假单胞菌BF6菌液的固定数量计算方法如下：

OD＝C-T，其中，C为空白对照组OD值，T为实验组OD值；

2-3、第72h后，分别将A组混合液、B组混合液和C组菌悬液在5000rpm下离心10min，弃上清；所得A组混合液、B组混合液和C组菌悬液沉淀分别用灭菌磷酸盐缓冲液漂洗后，弃PBS加入2.5％戊二醛，在4℃下固定2h形成A组样品、B组样品和C组样品；固定好的A组样品、B组样品和C组样品，经pH7.4的0.1M磷酸缓冲液漂洗3次，每次15min；再分别经30％、50％、70％、85％、90％、95％乙醇各脱水1次，经100％乙醇脱水次，每次15min，分别形成A组样品原料、B组样品原料和C组样品原料，使用扫描电子显微镜观察并分析其微观形态。

所述的步骤S3具体为：

3-1、使用电子万用电炉熔化聚丁二酸丁二醇酯，将聚丁二酸丁二醇酯分别与A组样品原料、B组样品原料和C组样品原料按照1:1的比例混合，分别制作成片状的OS生物填料、OS

3-2、将在30℃，200rpm/min的条件下培养16h的成都假单胞菌BF6和恶臭假单胞菌DS2，分别经5000rpm离心10min，灭菌生理盐水冲洗2-3遍后，用灭菌生理盐水重悬，分别配置成3000mL OD

3-3、取500g灭菌的OS生物填料加入300ml OD

本发明还涉及一种牡蛎壳固定化益生菌生物填料，通过牡蛎壳固定化益生菌生物填料的制备方法制备而成。

本发明还涉及一种牡蛎壳固定化益生菌生物填料在养殖水体处理中的应用。

实施例2：一种牡蛎壳固定化益生菌生物填料的制备方法，包括以下步骤：

S1、对牡蛎壳优化处理，制成改性牡蛎壳粉；

S2、对步骤S1中制备的改性牡蛎壳粉固定化微生物的能力进行测试并制备填料原料；

S3、通过改性牡蛎壳粉完成生物填料的制备。

所述的步骤S1具体为：

1-1、用清水将牡蛎壳表面的泥沙附着物以及牡蛎肉渣清洗干净，然后置于烘箱干燥后在105℃下烘干2小时，经粉碎机过80目后形成牡蛎壳粉，存放在干燥器内备用；

1-2、将牡蛎壳粉置于马弗炉中在400℃下煅烧2h，制成改性牡蛎壳粉，制成标记为OS

所述的步骤S2具体为：

2-1、将在30℃，200rpm/min条件下培养16h的成都假单胞菌BF6菌液，在5000rpm的转速下离心10min，通过灭菌生理盐水冲洗3遍后，用灭菌生理盐水重悬，配置成110mL OD

2-2、分别于第1h、6h、24h和72h取1mL的A组混合液、B组混合液和C组菌悬液，然后在300rpm离心5min，用全波长酶标仪在OD600下测定上清菌液浓度，制作吸附动力学曲线，计算不同牡蛎壳粉对益生菌的吸附能力，对成都假单胞菌BF6菌液的固定数量计算方法如下：

OD＝C-T，其中，C为空白对照组OD值，T为实验组OD值；

2-3、第72h后，分别将A组混合液、B组混合液和C组菌悬液在5000rpm下离心10min，弃上清；所得A组混合液、B组混合液和C组菌悬液沉淀分别用灭菌磷酸盐缓冲液漂洗后，弃PBS加入2.5％戊二醛，在4℃下固定2h形成A组样品、B组样品和C组样品；固定好的A组样品、B组样品和C组样品，经pH7.4的0.1M磷酸缓冲液漂洗3次，每次15min；再分别经30％、50％、70％、85％、90％、95％乙醇各脱水1次，经100％乙醇脱水次，每次15min，分别形成A组样品原料、B组样品原料和C组样品原料，使用扫描电子显微镜观察并分析其微观形态。

