一种无胶原蛋白水解活性的角蛋白酶突变体

技术领域

本发明涉及一种无胶原蛋白水解活性的角蛋白酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

角蛋白酶是一类可催化角蛋白分解的水解酶，在洗涤剂、化妆品、制药、制革等行业都有广泛的应用。角蛋白酶广泛的应用场景也体现了它底物特异性差的特点，不仅对角蛋白有水解作用，对其他蛋白尤其是胶原蛋白同样有着较高的水解活性，这也限制了它在化妆品、制革等方面的应用，如在脱毛膏制品中，角蛋白酶的胶原蛋白水解活性会造成皮肤损伤，在皮革脱毛应用中也有着同样的问题。因此去除角蛋白酶的胶原蛋白活性对于实现角蛋白酶的商业价值有着重要的意义。

课题组前期已经构建获得一株角蛋白酶重组菌株，该菌株在15L发酵罐上可发酵获得426.60KU/mL以上的角蛋白酶水解活性的角蛋白酶产品(该角蛋白酶记载于Biotransformation of keratin waste to amino acids and active peptides basedon cell free catalysis文献中)，是目前文献已报道的重组角蛋白酶表达的最高水平。但是该角蛋白酶还有着较高的胶原蛋白水解活性，本发明通过对亲本酶的氨基酸位点进行饱和突变，筛选到一种胶原蛋白水解活性完全去除的角蛋白酶突变体。

发明内容

本发明提供了一种无胶原蛋白水解活性的角蛋白酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角蛋白酶的第221位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸，命名为KerZ1/M221I。

在本发明的一种实施方式中，编码所述亲本酶角蛋白酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶突变体KerZ1/M221I的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述角蛋白酶突变体KerZ1/M221I的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了编码上角蛋白酶突变体KerZ1/M221I的基因。

本发明还提供了携带上述基因的重组载体。

在本发明的一种实施方式中，以pP43NMK为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pP43NMK质粒。

本发明还提供了表达上述角蛋白酶突变体KerZ1/M221I，或携带上述基因，或携带上述重组载体的重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以细菌或真菌为宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WB600。

本发明提供了一种重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600为宿主细胞，以pP43NMK质粒为表达载体，表达了无胶原蛋白水解活性的角蛋白酶突变体KerZ1/M221I。

本发明还提供了一种去除角蛋白酶的胶原蛋白水解活性的方法，所述方法为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角蛋白酶的第221位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸。

本发明还提供了一种降解角蛋白的产品，所述降解角蛋白中含有上述角蛋白突变体KerZ1/M221I。

在本发明的一种实施方式中，所述降解角蛋白的产品包括：脱毛膏、皮革脱毛剂。

本发明还提供了一种降解角蛋白的方法，所述方法以含有角蛋白的物质为底物，利用角蛋白酶突变体KerZ1/M221I或上述重组细胞或上述重组枯草芽孢杆菌降解角蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述含有角蛋白的物质包括皮毛、弹性蛋白、鳞片、纤维。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞的构建方法为将携带编码所述突变体酶的基因的重组表达载体通过电击法或化学转化法转入宿主细胞。

本发明提供了一种上述角蛋白酶突变体KerZ1/M221I、上述基因、上述表达载体或上述宿主细胞在畜牧业、饲料业、制革业、化妆品业、医药业中的应用。

本发明还要求保护上述角蛋白酶突变体KerZ1/M221I、上述基因、上述表达载体或上述宿主细胞在降解皮肤、毛发、酪蛋白、弹性蛋白、毛料、指甲、鳞片、纤维、毛发角蛋白中的应用。

有益效果

本发明提供了一种角蛋白酶突变体KerZ1/M221I，该突变体的胶原蛋白水解活性测定结果显示，本发明的角蛋白酶突变体KerZ1/M221I无胶原蛋白水解活性，因此该角蛋白酶突变体在应用时可以避免胶原蛋白酶的损伤。例如在制革行业中，使用酶法脱毛，由于角蛋白酶为丝氨酸蛋白酶，基本上无底物特异性，在应用过程中容易无差别地将皮革表面的胶原蛋白水解造成皮革损伤，降低皮革的品质，而本发明的角蛋白酶突变体KerZ1/M221I无胶原蛋白水解活性，就不会对皮革造成任何损伤，因此，本发明提供的无胶原活性的角蛋白酶突变体KerZ1/M221I更具有应用价值与潜力。

