一种通过干扰HNRNPAB表达促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术、细胞、组织工程技术领域，尤其是一种通过干扰HNRNPAB表达促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法和应用。

背景技术

动物的肌肉发育包括胚胎期和出生后肌纤维的增殖和肥大两个方面，是一个长期发展的生物过程并由众多基因协作调控。骨骼肌是肌肉的重要组成部分，存在于生物体的各种组织中，也是呼吸、代谢等生理过程中不可或缺的组成要素。骨骼肌的生长发育伴随着众多基因的共同调控，骨骼肌卫星细胞是肌源性干细胞，在动物机体受到损伤时，可以增殖、分化为新的肌纤维、形成新的肌肉组织。在畜牧生产过程中，动物的产肉性能是决定经济指标的重要因素之一。从不同层面研究肌肉的生长发育调控网络有助于了解和提升动物的产肉性能。

核不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins,hnRNPs)是一类由RNA聚合酶Ⅱ产生并且与转录物结合的核蛋白，是一类参与了多种重要生命活动的RNA结合蛋白。HNRNPs家族成员约有20多个，按分子量大小命名从A到U，家族主要成员包括hnRNPA、hnRNPA/B、hnRNPC等，hnRNPs的生物学功能较为广泛，它能够利用其自身特有的结构同前体mRNA相结合，以两者复合体的形式参与mRNA的剪接、翻译、mRNA的稳定以及转录等调控过程，还有少部分未命名的成员由于表达较少并且不具备与前体mRNA结合的能力从而负责协助其他hnRNPs完成部分生物学功能。hnRNP蛋白能够进行翻译后修饰，从而使生物活性及亚细胞定位发生改变。其基因表达调控中同样发挥重要作用，研究表明许多hnRNPs参与癌症的发生和转移，HNRNPAB作为hnRNPs家族的核心蛋白，由两段RNA识别基序、一段RGG盒以及两段富含甘氨酸结构域的辅助区域构成，其中的RNA识别基序约由90-100个氨基酸组成，能够与Pre-mRNA的3’非翻译(3’UTR)区域结合，而富含甘氨酸的区域在核定位功能上具有重要作用。HNRNPAB在生物学功能上主要参与调控mRNA转运、代谢及剪切等过程，并且与诸多恶性肿瘤的发生发展，具有密切关系。但HNRNPAB参与动物骨骼肌发育的研究鲜有报道。基于此，本发明利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型，通过干扰牛骨骼肌卫星细胞中HNRNPAB的表达，研究HNRNPAB对牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化的作用，为进一步挖掘影响牛肌肉发育的基因奠定一定基础。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种通过干扰HNRNPAB表达促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法和应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种通过干扰HNRNPAB表达促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法，所述方法是通过降低HNRNPAB的表达来实现促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化；其中，所述HNRNPAB基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。

进一步地，包括如下步骤：

根据HNRNPAB的基因组碱基序列设计合成HNRNPAB的siRNA，以siRNA转染牛骨骼肌卫星细胞，降低HNRNPAB的表达水平，实现促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化。

进一步地，所述siRNA的基因序列为：SEQ ID NO.2。

进一步地，干扰HNRNPAB表达水平的方法包括：采用干扰HNRNPAB表达的质粒、病毒载体或基因敲除。

如上所述的通过干扰HNRNPAB表达促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法在牛肌卫星细胞的增殖和成肌分化方面中的应用。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明方法利用改变HNRNPAB的表达对牛肌卫星细胞的增殖和成肌分化过程进行调控，可以为肌肉发育分化过程的研究提供启示，并为对探索肌肉生长发育机制，改善牛肉的产量与品质提供参考。

2、利用本发明建立的通过改变HNRNPAB的表达来促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化过程的方法，可以有效地调控肌肉发育分化过程，借助此方法可以为肌肉发育分化及损伤修复中HNRNPAB的利用提供一定的借鉴，并为肌肉发育分化及损伤修复的临床研究及诊治提供新的思路和参考。

3、鉴于目前HNRNPAB对牛骨骼肌卫星细胞是否具有一定的调节作用，以及具体的作用效果还不清楚，本发明设计并合成HNRNPAB的siRNA，然后采用lip3000试剂转染牛骨骼肌卫星细胞，干扰牛骨骼肌卫星细胞中HNRNPAB的表达水平，通过改变牛骨骼肌卫星细胞中HNRNPAB的表达，从而促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化过程。借助此方法可以为肌肉发育分化及损伤修复中HNRNPAB的利用提供借鉴，并为肌肉发育分化及损伤修复的临床研究及诊治提供新的思路和方法。

