一种细胞运输的方法

技术领域

本发明涉及一种生物技术，具体涉及一种细胞运输的方法。

背景技术

细胞治疗作为一种安全有效的治疗手段，已广泛应用于免疫性疾病、癌症、遗传疾病等临床研究，其涉及细胞采集、培养扩增、基因修饰、细胞回输/移植治疗等环节。由于各环节实施地点或时间并不一致，往往要求治疗中所使用的细胞在不同地点之间按时运输。细胞运输问题的高效解决成为细胞治疗成败的关键因素之一。

目前细胞运输方法主要有冷冻储存运输和充液常温运输两种。其中，冷冻储存运输是将细胞冷冻后置于装有液氮或干冰的特殊容器内进行的，保存效果较好，但是程序繁杂，不适合长时间运输，一般采用空运，成本较高；充液常温运输是将细胞培养液充满细胞贴壁的培养瓶进行的，简单实用，但运输中容易发生培养液涌动，导致细胞剥落，严重影响细胞活性。

因此，急需一种成本低、简便易行、运输过程中基本不影响细胞活性的细胞运输方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种成本低、简便易行、运输过程中基本不影响细胞活性的细胞运输的方法。

本发明一种细胞运输的方法，其中，依次包括如下步骤：

(1)将生物材料水溶液从4℃冰箱取出，吸取适量生物材料水溶液与细胞均匀混合；

(2)将步骤(1)中细胞/材料混合物置于37℃条件中形成包裹细胞的水凝胶结构；

(3)将步骤(2)中水凝胶结构置于细胞培养液中进行运输；

(4)将步骤(3)中运输后的水凝胶结构置于4℃条件中去除材料，离心分离细胞。

一种细胞运输的方法，其中，依次包括如下步骤：

(1)将生物材料水溶液从4℃冰箱取出，吸取适量生物材料水溶液与细胞均匀混合；

(2)将步骤(1)中细胞/材料混合物置于37℃条件中形成包裹细胞的水凝胶结构；

(3)将步骤(2)中水凝胶结构置于细胞培养液中在细胞培养箱进行三维细胞培养；

(4)将步骤(3)中培养后的水凝胶结构置于细胞培养液中进行运输；

(5)将步骤(4)中运输后的水凝胶结构置于4℃条件中去除材料，离心分离细胞。

本发明一种细胞运输的方法，其中，各方法中生物材料包括泊洛沙姆、胶原、肽类材料、壳聚糖及其衍生物、淀粉类材料、血清白蛋白、鲱精蛋白、聚赖氨酸、卡波姆、聚甲基丙烯酸、聚N-异丙基丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、丙烯酸、明胶及其衍生物、透明质酸、结冷胶、聚乙烯醇、纤维蛋白原、角蛋白、纤连蛋白、还原角蛋白、纤维素类材料、海藻酸盐及其衍生物、木聚糖中的至少一种。

本发明一种细胞运输的方法，其中，各方法中生物材料的浓度范围为0.001–20wt.％。

本发明一种细胞运输的方法，其中，各方法步骤(1)中细胞在生物材料水溶液中的密度范围为1×10

本发明一种细胞运输的方法，其中，方法中三维细胞培养的时间范围为3–30天。

本发明一种细胞运输的方法，其中，各方法中细胞运输过程中温度控制范围为4-37℃。

本发明一种细胞运输的方法，其中，各方法中细胞活率为大于等于70％但小于等于100％；优选地，各方法中细胞活率为大于等于80％但小于等于95％。

本发明一种细胞运输的方法，其中，各方法中细胞运输后可以不用去除材料，直接使用含有细胞的水凝胶结构。

与现有技术相比，本发明一种细胞运输的方法，在温和条件下采用生物材料包裹细胞形成三维水凝胶结构，通过细胞培养液浸没水凝胶进行运输，运输后可以经过温和的方式去除生物材料实现细胞分离，该方法简便易行，成本低，运输过程基本不影响细胞活性。

