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一种植物源脱氧胆酸中间体的制备方法

文献发布时间：2023-06-19 19:30:30

技术领域

本发明属于化工技术领域，具体涉及到一种植物源脱氧胆酸中间体的制备方法。

背景技术

脱氧胆酸，化学式为C

脱氧胆酸注射液是2015年4月29日由美国食品药品监督管理局(FDA)批准全球首个局部溶脂药，该药用于治疗和改善成人中度至重度颏下脂肪的凸起或丰满(双下巴)。

WO2017211820公开了以植物来源的植物甾醇发酵产物(20S)-9-羟基-3-酮基孕甾-4-烯-20-羧酸甲酯为起始原料制备脱氧胆酸的方法，路线如下所示：

但在实际制备中发现，从起始物开始制备A3的过程中存在以下问题：

1)、起始物SM在氢化反应制备A1时存在3，9位不能完全连接的物质及较大比例的5α位氢异构的杂质，结构如下：

2)、化合物A1在进行消除反应制备A2过程不可避免的生成△

3)、化合物A2在进行化学还原反应制备A3过程中不可避免的生成3β羟基杂质，结构如下：

该路线的副产物杂质多，至少有三种异构体存在，纯化困难，若要获得高质量的中间体，则需要多次精制，从而导致收率降低，成本较高，也不利于工业化放大。

因此，本领域需要设计一种新的植物源脱氧胆酸中间体的制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物源脱氧胆酸中间体的制备方法，以解决背景技术中提出的以植物来源的植物甾醇发酵产物(20S)-9-羟基-3-酮基孕甾-4-烯-20-羧酸甲酯为起始原料制备脱氧胆酸的方法中，因副产物杂质多而导致收率降低、成本较高的问题。

本发明的技术方案是一种植物源脱氧胆酸中间体的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、以(20S)-9-羟基-3-酮基孕甾-4-烯-20-羧酸甲酯为起始原料，在无机酸和冰醋酸的作用下，脱水合成化合物B1；

步骤2、化合物B1在反应溶剂的作用下加氢还原生成化合物A2；

步骤3、化合物A2在3α-羟基类固醇脱氢酶作用下还原酮基为化合物A3

在一种具体的实施方式中，所述步骤1中的无机酸包括硫酸和磷酸中的一种，优选无机酸为硫酸；所述步骤1中的反应温度为0～60℃，优选步骤1中的反应温度为30～40℃。

在一种具体的实施方式中，所述步骤2中的反应溶剂包括四氢呋喃、无水乙醇、甲醇和二氯甲烷中的一种或两种，优选反应溶剂为无水乙醇。

在一种具体的实施方式中，所述步骤2中还添加了有机碱，所述步骤2中的有机碱包括吡啶、1-甲基咪唑、三乙胺和4-二甲氨基吡啶中的一种或两种。

在一种具体的实施方式中，所述步骤2中的反应温度为0～40℃，优选步骤2中的反应温度为30～35℃；所述步骤2中的氢气压力为0～0.4Mpa，优选步骤2中的氢气压力为0.2～0.4MPa。

在一种具体的实施方式中，所述步骤3中的3α-羟基类固醇脱氢酶的使用形态为纯化酶或者细胞破碎后的酶液；所述步骤3中还原采用了助溶剂，助溶剂包括叔丁醇、异丙醇和二甲基亚砜中的一种。

在一种具体的实施方式中，所述步骤3中，反应溶液的PH值为6.5～8.0，反应温度为28～35℃，使用氢氧化钠水溶液调节pH值，氢氧化钠水溶液浓度为2％～10％。

在一种具体的实施方式中，所述步骤1具体包括：

在反应容器中加入无机酸、冰醋酸和起始物(9α,20S)-9-羟基-3-酮基孕甾-4-烯-20-羧酸甲酯，控温反应1～4h，TLC检测反应至完全；将反应液加入到冰水浴中，搅拌一段时间后过滤，用水淋洗至中性，将得到的滤饼湿品用二氯甲烷溶解，用氢氧化钠调PH值至中性，分液，收集有机层，减压浓缩，甲醇置换，最终浓缩至粘稠状态，过滤，滤饼干燥后得到化合物B1。