4、本发明方法可以为骨骼肌发育分化及hnRNPs的研究提供启示，可为进一步研究肌肉发育过程中关键hnRNPs蛋白的作用机理研究打下良好基础，为优质肉牛新品种的快速培育和肉质改良提供理论基础。

附图说明

图1为本发明中HNRNPAB在牛骨骼肌卫星细胞成肌分化前、后的表达水平变化的定量PCR和Western blot检测结果图；其中，A为qRT-PCR检测牛骨骼肌卫星细胞增殖期和分化期HNRNPAB的mRNA表达水平图，B为Western blot检测牛骨骼肌卫星细胞增殖期和分化期HNRNPAB蛋白表达水平图，C为Western blot检测直观示意图；其中，GM为牛骨骼肌卫星细胞增殖期，DM1为牛骨骼肌卫星细胞分化第一天，DM2为牛骨骼肌卫星细胞分化第二天，DM3为牛骨骼肌卫星细胞分化第三天；

图2为本发明中采用siRNA干扰HNRNPAB表达对牛骨骼肌卫星细胞中分化标志基因MyoG、MyHC的qRT-PCR检测结果图；其中，A为分化第一天(DM1)MyoG、MyHC的mRNA表达水平图，B为分化第三天(DM3)MyoG、MyHC的mRNA表达水平图；

图3为本发明中采用siRNA干扰HNRNPAB表达对牛骨骼肌卫星细胞中分化标志基因MyoG、MyHC在诱导分化第三天(DM3)的Western blot检测结果图；其中，A为Western blot检测干扰后MyoG、MyHC蛋白表达水平图，B为Westernblot检测直观示意图。

图4为本发明中采用siRNA干扰HNRNPAB表达至诱导分化第三天时，倒置显微镜下观察到的肌管图(200×)。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种通过干扰HNRNPAB表达促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法，所述方法是通过降低HNRNPAB的表达来实现促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化；其中，所述HNRNPAB基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。

较优地，包括如下步骤：

根据HNRNPAB的基因组碱基序列设计合成HNRNPAB的siRNA，以siRNA转染牛骨骼肌卫星细胞，降低HNRNPAB的表达水平，实现促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化。

较优地，所述siRNA的基因序列为：SEQ ID NO.2。

较优地，干扰HNRNPAB表达水平的方法包括：采用干扰HNRNPAB表达的质粒、病毒载体或基因敲除。

如上所述的通过干扰HNRNPAB表达促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法在牛肌卫星细胞的增殖和成肌分化方面中的应用。

具体地，相关制备及检测实施例如下：

本发明的一种设计思路可以是：

设计并合成HNRNPAB的siRNA，然后采用lip3000试剂转染牛骨骼肌卫星细胞，干扰牛骨骼肌卫星细胞中HNRNPAB的表达水平，通过改变牛骨骼肌卫星细胞中HNRNPAB的表达，从而促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。

一种通过干扰HNRNPAB表达促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法，包括以下步骤：

第一步、牛骨骼肌卫星细胞分离培养、体外成肌诱导分化模型的建立及肌卫星细胞成肌分化前后HNRNPAB表达的检测：

采用胰酶和胶原酶联合消化的方法分离牛骨骼肌卫星细胞，建立牛骨骼肌卫星细胞体外成肌诱导分化模型。采用定量PCR及Westernblot方法检测牛骨骼肌卫星细胞成肌分化前后HNRNPAB的表达量；

具体步骤如下：

(1)牛骨骼肌卫星细胞分离培养、体外成肌诱导分化模型的建立。

采用胰酶和胶原酶联合消化的方法分离牛骨骼肌卫星细胞。无菌条件下采集牛胎儿后肢肌肉，剪成合适大小，置于PBS缓冲液中清洗数次，在培养皿中用眼科剪充分剪碎，用预热的PBS缓冲液冲洗一次后在离心机中以1000r/min的转速离心5min，弃去上清液，加入5ml的0.2％胶原酶II在37℃水浴中消化1h，期间每隔10min涡旋振荡10s，然后加入含有EDTA的0.25％胰酶消化30min，期间每隔10min涡旋振荡10s，最后加入含20％的胎牛血清培养基(20％FBS+80％DMEM)终止消化，将上述混合液依次过100目、200目和400目细胞筛，将滤液收集到50ml离心管中，在离心机中以1000r/min的转速离心10min，用培养基(20％FBS+80％DMEM)重悬，接种到合适的培养皿中，37℃、5％CO

