一种RT-qPCR分析及其可视化转化的方法

技术领域

本发明涉及生命科学领域，具体涉及一种RT-qPCR分析及其可视化转化的方法。

背景技术

所谓实时荧光定量PCR技术(qPCR)，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术可用于临床疾病检验，包括新型冠状病毒，各型肝炎，艾滋病等传染病诊断和疗效评价；也可用于动物疾病检测包括禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、炭蛆芽孢杆菌的检测；还可用于食品安全检测包括食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌的检测，生物相关分子的定量。但qPCR数据处理过程较为繁琐，数据表达可视化程度不够高，不能立即对检测定性，实验数据趋势进行判定。所以急需一种可对原始数据进行可视化处理的方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种RT-qPCR分析及其可视化转化的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种RT-qPCR分析及其可视化转化的方法，其方法为将实时荧光定量PCR技术的数据结果计算处理后转换为灰阶图像输出，并将蛋白质免疫印迹技术的显影成像转换为灰阶图像输出。

较佳的，RT-qPCR分析及其可视化转化的方法包括以下步骤：

步骤a、原始数据获取，采用实时荧光定量PCR技术获取N个目标mRNA的N组Ct值数据，并采用蛋白质免疫印迹技术获取上述N个mRNA蛋白表达量的曝光显影成像；

每组上述Ct值数据由对照组的目的基因值、内参基因值，以及目标mRNA三次独立处理的三组目的基因值、内参基因值组成；对照组或目标mRNA每次处理的目的基因值、内参基因值各由三次PCR重复得到的数值组成；

蛋白质免疫印迹显影成像包括对照组蛋白质、N个mRNA的表达蛋白质的显影图像；

步骤b、ΔCt计算，在每组Ct值数据中，用目的基因值减去内参基因值，得到对照组的三个ΔCt值、一次独立处理的三个ΔCt值、二次独立处理的三个ΔCt值、三次独立处理的三个ΔCt值；

步骤c、ΔCt平均值计算，计算出每组Ct值数据中，对照组ΔCt平均值、一次独立处理的ΔCt值的平均值、二次独立处理的ΔCt值的平均值、三次独立处理的ΔCt值的平均值；

步骤d、ΔΔCt计算，用ΔCt值减去各自组的ΔCt平均值，得到对照组的三个ΔΔCt值、一次独立处理的三个ΔΔCt值、二次独立处理的三个ΔΔCt值、三次独立处理的三个ΔΔCt值；

步骤e、2^(-ΔΔCt)计算，对每个ΔΔCt做2^(-ΔΔCt)计算；

步骤f、2^(-ΔΔCt)均值计算，将对照组的三个2^(-ΔΔCt)值、一次独立处理的三个2^(-ΔΔCt)值、二次独立处理的三个2^(-ΔΔCt)值、三次独立处理的三个2^(-ΔΔCt)值，分别取平均值，得四个输出数值；

步骤g、将四个输出数值分别乘以一个系数作为灰度值，输出图片作为mRNA的表达量结果图；

步骤h、将四个输出的mRNA的表达量结果图按次序排列拼合为一张图片，得到qPCR分析结果可视化结果图；

步骤i、对N组中剩余目标mRNA的Ct值数据做步骤b到步骤h的相同处理，依次输出N个qPCR分析结果可视化结果图；

步骤j、依次将N个蛋白质免疫印迹显影成像通过Image J处理，得到每个个对应mRNA的一个对照组蛋白相对表达量、一次独立处理的蛋白相对表达量、二次独立处理的蛋白相对表达量、三次独立处理的蛋白相对表达量；

步骤k、将一组mRNA中的四个蛋白质相对表达量，乘以与步骤g中系数相同的数值作为灰度值，输出该mRNA的蛋白表达结果图；

步骤l、将步骤f中，一到三次独立处理的三个2^(-ΔΔCt)值的均值作为x，步骤j中一到三次独立处理的蛋白相对表达量作为y，按下式计算：

得Correl值；

步骤m、将Correl值乘以与步骤g中系数相同的数值作为灰度值，输出该mRNA与蛋白表达关联程度结果图；

步骤n、将对应的qPCR分析结果可视化结果图、蛋白表达结果图、mRNA与蛋白表达关联程度结果图、Correl值的数字按次序排列拼合为一张图片，得到蛋白质与mRNA的相关度分析结果可视化结果图；

