经修饰的mRNA分子及相关产品和用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及经修饰的mRNA分子及相关产品和用途。

背景技术

角膜是眼部最重要的屈光介质，对良好视力的形成具有重要意义。作为重要的结构屏障，角膜可保护眼内组织免受外界环境因素侵害，但由于其位置的特殊性，极易遭受化学伤、热灼伤等各类损伤的影响。其中，角膜碱烧伤，由于碱性化学物质的强脂溶性，可持续性渗透破坏角膜组织，引起剧烈的炎症反应，导致角膜缘干细胞的丢失缺损及角膜组织的重度损伤，常引起角膜的溶解甚至穿孔，是世界范围内的主要致盲原因。

虽然目前临床治疗角膜碱损伤的方法各不相同，主要是抑制过度的炎症反应以及促进角膜上皮的修复，但很少有方法能达到综合的治疗效果。例如，皮质类固醇滴眼液在抑制炎症方面发挥着重要作用，但长期使用可能会引起眼部并发症，损害角膜完整性，甚至导致角膜融解。羊膜移植因其良好的抗炎作用在临床应用广泛，但羊膜的快速溶解和剥离在一定程度上限制角膜的修复。角膜的损伤晚期一般采用同种异体角膜移植来部分恢复角膜的结构和功能，但角膜供体资源有限，术后排斥反应往往导致远期预后效果不佳。因此，角膜损伤的修复过程因其多维性和复杂性，亟需探寻有效且综合的新型治疗方法。

近年来，间充质干细胞(mesenchymal stem/stromal cells,MSCs)以其独特的生物学特性和潜在的临床应用价值在组织工程和再生医学研究中发挥着重要作用。MSCs具有重要的免疫调节和抗炎特性，在角膜碱烧伤动物结膜下注射MSCs被认为有利于促进角膜创面愈合，抑制基质炎症、新生血管和纤维化。在MSCs中，脂肪来源间充质干细胞(adiposederived mesenchymal stem cells,ADSCs)因其广泛的组织来源以及低免疫原性而备受青睐。尽管MSCs在治疗角膜碱烧伤中已被证明是有效的，但天然间充质干细胞因其组织特异性和病灶靶向性差而受到限制。修复碱烧伤角膜不仅需要一般的抗炎治疗，还需要对包括角膜上皮、基质、神经，甚至角膜缘在内的各部分组织进行全面的修复，而这难以通过单纯的MSCs治疗来实现。角膜神经和角膜缘干细胞(limbal stem cells,LSCs)是角膜形态和功能全面恢复的重要因素，MSCs对这两者的作用鲜有报道。如何对MSCs进行修饰来提高其疗效，从而更有效地减少急性期损伤进展并避免后期手术治疗，是一个值得研究的方向。

为了提高治疗效果，往往根据疾病特点，通过外源性基因转染对MSCs进行基因修饰，以增强其特异性功能。值得注意的是，基于mRNA的蛋白质传递在再生医学领域得到了广泛的应用。而为了提高mRNA的稳定性，消除插入突变的风险，合成化学修饰mRNA(syntheticchemical modified mRNA,modRNA)受到了广泛关注。modRNA作为一种新型高效的基因传递载体及核酸治疗方式，由于其强有力的瞬时基因表达，最小的免疫原性，以及高效且剂量可控蛋白质的提供，可以在体细胞重编程中实现多能性。在我们之前的研究中，通过将modRNA技术与细胞治疗相结合，验证了细胞介导的modRNA递送可能是下肢缺血、骨缺损或脂肪移植等的可替代治疗策略，证明了基于细胞的modified mRNAs递送系统的可行性。

本研究以胰岛素家族成员胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF1)为靶基因，改善MSCs对于受损角膜的内在修复性。IGF1是一种多功能细胞因子，具有广泛的生物活性，在维持和调节细胞的生长、增殖、分化、成熟和再生方面发挥着重要作用。此外，IGF1是一种重要的神经营养因子，可促进周围神经损伤后的神经再生和修复。在眼科，IGF1及其受体已被证实表达于人角膜和结膜上皮细胞表面。但目前，关于IGF1的modRNA在眼表的应用和治疗机制尚未见报道。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供经修饰的mRNA分子及相关产品和用途，以期解决现有技术中存在的问题。