(2)HNRNPAB的基因组碱基序列(1648bp)：SEQ ID NO.1

ACGAGTCGGCATTGTCAGGCGGCGGCACCGCGCGGCCGGGGCGAGCTTTGGAGTCGGTGGGTTCGTGTGGCTGCGGAGGCGGAATAGGCGAGCGTGAGGTCGCAGCGGCTCCGTCGGTAGACGGGGGAGAGGCCCGGCAGCGCGAGCGTGAGCGCGGCCGAGCCCGCGGTGCCTTCTCGGCGGGTGGGGACGAGCGGGCCCCGCGGCGTCATCGGCGGCGAGGAGCCGCGCGCCTCGGCCTAGCATGTCGGAAGCGGGTGAAGAGCAGCCCATGGAGACGACGGGAGCCACTGAGAACGGACATGAGGCTGCCCCCGAAGGCGAGTCGCCGGCCGGAACTGGTACCGGCGTTGCGGCGGGCGCTGGAGGCGGGAGCGCGGCGCCCCAGGCCGGCAACCAGAACGGCGCCGAGGGCGACCAGATCAACGCCAGCAAGAATGAGGAGGACGCGGGAAAAATGTTCGTTGGTGGCCTGAGCTGGGATACCAGCAAAAAGGATCTAAAAGATTATTTTACCAAATTTGGAGAGGTCGTTGATTGTACAATAAAAATGGATCCCAACACTGGCCGGTCAAGAGGGTTTGGATTTATCCTCTTCAAAGATGCAACCAGTGTGGAGAAGGTTCTAGACCAGAAGGAGCACAGGCTGGATGGCCGTGTCATTGACCCCAAAAAAGCCATGGCCATGAAGAAAGACCCAGTAAAGAAAATTTTTGTAGGGGGTCTGAATCCTGAAGCCACTGAGGAGAAGATAAGGGAGTACTTCGGCGAGTTTGGGGAGATTGAAGCCATTGAGCTTCCAATGGATCCAAAGTCGAACAAAAGACGAGGCTTTGTTTTCATCACCTTTAAAGAAGAAGAACCTGTGAAGAAAGTGCTGGAGAAAAAGTTCCACACCATCAGTGGAAGTAAGTGTGAAATCAAGGTGGCTCAGCCCAAAGAGGTTTATCAACAGCAGCAGTATGGCTCTGGGGGCCGTGGGAATCGCAATCGAGGGAACCGAGGCAGTGGGGGCGGCGGTGGAAGTGGAGGTCAGGGTAGTACAAATTACGGGAAGAGCCAGCGACGCGGTGGCCATCAGAATAACTACAAGCCATACTGAGGCTTCAGCAGGATGACTGACCACACACGCTTTGTTTGGATATCGAGTGAACACAATTATGTACCAAATTTAACTTGGCAAACTTTCTATGGCCTGTCCCATGTGCATCTTATTTAAAATTTCCCCCCTGGAAATCACTCTCCTGTTTAATATTTCCAGAGCTCTAGTTGTTTAGGCAGCGTGTGGTTTCTCAAGAGGCCAGAGCGGCATTATGGGCTGATTTTTATTACTGGGTTACCCAGAACCAGATTGGAGGGTCTGCTTCCTGCTGCCGCTCTGCAGCCTGGACCTGTGGACCCTGGTTGTAAAGAGTAAATTGTATCTTAGAAAACCAGTGTCACCTTTTTTTCACCTTTTAGTTTTATATTATTTGTGTCATACATTTCCTATAATGGAAGTGTTAATTTTACTGTACTTTTTGGTACCTTTCGGGAATCTAATGTATTGTAAGGTATTTTACACGTGTCCTGATTTTGCCACGACCTGGATATTGAAGCTATCCAAGCTTTTGAAATAAAAATTTAAAAACCAAAAAAAAAAAAAAAA