步骤o、重复步骤k到步骤n的过程，依次输出N个蛋白质与mRNA的相关度分析结果可视化结果图。

较佳的，上述步骤h、步骤i中的qPCR分析结果可视化结果图，对照组、一次独立处理、二次独立处理、三次独立处理的mRNA的表达量结果图依次按从左到右的方式排列，并在其上方标注有说明文字。

较佳的，上述步骤n、步骤o中的蛋白质与mRNA的相关度分析结果可视化结果图，对照组、一次独立处理、二次独立处理、三次独立处理的蛋白表达结果图依次按从左到右的方式排列，在其上方排列有qPCR分析结果可视化结果图，下方排列有Correl值的数字和mRNA与蛋白表达关联程度结果图。

较佳的，上述方法按计算机语言汇编为计算机程序，存储在存储设备内，并被计算机处理器执行实现输出结果。

较佳的，上述方法按计算机语言汇编为计算机程序，存储在云服务内，并被云服务器处理器执行实现，通过网络通信向终端输送结果。

本发明的有益效果在于：计算效率高，计算结果精准，设计巧妙，与现有技术相比，能非常直观地看到mRNA在不同处理样本下的表达量变化，以及mRNA与蛋白之间的相关性强弱，大大提高了科研效率。

附图说明

图1：本发明的qPCR分析结果可视化结果图；

图2：本发明的蛋白质与mRNA的相关度分析结果可视化结果图；

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明：

实施例1：一种qPCR分析的可视化方法，其特征在于：方法为将实时荧光定量PCR技术的数据结果计算处理后转换为灰阶图像输出。

具体步骤为：

步骤a、原始数据获取，采用实时荧光定量PCR技术获取3个目标mRNA的3组Ct值数据；

每组上述Ct值数据由对照组的目的基因值、内参基因值，以及目标mRNA三次独立处理的三组目的基因值、内参基因值组成；对照组或目标mRNA每次处理的目的基因值、内参基因值各由三次PCR重复得到的数值组成；蛋白质免疫印迹显影成像包括对照组蛋白质、3个mRNA的表达蛋白质的显影图像；

3组Ct值数据如下表所示：

/>

步骤b、ΔCt计算，在每组Ct值数据中，用目的基因值减去内参基因值，得到对照组的三个ΔCt值、一次独立处理的三个ΔCt值、二次独立处理的三个ΔCt值、三次独立处理的三个ΔCt值；

步骤c、ΔCt平均值计算，计算出每组Ct值数据中，对照组ΔCt平均值、一次独立处理的ΔCt值的平均值、二次独立处理的ΔCt值的平均值、三次独立处理的ΔCt值的平均值；

步骤d、ΔΔCt计算，用ΔCt值减去各自组的ΔCt平均值，得到对照组的三个ΔΔCt值、一次独立处理的三个ΔΔCt值、二次独立处理的三个ΔΔCt值、三次独立处理的三个ΔΔCt值；

步骤e、2^(-ΔΔCt)计算，对每个ΔΔCt做2^(-ΔΔCt)计算；

步骤f、2^(-ΔΔCt)均值计算，将对照组的三个2^(-ΔΔCt)值、一次独立处理的三个2^(-ΔΔCt)值、二次独立处理的三个2^(-ΔΔCt)值、三次独立处理的三个2^(-ΔΔCt)值，分别取平均值，得四个输出数值；

步骤g、将四个输出数值分别乘以一个系数作为灰度值，输出图片作为mRNA的表达量结果图；

步骤h、将四个输出的mRNA的表达量结果图按次序排列拼合为一张图片，得到qPCR分析结果可视化结果图，如附图1所示，其中对照组、一次独立处理、二次独立处理、三次独立处理的mRNA的表达量结果图依次按从左到右的方式排列，并在其上方标注有说明文字；

步骤i、对3组中剩余目标mRNA的Ct值数据做步骤b到步骤h的相同处理，依次输出剩余2个qPCR分析结果可视化结果图。

实施例2：一种RT-qPCR分析及其可视化转化的方法，其特征在于：方法为将实时荧光定量PCR技术的数据结果计算处理后转换为灰阶图像输出，并将蛋白质免疫印迹技术的显影成像转换为灰阶图像输出。