为实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案。

本发明的第一方面保护经修饰的mRNA分子，所述经修饰的mRNA分子包含编码IGF1的编码区，所述经修饰的mRNA分子中至少一个尿嘧啶被替换为N

在某些实施方式中，所述合成IGF1-mRNA分子从5’到3’方向包含5’-帽子结构、5’-UTR、IGF1编码区、3’-UTR、3’PolyA尾。

在某些实施方式中，所述经修饰的mRNA在下列部分中包含N

IGF1编码区；

或，IGF1编码区和5’-UTR；

或，IGF1编码区、5’-UTR和3’-UTR。

在某些实施方式中，所述5’-UTR、IGF1编码区、3’-UTR中的尿嘧啶(U)均被替换为N

在某些实施方式中，所述5’帽子结构具有m

在某些实施方式中，所述5’-UTR包含A基因的5’-UTR或其同源物、片段或变体，所述A基因选自β-珠蛋白(HBB)基因、热休克蛋白70(Hsp70)基因、轴丝动力蛋白重链2(DNAH2)基因和17β-羟基类固醇脱氢酶4(HSD17B4)基因中。例如，变体序列可以与相应基因的野生型5’-UTR序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％的序列同一性。

优选地，所述5’-UTR为17β-羟基类固醇脱氢酶4(HSD17B4)基因的5’-UTR或其同源物、片段或变体。

更优选地，所述5’-UTR对应的DNA编码序列包含如SEQ ID NO.1所示的序列。

在某些实施方式中，所述3’-UTR包含B基因的3’-UTR或其同源物、片段或变体，所述B基因选自白蛋白(ALB)基因、α-珠蛋白基因、β-珠蛋白(HBB)基因、酪氨酸羟化酶基因、热休克蛋白70(Hsp70)基因、脂氧合酶基因和胶原蛋白α基因中的一种。例如，变体序列可以与相应基因的野生型3’-UTR序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％的序列同一性。

更优选地，所述3’-UTR对应的DNA编码序列包含如SEQ ID No.2所示的序列。

在某些实施方式中，所述polyA尾的长度为100～150个核苷酸。

优选地，所述polyA尾的长度可以为100～125个核苷酸，也可以为110～135个核苷酸，也可以为125～150个核苷酸。在某个优选的实施方式中，为120个核苷酸。

在某些实施方式中，所述IGF1编码区对应的DNA编码序列包含如SEQ ID No.3所示的序列。

在某些实施方式中，包括如下的至少一项：

1)如SEQ ID No.6所示序列，且其中尿嘧啶均被替换为N

2)与1)的核苷酸序列编码相同序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而与1)的核苷酸序列不同的序列。

本发明的第二方面保护与如上文所述的经修饰的mRNA分子相关的生物材料，包括如下中的至少一项：

1)编码如上文所述的经修饰的mRNA分子的多核苷酸；

2)含有1)所述的多核苷酸的重组表达载体。

本发明的第三方面保护一种IGF1基因修饰的间充质干细胞，所述IGF1基因修饰的间充质干细胞过表达IGF1基因，优选地，通过转染如上文所述的经修饰的mRNA分子获得。

本发明中，经修饰的mRNA分子转染间充质干细胞后，转染效率高并能实现IGF1基因的高表达。

在某些实施方式中，所述间充质干细胞选自脂肪源性间充质干细胞、骨髓源性间充质干细胞、脐带源性间充质干细胞、胎盘源性间充质干细胞、角膜基质源性间充质干细胞、角膜缘源性间充质干细胞中的一种或多种。

优选地，所述间充质干细胞为脂肪源性间充质干细胞。

本发明的第四方面保护一种药物组合物，包含如上文所述的经修饰的mRNA分子或如上文所述的生物材料或如上文所述的IGF1基因修饰的间充质干细胞，以及药学上可接受的辅料。