(3)牛骨骼肌卫星细胞成肌分化前后HNRNPAB表达变化检测。

采用细胞RNA快速提取试剂盒提取增殖及分化细胞的总RNA。提取步骤：向24孔细胞培养板中加入600ML细胞裂解液，反复吹打至细胞充分裂解。显微镜下观察细胞完全裂解后，将上述裂解液收集至1.5ml的无RNA酶管中。将裂解混合物全部加到DNA清除柱上。立刻13000rpm的转速离心60s。用微量移液器精确估计滤过液体积，加入等体积的70％乙醇，立即吹打混匀，不要离心。立即将混合物加入一个吸附柱RA中，13000rpm离心30s,弃掉废液。加700μL去蛋白液RW1，室温放置1分钟，12000rpm离心30s，弃掉废液。加入500ML漂洗液RW，12000rpm离心30s，弃掉废液。加入500ML漂洗液RW，重复一遍。将吸附柱RA放回空收集中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。取出吸附柱RA，放入一个无酶离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50ML无酶水，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟。

RNA的反转录及定量PCR操作按照试剂盒说明书进行。所用引物序列见表1，GAPDH作为内参。RNA的反转录及定量PCR操作条件如下：

①RNA反转录体系及条件：

配制成20μL的混合液。

涡旋振荡混匀，短暂离心，将管壁上的溶液收集到PCR管底。

将配好的混合液放置于PCR仪上，并设定程序：先于42℃条件下孵育15min，然后在85℃条件下孵育5min。上述程序结束后，短暂离心，将反转录后的cDNA混合液取出在冰上冷却。

②定量PCR检测体系：

反应液的配置：在冰上配置反应液，每个样品中的检测指标都要进行复孔实验，并进行单孔NTC实验，采用白色定量板进行定量PCR检测。

定量板中每个单孔中反应液配置如下：

共20μL反应体系。

qRT-PCR的反应条件：

充分混匀反应液后，离心，使反应液到反应管底部，置于实时荧光定量PCR仪上。具体反应设计程序如下：

预变性：95℃条件下60s

变性：95℃条件下10s

退火：61℃条件下20s

延伸：72℃条件下15s

重复变性至退火步骤35次。

反应结束后，绘制溶解曲线，本实验中检测荧光温度范围为：65℃-95℃，升温速率为0.5℃/次循环，恒温时间为10s/次循环。

所有反应结束后，于37℃条件下保温30s，防止反应结束后取出反应管时被烫。

表1 HNRNPAB实时定量PCR引物序列

提取增殖及分化状态的牛骨骼肌卫星细胞的蛋白，提取步骤：吸弃培养基，加预冷PBS清洗细胞，以6孔板为例，牛骨骼肌卫星细胞每孔加入200μL含1％PMSF的RIPA裂解液，稀释比为100:1，4℃裂解15min，收集至1.5mL无酶离心管。4℃条件下，高速离心机12000×g10min，转移上清至1.5mL无酶离心管，蛋白样品于-20℃保存。采用BCA法测蛋白浓度，用4×蛋白上样缓冲液稀释蛋白，确保所有样品蛋白上样量相同，于100℃沸水中变性10min。随后进行Western blot检测，配置10％浓缩胶与分离胶，随后点样，80V恒定电压下电泳40min，待蛋白到达分离胶后，120V恒定电压下电泳90min。切除浓缩胶，将胶与PVDF膜夹紧，以300mA恒定电流转膜2h，转膜结束用5％脱脂奶粉封闭2h，TBST清洗膜3次，每次10min。HNRNPAB一抗最终稀释为1：500，MyHC、MyoG，Pax7一抗最终稀释为0.5μg/mL；Tubulin一抗稀释倍数为1：3000，将膜与一抗封至杂交袋，4℃过夜孵育。用TBST清洗膜3次，每次10min。羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗稀释倍数为1:20000，并将PVDF于二抗稀释液中室温孵育1h，TBST清洗膜3次，每次10min。向PVDF膜加200μL ECL超敏发光液，采用ChemiDoc

定量PCR检测结果和Western blot检测结果见图1，实验结果表明，随着牛骨骼肌卫星细胞分化时间的延长，HNRNPAB的mRNA表达水平呈现先上升后下降的趋势，且在诱导分化第一天HNRNPAB的mRNA表达量达到峰值2.06，分化期HNRNPAB的蛋白水平表达量较增殖期(分化前)相比下降了2.4倍，表明HNRNPAB可能具有调控牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的作用。

第二步：牛骨骼肌卫星细胞抑制表达模型的建立及干扰效果检测：

根据HNRNPAB碱基序列，设计合成siRNA，转染进牛骨骼肌卫星细胞，采用定量PCR方法检测HNRNPAB的表达水平，检测siRNA对HNRNPAB的干扰效果；

