甲烷氧化菌群的富集驯化及应用方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种甲烷氧化菌群的富集驯化方法和稻田甲烷减排应用方法。

背景技术

目前稻田甲烷减排的措施主要包括改良水稻种植技术、施用有机肥及土壤改良剂、选择通气组织不发达的水稻栽培品种等，然而，这些方法的实施时期和程度是影响减排效果和水稻产量的重要因素，如果选择不当不仅会使减排效果不理想，甚至会降低水稻产量。现有的甲烷氧化菌工业化培养系统及培养方法仅局限于煤矿使用，培养获得的甲烷氧化菌由于为外源菌，难以适应稻田环境，耐受性低，生存能力较差，在稻田中难以形成种群优势，用于稻田甲烷减排效果不佳。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种甲烷氧化菌群的富集驯化及应用方法，以富含甲烷的环境样品为甲烷氧化菌菌种来源，仅以甲烷为唯一碳源，利用选择性富集培养基NMS培养基，活化富集富甲烷环境样品的土著微生物混合菌群，获得甲烷氧化菌群富集液，并进一步通过由NMS培养基添加不同体积比例的稻田土壤上清液配制的稻田驯化培养液对甲烷氧化菌群富集液进行驯化培养，获得应用于稻田甲烷减排的甲烷氧化菌群；利用煤矿渣富集驯化获得的甲烷氧化菌群MOPF-1接种于稻田后在分蘖期、拔节孕穗期、抽穗扬花期和成熟期的稻田甲烷排放量分别为2.86mg/m

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种甲烷氧化菌群的富集驯化方法，通过对富甲烷环境样品中微生物进行富集活化获得甲烷氧化菌群富集液，再通过稻田土壤上清液和NMS培养基混合制成的稻田驯化培养液进行驯化培养，在驯化培养期间逐级提高稻田驯化培养液中稻田上清液的体积比，以逐步提高其对稻田环境的适应性，制备得到甲烷氧化菌群。

所述的富甲烷环境样品包括：煤矿渣、二沉池污泥。

所述的甲烷氧化菌群包括：以煤矿渣为富甲烷环境样品得到的克劳斯氏菌

(Cloacibacterium)、甲基孢囊菌(Methylocystis)、保所杆菌(Emticicia)、金黄杆菌(Chryseobacterium)、固氮螺菌(Azospirillum)和甲基单胞菌(Methylomonas)，六者的相对丰度依次为29.44％、23.44％、20.62％、7.67％、5.68％、1.10％；以及以二沉池污泥为富甲烷环境样品得到的甲基孢囊菌(Methylocystis)、克劳斯氏菌(Cloacibacterium)、甲基单胞菌(Methylomonas)、潜水杆菌(Phreatobacter)、黄杆菌属(Flavorbacterium)，五者的相对丰度依次为31.78％、24.45％、23.43％、5.06％、3.36％。

所述的甲烷氧化菌群富集液，通过以下方式制备得到：

步骤1，取富甲烷环境样品，通入体积比为1:1的甲烷和氧气的混合气体，30℃，密闭驯化1周以实现甲烷氧化菌株复壮。

步骤2，将步骤1得到的已复壮的富甲烷环境样品接种于选择性富集培养基NMS培养基，不添加其他有机碳源，通入体积比为1:1的甲烷和空气的混合气体，进行富集培养，每隔24h进行菌液浓度OD

步骤3，将步骤2得到的生长至对数期的甲烷氧化菌群富集液转接到稻田驯化培养液中，向包含甲烷氧化菌群富集液和稻田驯化培养液的混合液中通入体积比为1:1的甲烷和空气的混合气体，进行驯化培养，驯化培养分4个阶段，第1阶段稻田驯化培养液中稻田土壤上清液的体积比为25％，第2、3阶段逐级提高25％，第4阶段稻田驯化培养液中稻田土壤上清液的体积比为95％，得到甲烷氧化菌群。

