一种通过标准曲线评价免疫检测试剂性能的方法

【技术领域】

本发明涉及试剂性能评估技术领域，特别涉及一种通过标准曲线评价免疫检测试剂性能的方法。

【背景技术】

免疫检测试剂，广泛应用于医疗诊断、食品安全检测、毒品和药物检测等领域。定量免疫试剂的性能指标中，不精密度和可报告范围是两个比较重要的指标。而这两个指标也是相互关联的。不精密度一般用变异系数表征，变异系数=多次重复试验结果的标准差/多次重复试验结果的均值。而可报告范围与不精密度相关，一般认为如果该浓度下变异系数不超过一定限度（根据用户要求不同，一般取10%~20%），则此浓度在可报告范围之内；如果该浓度下变异系数超过一定限度，则此浓度超出可报告范围之外。

免疫试剂的开发者和使用者都有这样的感性认知：对于信号值随浓度升高而升高的免疫试剂，如夹心法免疫试剂，在信号和浓度都很低的情况下，计算变异系数时的分母极小，造成变异系数结果很大；当浓度逐渐增加，变异系数逐渐变小，试剂浓度进入可报告范围内；当浓度超过一定限度，信号逐渐“饱和”，标准曲线增长变“平缓”，在通过标准曲线计算浓度时，微小的信号值波动会带来较大的浓度值波动，计算变异系数时的分子增大，造成变异系数结果增大，导致试剂浓度超出可报告范围。对于信号值随浓度升高而降低的免疫试剂，如竞争法免疫试剂，也有类似情况。

这种感性认知的缺陷是不能定量，无法直观判断一段标准曲线是否变得“平缓”。当需要评估一种检测试剂的可报告范围时，一般使用实验的方法，测定一系列浓度从极低到极高的样本，以变异系数为纵轴，浓度为横轴，作精密度谱图（precisionprofile）。这种评价方法，需要很多实验操作和数据处理，消耗人力和试剂很多，不利于提高试剂开发的工作效率。

【发明内容】

为了克服上述问题，本发明提出一种可有效解决上述问题的通过标准曲线评价免疫检测试剂性能的方法。

本发明解决上述技术问题提供的一种技术方案是：提供一种通过标准曲线评价免疫检测试剂性能的方法，包括如下步骤：

步骤S1，将免疫检测试剂的不精密度来源分为不精密度第一来源和不精密度第二来源；

步骤S2，对不精密度第一来源和不精密度第二来源的性质分别进行评估，确定不精密度第二来源代表了免疫检测试剂的核心性能；

步骤S3，根据免疫检测试剂的标准曲线，用数学方法对不精密度第二来源进行评估，从而判断免疫检测试剂的性能优劣。

优选地，所述步骤S3中，包括如下步骤：

步骤S31，在免疫检测试剂的标准曲线上任取一点P，通过点P对两个坐标轴做垂线，分别与坐标轴相交于点D和点R，通过点P对标准曲线做切线，与纵轴相交于点A；

步骤S32，计算点P处的发散系数F；

步骤S33，通过比较F值和浓度关系曲线，在不同的试剂配方或原料组合间进行优劣比较。

优选地，所述步骤S31中，点P的坐标为（d，r），点D的坐标为（d，0），点R的坐标为（0，r），点A的坐标为（0，a）。

优选地，所述步骤S32中，

优选地，点P附近的浓度变异系数=Δd/d；点P附近的信号变异系数=Δr/r，

优选地，所述步骤S33中，通过实验获得不精密度第一来源的变异系数水平均为S%；通过计算不同浓度处的发散系数F，即可以得到不同浓度处浓度值的变异系数为（F×S）%；通过做一组标准曲线数据即可得到精密度谱图，并初步评估试剂可报告范围。

与现有技术相比，本发明的通过标准曲线评价免疫检测试剂性能的方法通过标准曲线计算发散系数，估算精密度谱图（precisionprofile），从而评价试剂性能，通过理论计算代替大量实验操作，在不同试剂配方或原料组合间进行优劣比较，提高试剂开发效率，节省人力，减少试剂浪费。

【附图说明】

图1为本发明通过标准曲线评价免疫检测试剂性能的方法的标准曲线示意图；

图2为本发明通过标准曲线评价免疫检测试剂性能的方法的步骤流程图；

图3为本发明通过标准曲线评价免疫检测试剂性能的方法的步骤S3流程图；

图4为本发明通过标准曲线评价免疫检测试剂性能的方法的具体实施例标准曲线对比图；

图5为本发明通过标准曲线评价免疫检测试剂性能的方法的具体实施例发散系数与浓度关系曲线对比图。

【具体实施方式】

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施实例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