具体步骤为：

步骤a、原始数据获取，采用实时荧光定量PCR技术获取2个目标mRNA的2组Ct值数据，并采用蛋白质免疫印迹技术获取上述2个mRNA蛋白表达量的曝光显影成像及其灰度值；

每组上述Ct值数据由对照组的目的基因值、内参基因值，以及目标mRNA三次独立处理的三组目的基因值、内参基因值组成；

对照组或目标mRNA每次处理的目的基因值、内参基因值各由三次PCR重复得到的数值组成；蛋白质免疫印迹显影成像包括对照组蛋白质、3个mRNA的表达蛋白质的显影图像及其灰度值；

2组Ct值数据和mRNA蛋白表达量的灰度值如下表所示：

/>

步骤b、ΔCt计算，在每组Ct值数据中，用目的基因值减去内参基因值，得到对照组的三个ΔCt值、一次独立处理的三个ΔCt值、二次独立处理的三个ΔCt值、三次独立处理的三个ΔCt值；

步骤c、ΔCt平均值计算，计算出每组Ct值数据中，对照组ΔCt平均值、一次独立处理的ΔCt值的平均值、二次独立处理的ΔCt值的平均值、三次独立处理的ΔCt值的平均值；

步骤d、ΔΔCt计算，用ΔCt值减去各自组的ΔCt平均值，得到对照组的三个ΔΔCt值、一次独立处理的三个ΔΔCt值、二次独立处理的三个ΔΔCt值、三次独立处理的三个ΔΔCt值；

步骤e、2^(-ΔΔCt)计算，对每个ΔΔCt做2^(-ΔΔCt)计算；

步骤f、2^(-ΔΔCt)均值计算，将对照组的三个2^(-ΔΔCt)值、一次独立处理的三个2^(-ΔΔCt)值、二次独立处理的三个2^(-ΔΔCt)值、三次独立处理的三个2^(-ΔΔCt)值，分别取平均值，得四个输出数值；

步骤g、将四个输出数值分别乘以一个系数作为灰度值，输出图片作为mRNA的表达量结果图；

步骤h、将四个输出的mRNA的表达量结果图按次序排列拼合为一张图片，得到qPCR分析结果可视化结果图，如附图1所示，其中对照组、一次独立处理、二次独立处理、三次独立处理的mRNA的表达量结果图依次按从左到右的方式排列，并在其上方标注有说明文字；

步骤i、对2组中剩余目标mRNA的Ct值数据做步骤b到步骤h的相同处理，依次输出剩余的一个qPCR分析结果可视化结果图。

步骤j、依次将2个蛋白质免疫印迹显影成像通过Image J处理，得到每个个对应mRNA的一个对照组蛋白相对表达量、一次独立处理的蛋白相对表达量、二次独立处理的蛋白相对表达量、三次独立处理的蛋白相对表达量；

步骤k、将一组mRNA中的四个蛋白质相对表达量，乘以与步骤g中系数相同的数值作为灰度值，输出该mRNA的蛋白表达结果图；

步骤l、将步骤f中，一到三次独立处理的三个2^(-ΔΔCt)值的均值作为x，步骤j中一到三次独立处理的蛋白相对表达量作为y，按下式计算：

得Correl值；

步骤m、将Correl值乘以与步骤g中系数相同的数值作为灰度值，输出该mRNA与蛋白表达关联程度结果图；

步骤n、将对应的qPCR分析结果可视化结果图、蛋白表达结果图、mRNA与蛋白表达关联程度结果图、Correl值的数字按次序排列拼合为一张图片，得到蛋白质与mRNA的相关度分析结果可视化结果图，如图2所示，对照组、一次独立处理、二次独立处理、三次独立处理的蛋白表达结果图依次按从左到右的方式排列，在其上方排列有qPCR分析结果可视化结果图，下方排列有Correl值的数字和mRNA与蛋白表达关联程度结果图；

步骤o、重复步骤k到步骤n的过程，依次输出2个蛋白质与mRNA的相关度分析结果可视化结果图。

最后应说明的是：以上上述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。