所述的稻田驯化培养液，由NMS培养基添加不同体积比例的稻田土壤上清液配制，稻田土壤上清液添加量占总体积比为25-95％。

所述的稻田土壤上清液，由稻田土壤按质量浓度(W/V)为2％加入无菌水中，30℃、150rpm，恒温振荡10min，静置30min后取上层清液获得。

所述的NMS培养基的组分及浓度含量为：MgSO

所述的磷酸盐溶液的组分及浓度含量为：KH

所述的微量元素溶液的组分及浓度含量为：Na

本发明涉及一种基于上述甲烷氧化菌群的稻田甲烷减排应用方法，在水稻秧苗移栽前，把根部浸入生长至对数期的甲烷氧化菌群后进行水稻秧苗移栽，并在分蘖期、拔节孕穗期和抽穗扬花期配合肥料一起浇灌。

所述的甲烷氧化菌群，细胞密度为10

所述的浇灌，采用细胞密度为10

技术效果

本发明通过稻田驯化培养液对甲烷氧化菌富集液进一步进行驯化培养，在驯化培养期间逐级提高稻田驯化培养液中稻田上清液的体积比，逐步提高其对稻田环境的适应性。本发明利用煤矿渣富集驯化获得的甲烷氧化菌群MOPF-1接种于稻田驯化培养液后3天即达到对数生长中期，OD

附图说明

图1为甲烷氧化菌群MOPF-1的组成(属水平)示意图；

图2为甲烷氧化菌群MOPF-2的组成(属水平)示意图；

图3为甲烷氧化菌群富集液-1(驯化前)与甲烷氧化菌群MOPF-1(驯化后)接种稻田土壤上清液的生长曲线示意图；

图4为甲烷氧化菌群富集液-2(驯化前)与甲烷氧化菌群MOPF-2(驯化后)接种稻田土壤上清液的生长曲线示意图；

图5为接种与未接种甲烷氧化菌群MOPF-1的水稻土壤甲烷氧化气相色谱分析示意图；

图6为接种与未接种甲烷氧化菌群MOPF-2的水稻土壤甲烷氧化气相色谱分析示意图；

图7为接种与未接种甲烷氧化菌群MOPF-1、MOPF-2的水稻土壤的甲烷体积变化图；

图8为接种与未接种甲烷氧化菌群MOPF-1、MOPF-2稻田在不同水稻种植时期的甲烷排放量示意图；

图9为接种与未接种甲烷氧化菌群MOPF-1、MOPF-2稻田的水稻产量示意图；

图10为甲烷氧化菌富集液-1、甲烷氧化菌富集液-2的菌液PCR琼脂糖凝胶电泳结果图。

具体实施方式

实施例1

如图1所示，为本实施例涉及一种以表层煤矿渣为菌种来源的甲烷氧化菌群MOPF-1的制备及应用，包括以下步骤：

步骤1)取四川省泸州市凉水井煤矿的表层煤矿渣，过2mm分样筛，置于真空干燥器中，用真空泵抽50％空气，注入50％甲烷，保证甲烷与空气的体积比为1:1，30℃，密闭驯化1周以实现煤矿渣的甲烷氧化菌株复壮。

步骤2)以步骤1复壮煤矿渣为接种物进行富集培养，具体包括：

2.1)取4g复壮煤矿渣接种到40mL已灭菌的选择性富集培养基NMS培养基，30℃、150rpm，恒温振荡2h，静置10min。取4mL静置后的煤矿渣上清液作为种子接入装有40mL NMS培养基的100mL灭菌厌氧瓶中，用硅胶塞密封。用注射器抽30mL空气，再用灭菌注射器注入30mL甲烷，使甲烷：空气体积比为1:1，将上述灭菌厌氧瓶置于恒温摇床，30℃，180rpm培养，每隔24h进行菌液浓度OD

