多肽GL42的制药用途

技术领域

本申请涉及预防或治疗心脏重塑的药物领域。具体地，本申请涉及多肽GL42或其活性片段。本申请还涉及所述多肽GL42或其活性片段的制药用途。

背景技术

占心血管疾病(CVD)近一半的非传染性疾病(NCDs)已超过传染病成为全球主要病理。同时，心血管疾病仍然是全球最致命的病理学。随着中国生活水平的快速提高和生活方式的巨大改变，心血管疾病的患病率和死亡率显著增加。

高血压是最常见的心血管疾病，其在中国患者已超过2.6亿，全球患者总数超过10亿人，高血压所致心、脑、肾等重要脏器损伤的发生是中国总死亡危险的首要因素。虽然各脏器并发症的发生涉及多种因素，但其共同的病理生理学基础是高血压引起的靶器官损伤。

现有的高血压病治疗药物主要有六大类，即利尿剂、β受体阻滞剂、钙拮抗剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂及α肾上腺能阻滞剂。另外中国也有一些复方制剂及中药制剂在使用。但都需要终生服药且易造成一定程度的毒副作用，并且机体可能对药物产生耐药性。

人体内存在着许多天然多肽，它们参与调控各种生理功能，因而在临床应用上具有非常重要的开发价值。近年来，多肽药物的开发越来越受到重视，目前全球药物市场上有60-70个多肽药物，更多的多肽药物处在各级临床试验、临床前试验和实验室研究阶段。

多肽一般没有副作用或者副作用很小，主要是小分子多肽降解后的产物为氨基酸，一般不会在特定器官组织中累积，容易通过肝和肾从体内很快被清除掉，因而，几乎没有异物代谢引起的毒理学问题。如，多肽通过调控生长素分泌来调控细胞的分泌，通过调控各种信号路径来调控细胞的生长、分化和凋亡等各种细胞功能。多肽作为药物主要用于治疗癌症、代谢紊乱(metabolicdisorders)、心血管等重大疾病。

因此，进一步开发多肽的治疗用途，获得靶向性强、远期疗效好、安全性高、价格低廉的的新药势在必行。

发明内容

本发明的技术方案基于以下发现：

申请人发现以Cav1.2多肽片段为结构基础设计出的多肽药物GL42能够降低AngII诱导的病理性小鼠肾脏纤维化相关蛋白Col-1和迁移相关蛋白MMP9表达水平，同时能够小鼠肾脏的纤维化水平和水肿程度。申请者还发现以Cav1.2多肽片段为结构基础设计出的多肽药物GL42能够降低AngII诱导的病理性小鼠血压升高，同时能够小鼠肾脏的血管壁厚度。

因此，本申请的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明所述的多肽GL42特征在于其结构与Cav1.2通道蛋白结构具有相似性，结构中包括CaMKII的结合域(TVGKF)。

多肽GL42进入体内后能够与CaMKII结合发挥作用，该多肽的氨基酸序列为：GRKKRRQRRRGGDDEVTVGKFYATFL(SEQ ID NO:1)。

本发明的第一方面提供了多肽GL42或其活性片段在制备用于预防、缓解和/或治疗心脑血管疾病中由AngII诱导的血管壁增厚所致血管功能损伤相关症状的药物中的应用。

本发明的第二方面提供了多肽GL42或其活性片段在制备用于预防、缓解和/或治疗AngII诱导的收缩压和舒张压升高的药物中的应用。

本发明的第三方面提供了多肽GL42或其活性片段在制备用于预防、缓解和/或治疗AngII诱导的肾脏纤维化和/或肾脏水肿的药物中的应用。

与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：

多肽药物GL42能够降低AngII诱导的病理性小鼠肾脏纤维化相关蛋白Col-1和迁移相关蛋白MMP9表达水平，同时能够小鼠肾脏的纤维化水平和水肿程度，从而为肾脏损伤和血管损伤的治疗和预防提供了新的思路和研究方向。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本申请的实施方案，其中：