附图说明

图1为不同突变体与对照菌的角蛋白酶水解活性和胶原蛋白水解活性的比较。

图2为角蛋白酶亲本与突变体KerZ1/M221I的枯草芽孢杆菌发酵上清SDS-PAGE凝胶电泳；其中M代表蛋白分子量标准，不同泳道代表不同的角蛋白酶，箭头指示目的蛋白条带位置。

具体实施方式

下述实施例中涉及的大肠杆菌JM109购自北纳生物；下述实施例中涉及的pP43NMK质粒购自丰晖生物；下述实施例中涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600记载于公开号为CN102492645A的专利申请文本中。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：酵母粉5g·L

LB固体培养基：酵母粉5g·L

枯草芽孢杆菌发酵培养基：蛋白胨20g·L

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

角蛋白水解活性测定方法：取50μL适当稀释的发酵上清液，加入150μL浓度为50mM的Gly/NaOH溶液作为缓冲液和100μL浓度为2.5％的水溶性角蛋白(购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，产品编码：K0043)作为底物，混匀后于60℃下反应20min；加入200μL4％(w/v)的三氯乙酸(TCA)终止反应，室温8000r/min离心3min。取上清200μL，加入1mL4％(w/v)的Na

酶活力单位定义：在60℃，pH 10条件下，OD

胶原蛋白水解活性测定方法：取1mg明胶，0.5mL Tris-HCl作为缓冲溶液，0.1mL适当稀释的发酵上清液，60℃反应30min，加入0.5mL 10％三氯乙酸终止反应。茚三酮显色法测定反应所释放的氨基酸数量，对照甘氨酸标准曲线计算酶活力；实验组3个平行，空白对照是在加入底物之前先加入反应终止剂TCA，其余操作同上。

酶活力单位定义为：在60℃，pH 7.5条件下，每分钟水解胶原产生相当于1μg甘氨酸的酶量为1个酶活力单位(U)。

实施例1：角蛋白酶突变体的构建

1、突变体的构建

(1)pP43NMK-ker重组载体的构建如专利US20210079371A1所述。

(2)突变体的构建

本发明以氨基酸序列为SEQ ID NO.2的角蛋白酶作为亲本酶，选择其8个氨基酸位点(第33位苏氨酸、第62位甘氨酸、第208位酪氨酸、第209位脯氨酸、第216位亮氨酸、第217天门冬氨酸、第219位苏氨酸、第221位甲硫氨酸)进行饱和突变改造。

根据角蛋白酶的序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示)，分别设计突变引物(如表1所示)，对pP43NMK质粒上的角蛋白酶基因进行定点饱和突变。

表1引物

PCR反应体系均为：PrimeSTAR Max Premix(2×)25μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA 1μL，加入双蒸水至50μL；

PCR产物扩增条件均为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃保温10min；

PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，确定扩增产物大小正确后，向10μL扩增产物中加入0.5μL甲基化模板消化酶(DpnI)，混匀后，于37℃条件下反应1.5h，将DpnI处理后的扩增产物转化大肠杆菌JM109感受态，转化产物涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基，于37℃培养8～10h。用LB液体培养基将LB固体上的单菌落都转移到摇菌管中，于37℃、220rpm培养2～3h后提取质粒，即获得含有不同突变基因的重组质粒。

实施例2：重组质菌的构建及角蛋白酶的表达

具体步骤如下所示：

(1)将实施例1获得的重组质粒分别转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600感受态，转化产物涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体培养基，于37℃培养10～12h，分别制备得到重组菌株将平板培养基上长出的单菌落接种至含有卡那霉素抗性的LB液体培养基的96深孔板中，于37℃条件下220rpm培养10～12h后，分别制备得到种子液；

(2)分别将步骤(1)得到的种子液按照5％的比例转接至含有枯草芽孢菌发酵培养基的96深孔板中，在37℃、220rpm条件下培养24h，获得含有各个突变体酶的发酵液。

(3)分别将发酵液于4℃5000rpm离心10min后，获得发酵上清液，及各个突变体酶的粗酶液。

(4)分别将步骤(3)得到的各个突变体的粗酶液进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果如图2所示(仅显示本申请的有益突变体的效果)。

结果显示：重组菌株WB600/pP43NMK-KerZ1/M221I可产生与原始菌分子量大小及浓度一样的角蛋白酶。

(5)分别检测各个突变体的粗酶液的角蛋白水解活性和胶原蛋白水解活性，结果如表2及图1所示：

表2：各个突变体的粗酶液中的角蛋白水解活性和胶原蛋白水解活性

结果显示：突变体KerZ1/M221I在保留59235U/mL角蛋白水解活性的情况下，完全消除了胶原蛋白水解活性，该突变体这一特性有利于其在脱毛膏、酶法制革方面的应用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。