2.2)取4mL第5次富集培养后的菌液接种于装有40mL NMS培养基的100mL灭菌厌氧瓶中，用硅胶塞密封。用注射器抽30mL空气，再用灭菌注射器注入30mL甲烷，使甲烷：空气体积比为1:1，30℃，180rpm培养，24h后用注射器取2mL厌氧瓶内气体，利用气相色谱仪检测甲烷浓度，检测结果表明第2天的甲烷氧化速率可达90.88％。

2.3)取第5次富集培养第3天的菌液进行菌液PCR，扩增甲烷氧化相关基因pmoA。扩增反应体系为25μL，含有2μL菌液，12.5μL PowerPol 2×PCR Mix(Abclonal,RK20719)，0.5μL上游引物A189(5′-GGNGACTGGGACTTCTGG-3′)，0.5μL下游引物mb661(5′-CCGGMGCAACGTCYTTACC-3′)，9.5μL ddH

上述测序结果显示，第5次富集培养的菌液经菌液PCR扩增得到500bp左右条带(图10)，将PCR产物测序后，共476bp，具体序列如Seq ID No.1所示。

经Blast比对，相似度最高的为Uncultured bacterium clone pMT12E的甲烷氧化相关基因pmoA片段，相似度为99.34％，表明第5次富集培养的菌液中存在甲烷氧化菌，故此认为富集培养完成，获得甲烷氧化菌群富集液-1。

所述的NMS培养基的配比如下：MgSO

5.68；微量元素溶液组成为(g/L):Na

MnCl

Na

步骤3)取4mL生长至对数期的上述甲烷氧化菌富集液-1转接到装有40mL稻田土壤上清液和NMS培养基混合制成的稻田驯化培养液的100mL灭菌厌氧瓶中，按表1所示驯化步骤和相应的驯化条件进行驯化，在每个驯化步骤，用注射器抽30mL空气，再用灭菌注射器注入30mL甲烷，使甲烷：空气＝1:1，30℃，180rpm培养，连续驯化培养4次，获得甲烷氧化菌群MOPF-1。

表1驯化培养阶段及驯化条件

本实施例中，甲烷氧化菌群富集液-1在逐步驯化过程中，各驯化阶段的菌液浓度OD

表2甲烷氧化菌群富集液-1驯化过程甲烷氧化率

相比甲烷氧化菌群富集液在选择富集培养基NMS培养基中的甲烷氧化速率，菌群在稻田驯化培养液中的甲烷氧化速率有所降低，但仍显示出一定的甲烷降解效果，且随着逐步驯化，甲烷氧化菌群富集液接种稻田驯化培养液后第3天的OD

取4mL生长至对数期的上述甲烷氧化菌群MOPF-1接种于40mL稻田驯化培养液中，用注射器抽30mL空气，再用灭菌注射器注入30mL甲烷，使甲烷：空气＝1:1，30℃，180rpm培养，每隔24h进行菌液浓度OD

步骤4)取40g上海市浦东新区实际稻田土壤于厌氧瓶中，投加40mL上述甲烷氧化菌群MOPF-1，以未使用本发明的甲烷氧化菌群MOPF-1的稻田土壤为空白样，向厌氧瓶中充入甲烷，使甲烷：空气＝1:1，检测甲烷氧化菌群MOPF-1在水稻土壤中的甲烷氧化速率，经检测，接种甲烷氧化菌群MOPF-1的水稻土壤甲烷氧化速率为21.11mL/d，未接种的水稻土壤甲烷氧化速率为4.608mL/d，较未接种的水稻土壤相比，甲烷氧化率提高了55％(图5、图7)。