附图说明

图1为实施例1中水凝胶结构中细胞在运输前后的活/死细胞染色情况效果图(图1A是运输前样品，图1B是运输后样品)；

图2为实施例2中水凝胶结构中细胞在运输前后的活/死细胞染色情况效果图(图2A是运输前样品，图2B是运输后样品)。

具体实施方式

实施例1

本实施例一种细胞运输的方法，其中，依次包括如下步骤：

(1)将含有1％泊洛沙姆和1％胶原的生物材料水溶液从4℃冰箱取出，吸取1mL生物材料水溶液与小鼠主动脉血管平滑肌细胞均匀混合，细胞密度为1×10

(2)将步骤(1)中细胞/材料混合物置于37℃条件中形成包裹细胞的水凝胶结构；

(3)将步骤(2)中水凝胶结构置于含10％胎牛血清的DMEM-高糖细胞培养基中进行常温运输；

(4)将步骤(3)中运输5天后的水凝胶结构置于4℃条件中去除材料，离心分离细胞，细胞活率为90％。

在细胞运输前后，使用AO/PI双染试剂分别对水凝胶结构中的细胞进行活/死细胞标记，使用DAPI试剂标记细胞核，通过荧光显微镜观察记录细胞活率。其中吖啶橙(AcridineOrange，简称AO)可以通过完整的细胞膜，嵌入所有细胞(活细胞和死细胞)的细胞核，呈现绿色荧光；碘化丙啶(Propidiumiodide，简称PI)只能通过不完整的细胞膜，即死细胞的细胞膜，嵌入所有死细胞的细胞核，呈现红色荧光；DAPI可以穿透细胞膜，和双链DNA结合呈现蓝色荧光。测试结果见图1。测试表明，细胞在运输前后水凝胶结构中均大量呈现绿色荧光信号，细胞均保持高活率。

实施例2

一种细胞运输的方法，其中，依次包括如下步骤：

(1)将含有5％聚丙烯酰胺和0.1％聚赖氨酸的生物材料水溶液从4℃冰箱取出，吸取2mL生物材料水溶液与人脐静脉内皮细胞均匀混合，细胞密度为1×10

(2)将步骤(1)中细胞/材料混合物置于37℃条件中形成包裹细胞的水凝胶结构；

(3)将步骤(2)中水凝胶结构置于含10％胎牛血清的RPMI-1640细胞培养基中在细胞培养箱进行三维细胞培养，培养时间为10天；

(4)将步骤(3)中水凝胶结构置于含10％胎牛血清的RPMI-1640细胞培养基中在37℃条件下进行运输；

(5)将步骤(4)中运输3天后的水凝胶结构置于4℃条件中去除材料，离心分离细胞，细胞活率为80％。

本发明一种细胞运输的方法中，步骤(3)的三维细胞培养的时间除了选择10天外，还可以选择3-30天的任意时间。

实施例2与实施例1的区别在于，在将步骤(2)中水凝胶结构置于细胞培养液中进行运输前，首先放在细胞培养液中在细胞培养箱内进行三维细胞培养。是否采用在细胞运输前进行三维细胞培养操作主要从以下两方面进行考虑选择：

1.水凝胶结构中包裹细胞的密度能否满足运输后使用过程中细胞的需求量。如果运输前细胞密度可以满足运输后实际细胞的需求量，细胞在运输前可以不进行三维细胞培养，运输后可以直接使用细胞；如果运输前细胞密度无法满足运输后实际细胞的需求量，可以在运输前进行三维细胞培养，通过细胞在水凝胶结构中的增殖行为增加水凝胶结构中的细胞密度，使细胞运输后可以直接使用，满足实际细胞需求量。

2.运输后使用过程中对细胞活率的要求。如果运输后对细胞活率要求不高，如本发明中细胞活率70％，细胞在运输前可以不进行三维细胞培养，水凝胶结构主要为细胞运输提供三维物理支持，不能为细胞生长提供合适的微环境，基本不影响细胞在运输中的活率；如果运输后对细胞活率要求很高，如本发明中细胞活率95％，细胞在运输前可以进行三维细胞培养，细胞在培养过程中不断增殖，也不断分泌细胞外基质，构建适宜细胞生长的微环境，更利于在运输过程中保持细胞的高活率，其中，三维细胞培养时间的长短与不同细胞的培养环境、细胞生长状态、细胞的预期活率、运输后使用细胞的方式等因素有关，根据不同的使用需求选择合适的培养时间。

在细胞运输前后，使用AO/PI双染试剂分别对水凝胶结构中的细胞进行活/死细胞标记，使用DAPI试剂标记细胞核，通过荧光显微镜观察记录细胞活率。其中吖啶橙(AcridineOrange，简称AO)可以通过完整的细胞膜，嵌入所有细胞(活细胞和死细胞)的细胞核，呈现绿色荧光；碘化丙啶(Propidiumiodide，简称PI)只能通过不完整的细胞膜，即死细胞的细胞膜，嵌入所有死细胞的细胞核，呈现红色荧光；DAPI可以穿透细胞膜，和双链DNA结合呈现蓝色荧光。测试结果见图2。测试表明，细胞在运输前后水凝胶结构中均大量呈现绿色荧光信号，细胞均保持高活率。

本发明一种细胞运输的方法，在温和条件下采用生物材料包裹细胞形成三维水凝胶结构，通过细胞培养液浸没水凝胶并在4-37℃的温度条件下进行运输，运输后可以经过温和的方式去除生物材料实现细胞分离(或不去除材料，直接使用含有细胞的水凝胶结构)，该方法简便易行，成本低，运输过程基本不影响细胞活性；经测试，在保证细胞运输过程中温度控制范围为4-37℃的前提下，用该方法运输后细胞活率大于等于80％但小于等于95％。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。