在某些实施方式中，所述可接受的辅料包括载体、介质，例如无菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂(抗坏血酸等)、缓冲剂(磷酸、枸橼酸、其它的有机酸等)、防腐剂、表面活性剂(PEG、Tween等)、螯合剂(EDTA等)、粘合剂等。而且，也可含有其它低分子量的多肽；血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质；甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸等氨基酸；多糖和单糖等糖类或碳水化物；甘露糖醇或山梨糖醇等糖醇。当制备用于注射的水溶液时，例如生理盐水、含有葡萄糖或其它的辅助药物的等渗溶液，如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠，可并用适当的增溶剂例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇，PEG等)、非离子表面活性剂(吐温80，HCO-50)等。

在某些实施方式中，所述药物组合物可以适应于任何形式的给药方式，可以是经口、鼻、直肠、静脉、胃肠外给药等。药物组合物可以制成注射剂、注射用无菌粉末、片剂、丸剂、胶囊、锭剂、醑剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、或栓剂。

在某些实施方式中，所述药物组合物还可与其他治疗手段结合使用，所述其他手段包括手术、放疗、化疗、靶向治疗。

在某些实施方式中，所述药物组合物主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。

本发明的第五方面保护如上文所述的经修饰的mRNA分子或如上文所述的生物材料或如上文所述的IGF1基因修饰的间充质干细胞或如上文所述的药物组合物的用途，包括如下至少一项中的用途：

1)制备预防和/或治疗角膜损伤或角膜疾病的产品；

2)制备促进角膜创面愈合的产品；

3)制备促进角膜神经纤维形成的产品；

4)制备促进角膜缘干细胞增殖的产品；

5)制备促进角膜缘干细胞迁移的产品；

6)制备抑制角膜血管生成的产品。

在某些实施方式中，所述角膜损伤包括化学烧伤、热烧伤。

在某些实施方式中，所述角膜疾病包括暴露性角膜病变或神经营养性角膜炎。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)该技术发明了一种适宜的治疗产品ADSC

2)过表达modIGF1的间充质干细胞，可促进角膜神经的修复再生，并调节角膜缘干细胞命运，可以作为损伤角膜的一种治疗手段发挥组织多维度修复再生作用。

附图说明

图1显示为本发明实施例1中ADSCs内可实现modRNA高效率转染。A图为转染后ADSCs从D1到D6的每日GFP信号动力学代表性荧光图像，比例尺＝50μm；B图为流式细胞术分析转染后24h的转染效率统计图；C图为流式细胞术分析转染后24h的平均荧光强度统计图；D图为转染24h后IGF1 mRNA表达水平统计图；E图modIGF1转染到ADSCs后，利用ELISA检测培养基中新生成IGF1蛋白的统计图。CTR，正常ADSCs对照组；ADSC

图2显示为本发明实施例1中的结膜下注射ADSC

图3显示为本发明实施例2中的ADSC

图4显示为本发明实施例3中的ADSC

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

目前临床治疗角膜碱损伤的方法主要是抑制过度的炎症反应以及促进角膜上皮的修复，但很少有方法能达到综合的治疗效果。角膜损伤的修复过程因其多维性和复杂性，亟需探寻有效且综合的新型治疗方法。

为了上述目的，本发明提供经修饰的mRNA分子，为过表达IGF1 modified mRNA(IGF1modRNA)。

为了上述目的，本发明还提供过表达IGF1 modified mRNA(IGF1 modRNA)的间充质干细胞(ADSC

为了上述目的，本发明还提供过表达IGF1 modified mRNA(IGF1 modRNA)的间充质干细胞在预防和/或治疗角膜损伤或角膜疾病的产品中的用途。

本发明通过将过表达IGF1 modified mRNA的ADSCs(ADSC

本发明的目的之一在于提供经修饰的mRNA分子，所述经修饰的mRNA分子包含编码IGF1的编码区，所述经修饰的mRNA分子中至少一个尿嘧啶被替换为N

本发明发现，经N

本发明发现，经修饰的mRNA分子(IGF1 modRNA)进行基因递送不会带来不良和潜在有害的染色体整合风险；mRNA递送比DNA转染在被细胞摄取的总量和靶细胞数量上都更有效率；mRNA在到达细胞质后几乎立即指导蛋白质的表达。

本发明中，所述合成IGF1-mRNA分子从5’到3’方向包含5’-帽子结构、5’-UTR、IGF1编码区、3’-UTR、3’PolyA尾。优选地，所述经修饰的mRNA在下列部分中包含经修饰的核苷酸：