具体步骤如下：

(1)HNRNPAB干扰RNA(siRNA)设计合成。

根据HNRNPAB碱基序列，由生物公司设计合成siRNA(SEQ ID NO.2：CCAAAGAGGTTTATCAACA)。

(2)牛骨骼肌卫星细胞抑制表达模型的建立。

将HNRNPAB的siRNA采用lip 3000试剂转染牛骨骼肌卫星细胞，将牛骨骼肌卫星细胞分别接种于24孔细胞培养板和6孔细胞培养板中，用生长培养基进行培养，当细胞生长密度为70％～80％时准备转染，并在转染前一天将培养基更换成无抗生素的生长培养基。根据试剂说明书推荐浓度，采用si-RNA及阴性对照终浓度50nM进行转染。在进行转染时，先将培养基更换成无血清的Opti-MEM培养基，以24孔板为例，将si-RNA或对应阴性对照混合于50μL Opti-MEM培养基中，同时将0.75μL lip3000转染试剂混合于50μL Opti-MEM培养基中，分别静置5min，将含siRNA或对应阴性对照的Opti-MEM培养基加入到含罗氏转染试剂的Opti-MEM培养基中，轻柔混匀后混合液静置15min，将混合液均匀滴加到24孔细胞培养板和6孔细胞培养板中，滴加混合液体积以达到siRNA或对应阴性对照的终浓度为准。

(3)siRNA干扰效果检测

转染24h后，将培养基更换为成肌诱导分化培养基继续培养，对肌卫星细胞进行诱导分化。诱导分化24h及72h后，采用细胞RNA快速提取试剂盒提取24孔板中转染细胞的总RNA，采用定量PCR方法检测HNRNPAB的mRNA表达水平，总RNA提取、RNA的反转录及定量PCR操作与第一步中方法相同，所用引物序列见表1，提取6孔板中的总蛋白，采用Western blot方法检测HNRNPAB的蛋白表达水平，检测结果见图2、图3，实验结果表明siRNA对HNRNPAB的表达具有明显的干扰作用，极显著调低了HNRNPAB的表达水平(**，与对照NC相比p<0.01)，可以用于后续HNRNPAB的表达调控研究。

第三步：干扰HNRNPAB对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响：

采用siRNA转染牛骨骼肌卫星细胞干扰HNRNPAB的表达，然后将肌卫星细胞进行成肌诱导分化，通过定量PCR及Western blot检验分化标志基因MyoG、MyHC的表达情况并根据肌管的形成状态判断干扰HNRNPAB表达对牛肌卫星细胞成肌分化的影响；

具体步骤是：

将HNRNPAB的siRNA采用lip3000试剂转染牛骨骼肌卫星细胞，具体操作与第二步中siRNA的转染方法相同。转染24h后，将培养基更换为成肌诱导分化培养基继续培养，对肌卫星细胞进行诱导分化。采用定量PCR检验分化标志基因MyoG、MyHC的mRNA表达情况，所用引物序列见表2，GAPDH作为内参，序列同表1。结果显示干扰HNRNPAB后分化标志因子MyoG、MyHC在分化第一天(DM1)和分化第三天(DM3)时的mRNA表达水平均极显著升高，检测结果见图2(**，与对照NC相比p<0.01)。

表2分化标志基因MyoG、MyHC实时定量PCR引物序列

采用Western blot检验分化标志基因MyoG、MyHC的蛋白表达情况，结果显示干扰HNRNPAB后分化标志因子MyoG、MyHC在分化第三天(DM3)的蛋白表达水平均显著升高，检测结果见图3(*，与对照NC相比p<0.05)，表明下调HNRNPAB能够促进肌卫星细胞的成肌分化，同时，通过肌管的形成状态判断干扰HNRNPAB表达对牛肌卫星细胞成肌分化的影响，结果见图4，与对照组(siRNA-NC)相比，转染了siRNA的肌卫星细胞经诱导分化形成的肌管明显变粗且分化状态更加明显。上述研究结果提示，改变牛骨骼肌卫星细胞中肌肉发育分化相关HNRNPAB的表达，可以影响牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。

当然，HNRNPAB表达水平改变的方法包括设计合成的干扰RNA(siRNA)，还包括干扰HNRNPAB表达的质粒、病毒载体及基因敲除等其它能够改变HNRNPAB表达水平的手段。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。