取生长至对数期的上述甲烷氧化菌群MOPF-1离心收集后，送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行16S rDNA扩增子测序。使用天根磁珠法通用型基因组提取试剂盒提取DNA，选择16S rRNA基因的V3-V4区域作为扩增和测序的目的片段，引物序列为:341F:CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG；805R:GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAG AATTCCA。PCR产物用琼脂糖凝胶进行电泳，选择长度在400-450bp的条带，使用GeneJET胶回收试剂盒进行回收纯化。使用NEB DNA建库试剂盒进行DNA文库构建，经Qubit 2.0仪器进行定量和质量检验合格后，采用Illumina MiSeq测序平台进行进行16S rDNA扩增子测序。将测序得到的原始数据剔除非特异性扩增序列及嵌合体之后获得有效序列，按照有效序列之间的距离进行聚类，根据序列间的相似性划分不同的运算分类单元(OTU)，对97％相似水平下的运算分类单元进行生物信息统计分析。利用RDP Classifier贝叶斯算法对运算分类单元进行物种分类，统计甲烷氧化菌群MOPF-1在不同分类层级水平上的群落组成。表1为甲烷氧化菌群MOPF-1的属水平物种丰度，根据属水平物种丰度绘制甲烷氧化菌群MOPF-1属水平物种组成扇形图，如图1所示。从图1中可以看出，该菌群在属水平上的组成主要为Cloacibacterium、Methylocystis、Emticicia、Chryseobacterium、Azospirillum和Methylomonas，六者的相对丰度依次为29.44％、23.44％、20.62％、7.67％、5.68％、1.10％。

表1甲烷氧化菌群MOPF-1的属水平物种丰度

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取生长至对数期的上述甲烷氧化菌群MOPF-1接种于灭菌的MNS培养基中，甲烷：空气＝1:1，30℃，180r/min摇培至10

结果表明，接种甲烷氧化菌群MOPF-1后，分蘖期、拔节孕穗期、抽穗扬花期和成熟期的稻田甲烷排放量分别为2.86mg/m

4.25t/hm

实施例2

从上海市城投污水处理厂二沉池收取的浓缩污泥为菌种进行富集驯化培养，实施方式与实施例1相同。

甲烷氧化菌群富集液-2经菌液PCR扩增得到500bp左右条带(图10)，将PCR产物测序后，共470bp，具体序列如Seq ID No2.所示。

经Blast比对，相似度最高的为Uncultured bacterium clone TA-R34的甲烷氧化相关基因pmoA片段，相似度为94.28％，表明第5次富集培养的菌液中存在甲烷氧化菌。

表3甲烷氧化菌群富集液-2驯化过程甲烷氧化率

表2为甲烷氧化菌群MOPF-2的属水平物种丰度，根据属水平物种丰度绘制甲烷氧化菌群MOPF-2属水平物种组成扇形图，如图2所示。从图2中可以看出，该菌群在属水平上的组成主要为Methylocystis、Cloacibacterium、Methylomonas、Phreatobacter和Flavobacterium，五者的相对丰度依次为31.78％、24.46％、23.43％、5.06％、3.36％。

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取4mL生长至对数期的上述甲烷氧化菌群MOPF-2接种于40mL稻田驯化培养液中，用注射器抽30mL空气，再用灭菌注射器注入30mL甲烷，使甲烷：空气＝1:1，30℃，180rpm培养，每隔24h进行菌液浓度OD

取40g上海市浦东新区实际稻田土壤于厌氧瓶中，投加40mL上述甲烷氧化菌群MOPF-2，以未使用本发明的甲烷氧化菌群MOPF-2的稻田土壤为空白样，向厌氧瓶中充入甲烷，使甲烷：空气＝1:1，检测甲烷氧化菌群MOPF-2在水稻土壤中的甲烷氧化速率，经检测，接种甲烷氧化菌群MOPF-2的水稻土壤甲烷氧化速率为22.16mL/d，较未接种的水稻土壤相比，甲烷氧化率提高了58.52％(图6、图7)。

取生长至对数期的上述甲烷氧化菌群MOPF-2接种于灭菌的MNS培养基中，甲烷：空气＝1:1，30℃，180r/min摇培至10

与现有技术相比，本方法利用煤矿渣富集驯化获得的甲烷氧化菌群MOPF-1接种于稻田驯化培养液后3天即达到对数生长中期，OD

上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。