IGF1编码区；

或，IGF1编码区和5’-UTR；

或，IGF1编码区、5’-UTR和3’-UTR。

更优选地，所述5’-帽子结构、5’-UTR、IGF1编码区、3’-UTR中的尿嘧啶(U)均被N

本发明中，所述5’帽子结构具有m

本发明中，所述5’-UTR包含A基因的5’-UTR或其同源物、片段或变体，所述A基因选自β-珠蛋白(HBB)基因、热休克蛋白70(Hsp70)基因、轴丝动力蛋白重链2(DNAH2)基因和17β-羟基类固醇脱氢酶4(HSD17B4)基因中。例如，变体序列可以与相应基因的野生型5’-UTR序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％的序列同一性。优选地，所述5’-UTR为17β-羟基类固醇脱氢酶4(HSD17B4)基因的5’-UTR或其同源物、片段或变体。5’-UTR序列对于蛋白质表达最关键。在某个优选的实施方式中，所述5’-UTR对应的DNA编码序列包含如SEQ ID NO.1所示的序列。

本发明中，所述3’-UTR包含B基因的3’-UTR或其同源物、片段或变体，所述B基因选自白蛋白(ALB)基因、α-珠蛋白基因、β-珠蛋白(HBB)基因、酪氨酸羟化酶基因、热休克蛋白70(Hsp70)基因、脂氧合酶基因和胶原蛋白α基因中的一种。例如，变体序列可以与相应基因的野生型3’-UTR序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％的序列同一性。3’-UTR是mRNA半衰期的关键驱动力。大多数影响mRNA稳定性的顺式作用元件通常位于3’-UTR。在某个优选的实施方式中，所述3’-UTR对应的DNA编码序列包含如SEQID No.2所示的序列。

本发明中，所述polyA尾的长度为100～150个核苷酸。优选地，所述polyA尾的长度可以为100～125个核苷酸，也可以为110～135个核苷酸，也可以为125～150个核苷酸。在某个优选的实施方式中，为120个核苷酸。

本发明中，所述IGF1编码区对应的DNA编码序列包含如SEQ ID No.3所示的序列。

本发明中，所述经修饰的mRNA分子包括如下的至少一项：

1)如SEQ ID No.6所示，且其中尿嘧啶均被替换为N

2)与1)的核苷酸序列编码相同序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而与1)的核苷酸序列不同的序列。

本发明的目的之二在于提供一种IGF1基因修饰的间充质干细胞，所述IGF1基因修饰的间充质干细胞过表达IGF1基因，优选地，通过转染如上文所述的经修饰的mRNA分子获得。

本发明发现，间充质干细胞(ADSCs)可耐受脂质体介导的IGF1 modRNA转染，经流式细胞学检测和荧光显微镜观察，IGF1 modRNA转染ADSCs后可在很短的时间内达到表达的峰值，且转染效率高；经实时定量PCR检测和酶联免疫吸附测定(ELISA)检测，所分泌的IGF1表达和蛋白水平均显著升高，表明ADSCs可经IGF1的大量分泌发挥作用。

本发明的目的之三在于提供与如上文所述的经修饰的mRNA分子相关的生物材料，包括如下中的至少一项：

1)编码如上文所述的经修饰的mRNA分子的多核苷酸；

2)含有1)所述的多核苷酸的重组表达载体。

本发明的目的之四在于提供一种药物组合物，包含如上文所述的经修饰的mRNA分子或如上文所述的生物材料或如上文所述的IGF1基因修饰的间充质干细胞，以及药学上可接受的辅料。

本发明的目的之五在于提供如上文所述的经修饰的mRNA分子或如上文所述的生物材料或如上文所述的IGF1基因修饰的间充质干细胞或如上文所述的药物组合物的用途，包括如下至少一项中的用途：1)制备预防和/或治疗角膜损伤或角膜疾病的产品；2)制备促进角膜创面愈合的产品；3)制备促进角膜神经纤维形成的产品；4)制备促进角膜缘干细胞增殖的产品；5)制备促进角膜缘干细胞迁移的产品；6)制备抑制角膜血管生成的产品。在某些实施方式中，所述角膜损伤包括化学烧伤、热烧伤。在某些实施方式中，所述角膜疾病包括暴露性角膜病变或神经营养性角膜炎。