所述的步骤S3具体为：

3-1、使用电子万用电炉熔化聚丁二酸丁二醇酯，将聚丁二酸丁二醇酯分别与A组样品原料、B组样品原料和C组样品原料按照1:1的比例混合，分别制作成片状的OS生物填料、OS

3-2、将在30℃，200rpm/min的条件下培养16h的成都假单胞菌BF6和恶臭假单胞菌DS2，分别经5000rpm离心10min，灭菌生理盐水冲洗2-3遍后，用灭菌生理盐水重悬，分别配置成3200mL OD

3-3、取500g灭菌的OS生物填料加入300ml OD

实施例3：一种牡蛎壳固定化益生菌生物填料的制备方法，包括以下步骤：

S1、对牡蛎壳优化处理，制成改性牡蛎壳粉；

S2、对步骤S1中制备的改性牡蛎壳粉固定化微生物的能力进行测试并制备填料原料；

S3、通过改性牡蛎壳粉完成生物填料的制备。

所述的步骤S1具体为：

1-1、用清水将牡蛎壳表面的泥沙附着物以及牡蛎肉渣清洗干净，然后置于烘箱干燥后在105℃下烘干2小时，经粉碎机过100目后形成牡蛎壳粉，存放在干燥器内备用；

1-2、将牡蛎壳粉置于马弗炉中在400℃下煅烧2h，制成改性牡蛎壳粉，制成标记为OS

所述的步骤S2具体为：

2-1、将在30℃，200rpm/min条件下培养16h的成都假单胞菌BF6菌液，在5000rpm的转速下离心10min，通过灭菌生理盐水冲洗2遍后，用灭菌生理盐水重悬，配置成120mL OD

2-2、分别于第1h、6h、24h和72h取1mL的A组混合液、B组混合液和C组菌悬液，然后在300rpm离心5min，用全波长酶标仪在OD600下测定上清菌液浓度，制作吸附动力学曲线，计算不同牡蛎壳粉对益生菌的吸附能力，对成都假单胞菌BF6菌液的固定数量计算方法如下：

OD＝C-T，其中，C为空白对照组OD值，T为实验组OD值；

2-3、第72h后，分别将A组混合液、B组混合液和C组菌悬液在5000rpm下离心10min，弃上清；所得A组混合液、B组混合液和C组菌悬液沉淀分别用灭菌磷酸盐缓冲液漂洗后，弃PBS加入2.5％戊二醛，在4℃下固定2h形成A组样品、B组样品和C组样品；固定好的A组样品、B组样品和C组样品，经pH7.4的0.1M磷酸缓冲液漂洗3次，每次15min；再分别经30％、50％、70％、85％、90％、95％乙醇各脱水1次，经100％乙醇脱水次，每次15min，分别形成A组样品原料、B组样品原料和C组样品原料，使用扫描电子显微镜观察并分析其微观形态。

所述的步骤S3具体为：

3-1、使用电子万用电炉熔化聚丁二酸丁二醇酯，将聚丁二酸丁二醇酯分别与A组样品原料、B组样品原料和C组样品原料按照1:1的比例混合，分别制作成片状的OS生物填料、OS

3-2、将在30℃，200rpm/min的条件下培养16h的成都假单胞菌BF6和恶臭假单胞菌DS2，分别经5000rpm离心10min，灭菌生理盐水冲洗2-3遍后，用灭菌生理盐水重悬，分别配置成3500mL OD