图1示出GL42对AngII诱导小鼠收缩压水平的影响。

图2示出GL42对AngII诱导小鼠舒张压水平的影响。

图3示出为GL42对AngII诱导小鼠肾脏Col-1和MMP9表达水平的影响。

图4示出为GL42对AngII诱导小鼠血管组织MMP2和MMP9表达水平的影响。

图5示出为四组小鼠肾脏和血管组织的H&E染色。

图6示出为四组小鼠肾脏和血管组织的Masson染色。

具体实施方式

下面结合附图和实施例进一步说明本申请，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本申请，并非用于限制本申请。

一、实验材料

1.1小鼠

除非另有指示，本申请中使用小鼠获自上海南方模式生物科技股份有限公司所有动物研究均经中国医科大学动物学科委员会批准(方案号2019026)。

1.2组织病理学评估

组织样本经过福尔马林(4％)固定4小时，石蜡包埋和5μm切片。二甲苯脱蜡后，用分级乙醇进行再水化，然后进行H&E和Masson三色(G1340；Solarbio，中国)染色。

通过免疫荧光检查冷冻的组织切片，将细胞用4％福尔马林固定并在室温下用WGA(5μM)处理10分钟，然后进行荧光显微镜分析。

1.3统计分析

数据显示为平均值±标准差(SD)。通过F-和Brown-Forsythe检验分别评估两组和多组的方差同质性。进行夏皮罗-威尔克检验以评估正态性。两组的正态分布和偏态分布数据分别通过学生t检验和韦尔奇t检验进行比较。对分别涉及一个和两个参数的多组比较进行单向方差分析和双向方差分析，然后进行事后Bonferroni检验。P值针对多重比较进行了适当调整。采用SPSS22.0(SPSS，USA)进行统计分析，P<0.05表示有统计学意义。

二、实验方法

2.1.GL42对AngII诱导小鼠血压水平的影响

将26只6周龄的小鼠随机分为4组，其中control组6只、AngII组7只、GL42组6只、AngII+GL42组7只。连续14天对AngII组小鼠腹腔注射AngII，剂量为5mg/Kg；对GL42组小鼠腹腔注射GL42，剂量为21mg/Kg；对AngII+GL42组小鼠腹腔注射AngII+GL42，剂量同前；control小鼠腹腔注射等体积生理盐水。每日上午9：00测量小鼠血压，计算每组小鼠收缩压和舒张压的平均值和标准差，使用GraphPad Prism 8.3.0绘制收缩压和舒张压折线图。结果见图1和图2，显示：与对照组相比，给予AngII处理组小鼠收缩压和舒张压均明显升高；当给予GL42处理后，AngII诱导的小鼠收缩压和舒张压显著降低。

2.2.GL42对AngII诱导小鼠肾脏损伤和血管损伤蛋白表达水平的影响

2.2.1

为了进一步证实，GL42对小鼠肾脏组织纤维化和细胞迁移的抑制作用，使用Western Blot(蛋白质免疫印迹)实验检测四组小鼠肾脏纤维化相关蛋白Col-1和迁移相关蛋白MMP9表达水平的情况。结果显示：与对照组相比，给予AngII处理组小鼠肾脏组织Col-1和MMP9的表达显著升高(Col-1：P<0.0001，MMP9：P<0.001)；当给予GL42处理后，与对照组相比，AngII诱导的小鼠肾脏组织Col-1和MMP9蛋白表达的升高被显著减弱(Col-1：P<0.0001，MMP9：P<0.01)。详细信息见图3。

如图3所示，分别取四组小鼠的肾脏组织，用Western Blot实验检测其中纤维化相关蛋白Col-1和迁移相关蛋白MMP9表达水平情况。使用ImageJ进行Western Blot条带的灰度值分析，绘制柱状图。各组数据以均数±标准差表示(n＝3)，****表示两组相比P<0.0001，***表示两组相比P<0.001，**表示两组相比P<0.01，ns表示两组相比P>0.05。