需要说明，本发明实施例中所有方向性指示（诸如上、下、左、右、前、后……）仅限于指定视图上的相对位置，而非绝对位置。

另外，在本发明中如涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

请参阅图1至图3，本发明的通过标准曲线评价免疫检测试剂性能的方法，包括如下步骤：

步骤S1，将免疫检测试剂的不精密度来源分为不精密度第一来源和不精密度第二来源。

根据公开的知识，免疫检测所获得的浓度数据，实际上不是直接检测的结果，而是经过了信号-浓度的换算。其中信号根据方法学不同有多种形式，如酶联免疫法中的吸光度、化学发光法中的发光值、荧光法中的荧光值等。换算的媒介是标准曲线。经过分析可以发现，试剂的不精密度有两个来源，第一个来源（不精密度A）是信号的测量及测量之前的随机误差，包括但不限于：样本制备中试剂和样本加样体积误差、样本与试剂孵育时间误差、检测器（通常是光学-电子器件）噪声引入的误差等；第二个来源（不精密度B）是获得信号之后，在通过标准曲线进行信号-浓度换算中引入的，例如：标准曲线增长变“平缓”时，微小的信号值波动计算时会带来更大的浓度值波动。所述步骤S1中，不精密度第一来源为不精密度A，不精密度第二来源为不精密度B。

步骤S2，对不精密度第一来源和不精密度第二来源的性质分别进行评估，确定不精密度第二来源代表了免疫检测试剂的核心性能。

不精密度A受人工操作误差或仪器误差的影响最大；而不精密度B则基本代表了与操作无关的试剂核心性能，一种标准曲线信号不容易“饱和”的试剂可报告范围显然宽于信号容易“饱和”的试剂。

步骤S3，根据免疫检测试剂的标准曲线，用数学方法对不精密度第二来源进行评估，从而判断免疫检测试剂的性能优劣。

所述步骤S3中，输入数据是试剂的标准曲线，即使用此试剂获得的检测信号与样本浓度之间数学关系。标准曲线的横轴为浓度值，纵轴为信号值。图1中的标准曲线是一个典型的夹心法免疫试剂标准曲线（线性坐标），这种曲线一般用4或5参数逻辑斯蒂拟合。

所述步骤S3中，包括如下步骤：

步骤S31，在免疫检测试剂的标准曲线上任取一点P，通过点P对两个坐标轴做垂线，分别与坐标轴相交于点D和点R，通过点P对标准曲线做切线，与纵轴相交于点A。

所述步骤S31中，点P的坐标为（d，r），点D的坐标为（d，0），点R的坐标为（0，r），点A的坐标为（0，a）。

步骤S32，计算点P处的发散系数F，如果在点P处信号值变异系数为1%，则经过标准曲线换算后浓度值变异系数为F%。

所述步骤S32中，

上述F的计算公式有以下推导过程得出：

因为点P附近的浓度变异系数=Δd/d；点P附近的信号变异系数=Δr/r，在P点附近，标准曲线近似线性，信号值（纵轴）的标准差（Δr）与其导致的浓度值（横轴）的标准差（Δd）近似存在数学关系：

由公式可知，因标准曲线一般为凸曲线，a＞0，故F＞1。即浓度变异系数总是大于信号变异系数。

步骤S33，通过比较F值和浓度关系曲线，在不同的试剂配方或原料组合间进行优劣比较。

所述步骤S33中，根据经验，仪器和操作误差一般与样本浓度关系不大，因此可以假设在比较宽的浓度范围内不精密度A是接近的，例如可通过少量实验获得其变异系数水平均在S%附近。那么通过计算不同浓度处的发散系数F，即可以得到不同浓度处浓度值的变异系数约为（F×S）%。而这只需要做一组标准曲线数据即可得到精密度谱图（precisionprofile），并初步评估试剂可报告范围。

即使我们不知道S%的具体值，但对同一套检测方法和仪器设备，使用不同配方或原料组合的试剂其S%是接近的，那么就可以通过比较F值-浓度关系曲线，在不同试剂配方或原料组合间进行优劣比较，提高试剂开发效率。

请参阅图4和图5，下面通过一个具体实施例来进一步说明本发明。

图4中为两个不同配方CEA试剂的标准曲线（横轴为浓度，单位ng/mL，纵轴为信号值），二者均为5参数逻辑斯蒂拟合，此拟合算法为公知技术。

标准曲线A的拟合公式为：

(144.0-46262.7)/((1+(x/1222.2)^1.085)^7.9)+46262.7

标准曲线B的拟合公式为：

(117.4-76520.4)/((1+(x/453247)^1.01)^406.7)+76520.4

从图4直观可见标准曲线A在高浓度饱和，曲线变平缓；而标准曲线B更好。但无法从数量上说明B相对于A的优势。

通过标准曲线A和标准曲线B分别计算发散系数F，并做出发散系数F与浓度的关系曲线A1和曲线B1，如图5所示。

从图5可见，在1000 ng/mL处，A1图发散系数达到约27；B1图只有1.5。可推算，如果操作方法和设备导致的信号值变异在3%左右，则A试剂在1000 ng/mL处变异系数达到80%左右，而B试剂只有5%以下。如果要达到15%的不精密度指标，A试剂可报告范围上限约为500ng/mL（对应发散系数F=5）

与现有技术相比，本发明的通过标准曲线评价免疫检测试剂性能的方法通过标准曲线计算发散系数，估算精密度谱图（precisionprofile），从而评价试剂性能，通过理论计算代替大量实验操作，在不同试剂配方或原料组合间进行优劣比较，提高试剂开发效率，节省人力，减少试剂浪费。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的构思之内所作的任何修改，等同替换和改进等均应包含在本发明的专利保护范围内。