3-3、取500g灭菌的OS生物填料加入300ml OD

表1不同处理牡蛎壳结构参数

通过表1可以看出，随着热处理温度的增加牡蛎壳比表面积增加，微孔率提高。

参考图1至图9,从图1(A)的扫面电镜可以看出牡蛎壳的微观结构呈现片层状，片层多平行排列，比较规则，但是孔隙较少。经400℃高温煅烧后，牡蛎壳的片层状结构进一步减少，取而代之的是不规则碎片和孔隙，孔隙的孔径多样化、数量明显增加并且连通性很好[图1(B)]。经600℃煅烧的牡蛎壳呈现出与其他组完全不同的表面微观结构，在其他各组牡蛎壳中观察到的片层状结构在600℃煅烧组几乎观察不到，该组牡蛎壳主要呈现出粒状的晶体，晶粒表面光滑、晶体之间形成很多圆形的孔隙，孔隙之间相互连通[图1(C)]。

如图2所示，在吸附固定1h和6h后，OS对成都假单胞菌BF6的固定化效率最高，分别达到0.15和0.19OD；在吸附固定24h后，OS

从图3中可以看出，经过72h后，成都假单胞菌BF6嵌入或者附着在牡蛎壳的表面。此外，由于菌液中含有水，经过高温煅烧后，牡蛎壳遇水后结构发生了改变，特别是经400℃温度处理的牡蛎壳，其结构由片层状变为了花瓣状并且成簇排列；经600℃温度处理的牡蛎壳晶粒表面变粗糙。

本发明牡蛎壳固定化益生菌填料在生物滤器中的运行效果：

1.实验方法

(1)分别将市售环形填料PE以及OS-P、OS

(2)使用人工配合污水(KNO

(3)每3d从每个系统中采集水样50ml，使用北京连华永兴科技发展有限公司的多参数水质测定仪[5B-3B(V8)]和总氮测定仪(LH-3BN)测定水体中氨氮(NH

去除率(％)＝(C

其中，C

(4)实验结束时，从各个生物滤器中取一块生物填料置于灭菌离心管中，采用环境样本DNA纯化试剂盒(ZYMO Research)和TIANamp Soil DNA Kit(天根生化科技有限公司)提取样本总DNA，建库使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit，测序使用罗宁生物的Hiseq2500平台PE250模式。

如图4所示，图4为市售的PE环形填料以及不同温度处理的牡蛎壳固定化益生菌生物填料在生物滤器中运行18d的NH

如图5所示，图5为市售的PE环形填料以及不同温度处理的牡蛎壳固定化益生菌生物填料在生物滤器中运行18d的NO

图6为市售的PE环形填料以及不同温度处理的牡蛎壳固定化益生菌生物填料在生物滤器中运行18d的NO

图7为市售的PE环形填料以及不同温度处理的牡蛎壳固定化益生菌生物填料在生物滤器中运行18d的TN处理效果。从图中可以看出，在生物滤器运行的第3d，各组对TN的去除率均没有显著差异(P>0.05)，但是，OS

上述结果表明，OS

图8为不同生物填料在生物滤器中运行18d后表面生物膜的微生物群落的多样性。

从图8中可以看出，环形PE表面生物膜的微生物群落的多样性最低。不同处理牡蛎壳生物填料组之间表面生物膜的微生物群落的多样性没有显著差异(P>0.05)，但是OS-P组生物膜的微生物群落的多样性最高，其次依次为OS

图9为不同生物填料在生物滤器中运行18d后表面生物膜的微生物相对丰度。

不同生物填料表面微生物在属分类层面的分布规律如图9所示。从图中可以看出，环形PE填料及不同处理牡蛎壳填料表面微生物丰富度属类差异较大，其中，PE组按照相对丰富度排列前5的为罗尔斯通菌属(Ralstonia)、慢生根瘤均属(Bradyrhizobium)、Fluvicola、黄杆菌属(Flavobacterium)和假单胞菌属(Pseudomonas)；OS-P组相对丰富度排列前5的微生物为假单胞菌属(Pseudomonas)、罗尔斯通菌属(Ralstonia)、地杆菌属(Pedobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)和Fluvicola；OS

不同生物填料在生物滤器中运行18d后表面生物膜的微生物群落在属水平与水质指标之间存在相关性。NO

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。