2.2.2 GL42对AngII诱导小鼠血管迁移相关蛋白MMP2和MMP9表达水平的影响

为了进一步证实，GL42对小鼠血管迁移的抑制作用，用Western Blot实验检测四组小鼠血管迁移相关蛋白MMP2和MMP9表达水平的情况。结果显示：与对照组相比，给予AngII处理组小鼠血管组织MMP2和MMP9的表达显著升高(MMP2：P<0.0001，MMP9：P<0.0001)；当给予GL42处理后，与对照组相比，AngII诱导的小鼠血管组织MMP2和MMP9蛋白表达的升高被显著减弱(MMP2：P<0.0001，MMP9：P<0.0001)。详细信息见图4。

如图4所示，分别取四组小鼠的血管，通过Western Blot检测其中迁移相关蛋白MMP2和MMP9表达水平情况。使用ImageJ进行Western Blot条带的灰度值分析，绘制柱状图。各组数据以均数±标准差表示(n＝3)，****表示两组相比P<0.0001，***表示两组相比P<0.001，ns表示两组相比P>0.05。

2.3.GL42对AngII诱导小鼠肾脏和血管的病理学检测

2.3.1四组小鼠肾脏及血管的H&E染色

为了确认GL42对AngII诱导小鼠肾脏水肿程度和血管壁厚度的影响，通过H&E染色分析四组小鼠肾脏和主动脉组织病理切片，结果显示：与对照组相比，给予AngII处理组小鼠肾脏组织的水肿程度明显增加(P<0.0001)，血管壁增厚显著(P<0.05)；当给予GL42处理后，与对照组相比，AngII诱导的小鼠肾脏组织的水肿程度被显著减弱(P<0.001)，血管壁厚度降低(P<0.05)。详细信息见图5。

如图5所示，分别取四组小鼠的肾脏及血管石蜡包埋组织标本，进行H&E染色观察肾脏组织和血管壁的病理改变。A X400；C X400；标尺长度为20μm。使用ImageJ进行H&E染色水肿面积的扫描，将其分为5个等级，绘制散点图。各组数据以均数±标准差表示(n＝3)，****表示两组相比P<0.0001，***表示两组相比P<0.001，*表示两组相比P<0.05，ns表示两组相比P>0.05。

2.3.2四组小鼠肾脏及血管的Masson染色

为了确认GL42对AngII诱导小鼠肾脏和血管纤维化程度的影响，通过Masson染色分析四组小鼠肾脏和主动脉组织病理切片，结果显示：经Masson特殊染色可见AngII处理组小鼠肾脏组织和血管纤维增生明显。与对照组相比，给予AngII处理组小鼠肾脏间质胶原纤维和血管周围被染成蓝色，纤维化面积明显增加(P<0.0001)；当给予GL42处理后，与对照组相比，AngII诱导的小鼠肾脏组织和血管的纤维化程度被显著减弱(P<0.0001)。详细信息见图6。

如图6分别取四组小鼠的肾脏及血管石蜡包埋组织标本，进行Masson染色观察肾脏组织和血管壁的纤维化程度。A X400；C X400；标尺长度为20μm。使用ImageJ进行纤维化面积的扫描，绘制柱状图。各组数据以均数±标准差表示(n＝3)，****表示两组相比P<0.0001，ns表示两组相比P>0.05。

讨论和结论

申请人发现以Cav1.2多肽片段为结构基础设计出的多肽药物GL42能够降低AngII诱导的病理性小鼠肾脏纤维化相关蛋白Col-1和迁移相关蛋白MMP9表达水平，同时能够小鼠肾脏的纤维化水平和水肿程度。申请者还发现以Cav1.2多肽片段为结构基础设计出的多肽药物GL42能够降低AngII诱导的病理性小鼠血压升高，同时能够小鼠肾脏的血管壁厚度。

这些发现表明，多肽GL42有望成为治疗高血压和肾脏损伤的有效药物。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本申请的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本申请进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本申请权利要求书所限定的范围。