在一种具体的实施方式中，所述步骤2具体包括：在高压罐中加入反应溶剂，搅拌下加入起始物B1和钯碳，在氢气加压条件下反应一段时间，TLC检测反应至完全，过滤除钯碳，然后减压浓缩，用水置换，水析出料，水淋洗，滤饼干燥后得到化合物B1。

在一种具体的实施方式中，所述步骤3具体包括：

在反应瓶中加入水，搅拌下加入化合物A2和助溶剂，调节pH值，待化合物A2全部溶清后，调节反应温度，加入葡萄糖、3α-羟基类固醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、辅酶I；搅拌均匀后，调节pH后反应2～4小时，TLC监控化合物A2无明显剩余或不再减少；

将反应液进行真空浓缩至稠状，加入水，降温至5℃以下搅拌一段时间，过滤，得含蛋白的粗品；粗品用二氯甲烷和甲醇溶解，室温搅拌溶解，过滤，滤液浓缩至一定体积后用甲醇置换，降温至0～10℃，过滤，烘干得化合物3。

本发明的有益效果包括：

本发明以(20S)-9-羟基-3-酮基孕甾-4-烯-20-羧酸甲酯(SM)为起始原料，先进行9位α羟基消除，本路线反应过程中合成的化合物B1无△

在对中间体B1进行加氢反应时，本发明通过控制氢气压力选择性还原△

在对中间体A2的3-酮基还原过程中，本发明使用自构建的3α-羟基类固醇脱氢酶在适宜条件下，选择性地还原为3α-羟基，所得产物A3无3β羟基异构体，因此整体路线的收得率较原工艺大幅度提高，便于工业化生产。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明中产品化合物A3的核磁氢谱图。

图2为本发明中产品化合物A3的核磁碳谱图。

图3为本发明中产品化合物A3的HPLC图谱。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明中，起始原料(20S)-9-羟基-3-酮基孕甾-4-烯-20-羧酸甲酯(SM)购自湖南新合新生物医药有限公司，所述3α-羟基类固醇脱氢酶为自行构建的，来自睾酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)，所得酶的蛋白序列和基因序列见附录。葡萄糖脱氢酶，购自上海麦克林生化科技有限公司。辅酶I(NAD+)：氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，购自上海跃腾生物技术有限公司。其余试剂均为市售。

本发明中的反应投料比经常以重量体积比来表示反应比例，如无特别说明，该重量体积比是指反应原料的重量与反应试剂的重量或体积的比例。

起始原料(20S)-9-羟基-3-酮基孕甾-4-烯-20-羧酸甲酯为外购原料，其氢谱碳谱数据如下：

实施例1

化合物(20S)-3-酮基孕甾-4,9(11)-二烯-20-羧酸甲酯(B1)的制备

在洁净干燥的反应瓶中加入50.0ml水，冰水浴降温至0～10℃，搅拌下控温小于等于40℃，滴加368.0g浓硫酸，加入50.0ml冰醋酸和100.0g起始物(9α,20S)-9-羟基-3-酮基孕甾-4-烯-20-羧酸甲酯(即化合物SM)，将体系控温至35～40℃反应2h，TLC检测反应至完全。将体系加入到1500.0ml冰水浴中，加完后搅拌30分钟以上，过滤，用水淋洗至中性，将滤饼湿品用400.0ml二氯甲烷溶解，用氢氧化钠调PH至中性，分液，收集有机层，减压浓缩，甲醇置换，最终浓缩至粘稠状态，过滤，滤饼干燥至合格，得到92.4g化合物B1，纯度：99.8％。

实施例2