本发明通过转染IGF1 modified mRNA制备过表达IGF1蛋白的ADSCs(ADSC

本发明中，通过小鼠角膜碱烧伤模型的构建和连续的临床评估，表明ADSC

本发明中，组织化学染色结果显示ADSCs确实可促进角膜创伤愈合，然而转染了modIGF1的ADSCs具有更好的损伤角膜修复能力，ADSC

本发明中，通过角膜缘干细胞(LSCs)与modRNA所修饰ADSCs的共培养，结果表明ADSC

本发明将modRNA技术与干细胞治疗相结合的创新性治疗产品ADSC

尽管本发明中利用小鼠角膜碱烧伤模型进行了ADSC

实施例1

本实施例中，以表1中的5’UTR、3’UTR和IGF1的DNA序列为模板，采用体外转录法获得modRNA。

采用RNA转录试剂盒(T7 High yield RNA Transcription kit，购买于Novoprotein)进行体外转录，其含有T7 RNA聚合酶。体外转录(IVT，in vitrotranscription)的反应体系见表1。

近岸蛋白的T7 kit，20μL体系，通常可以产生120-140μg mRNA。

表1

将表1中的反应体系置于PCR仪器中，37℃反应3小时，然后加入1μL DNaseⅠ(RNase-free)，充分混合，37℃反应30分钟，合成RNA使用Ambion MEGAclear自旋柱纯化RNA，用Antarctic Phosphatase(New England Biolabs)在37℃下处理30分钟，去除残留的5'-磷酸盐，得到的经修饰的mRNA分子(IGF1 modRNA)。在体外转录合成过程中，尿嘧啶均被替换为N

使用Nanodrop分光光度计(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)评估合成IGF1-mRNA的纯度和浓度(浓度＞1μg/μL，OD260/280＝1.8～2.2)，以1μg/μL经修饰的mRNA分子(IGF1modRNA)浓度重悬于10mM Tris HCl和1mM EDTA中备用。

同时，设立GFP modRNA对照组和Luc modRNA对照组；GFP modRNA对照组，为将IGF1编码序列替换为GFP编码序列，得到GFP modRNA对照组；将IGF1编码序列替换为Luciferase编码序列，得到Luc modRNA对照组。GFP编码序列和Luciferase编码序列见表1中SEQ IDNo.4和SEQ ID No.5。

IGF1 modRNA、Luc modRNA和GFP modRNA，统一简称为modRNA。

表2 DNA模板序列及modIGF1序列

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实施例2

本实施例中，将实施例1合成的modRNA转染于间充质干细胞，包括如下：

1、ADSCs的分离培养

脂肪组织收集自为美容目的进行眼睑成形术的健康女性患者(20-30岁)。该研究得到了上海交通大学医学院附属第九人民医院医学伦理委员会的批准。

手术采用全切口眼睑成形术，去除的脂肪组织片段切成小块，用0.1％的A型胶原酶(Roche,Manheim,Germany)在37℃消化8小时，然后1500rpm离心10分钟。

沉淀的细胞用添加了10％胎牛血清(FBS；Invitrogen,California,USA)和1％青霉素-链霉素抗生素(Gibco,Carlsbad,CA,USA)的DMEM(HyClone,GE Healthcare,LittleChalfont,UK)培养基重悬并在37℃进行培养。

细胞每2天更换培养基，当达到80-90％密度时，用TrypLE(Gibco)进行传代培养。所有研究均使用第3至第5代之间的ADSCs进行实验。

2、modRNA转染

2.1方法

每1μg IGF1 modRNA使用2μL

1)将IGF1 modRNA和转染试剂

2)将两种混合物混合在一起，孵育15分钟以生成modRNA-脂质复合物。

3)将modRNA-脂质复合物转染至ADSCs细胞中4h后，完全更换为添加了10％FBS(Invitrogen)和1％青霉素-链霉素抗生素(Gibco)的DMEM(HyClone)培养基，并在37℃中进行进一步培养得到ADSC

modIGF1转染组：为ADSC

转染24后，利用C6流式细胞仪(Beckman Coulter,CA,USA)检测GFP modRNA的转染效率和平均荧光强度，结果见图1中B和C。

转染后，连续1-6天的拍照，以检测其在细胞内的表达情况，结果见图1中A。

2.2结果

从图1中A可知，体外培养原代人ADSCs，经modGFP转染后，通过荧光显微镜连续观察，可见GFP在细胞内表达6天以上，Lipofectamine介导的modRNA转染在ADSCs内具有良好的耐受性，且可实现细胞内强有力的瞬时基因高表达。

从图1中B和C可知，通过流式细胞学检测到24h转染效率可达90％以上，且平均荧光强度可达1.8×10

3、检测

3.1实时定量PCR

3.1.1方法

使用EZ-press RNA纯化试剂盒(EZBioscience,MN,USA)从步骤2的ADSC

按照说明书使用PrimeScript RT试剂盒(Takara Bio Inc.，Otsu,Japan)进行逆转录。

采用Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems,Foster,CA,USA)在7500Real-Time PCR检测系统(Thermo Fisher Scientific)上进行PCR检测，并采用2-ΔΔCT方法测定相对表达量。

3.1.2结果

从图1中D可知，通过RT-PCR，与CTR对照组和modGFP组相比，转染modIGF1的ADSCs组在转染24h后，IGF1的表达增加了约8000倍。

3.2酶联免疫吸附测定(ELISA)

3.2.1方法

为了量化ADSCs转染后IGF1的表达动力学，在转染后的不同时间点(1、2、3、4、5和6天)收集上清，根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒(R&D Systems,Inc.，Minneapolis,MN,USA)检测IGF1蛋白水平。

吸光度的光密度值在微孔板阅读器(ELX800,BioTek,USA)上测量，并利用标准曲线测定蛋白质含量。

3.2.2结果

连续6天，利用ELISA试剂盒检测培养基中新产生的IGF1蛋白浓度。

从图1中E可知，与CTR对照组和modGFP转染对照组相比，modIGF1转染组的IGF1蛋白水平均显著升高，尤其是在转染后第一天。

实施例3

本实施例中，将实施例2得到的ADSC

将实施例1中Luc modRNA采用同实施例2中制备ADSC

LSCs的分离培养

经上海交通大学医学院附属第九人民医院眼库和医学伦理委员会批准，收集经角膜移植术后剩余的供体角膜环。

将获得的角膜环组织用10mg/mL的diapaseⅡ(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)在4℃下孵育8h。

随后，将上皮细胞薄片与基质分离，在37℃下用TrypLE消化5分钟。

将获得的单细胞悬液接种在含有10％胎牛血清、1％胰岛素-转铁蛋白-硒、1％非必需氨基酸(Life Technologies,Carlsbad,CA)、0.4μg/mL氢化可的松(Wako,Osaka,Japan)、2mM l-谷氨酰胺(Life Technologies)、10ng/mL表皮生长因子(LifeTechnologies)、1％青霉素-链霉素抗生素的DMEM/F12培养基(Invitrogen)中培养。

培养基每两天更换一次，当LSCs达到80-90％密度时，用TrypLE进行传代。取第1～3代LSCs进行后续实验。

1、小鼠角膜碱烧伤模型的建立

本研究所有小鼠实验均经上海交通大学医学院附属第九人民医院医学伦理委员会批准，并按照中国动物管理局和视觉与眼科研究协会(ARVO)《眼科与视觉研究动物使用声明》的指导方针开展。

本研究选用健康的8周龄雌性BALB/c小鼠建立角膜碱烧伤模型。

小鼠经麻醉后，利用盐酸奥布卡因滴眼液(Santen Pharmaceutical Co.,Ltd.,Kita-ku,Osaka,Japan)进行眼表麻醉，然后将浸润了1.0N NaOH(Sigma–Aldrich,St.Louis,MO,USA)的圆形Whatman III滤纸置于小鼠右眼的中央角膜40s，随后用PBS冲洗损伤眼表1分钟，得到小鼠角膜碱烧伤模型。

ADSCs结膜下注射

小鼠角膜碱烧伤模型的小鼠随机分为对照组(CTR)、ADSC

CTR组：在角膜碱烧伤模型小鼠的结膜下注射10μL PBS。

ADSC

ADSC

经结膜下注射给药后，进行连续的小鼠角膜损伤临床评估至第16天，以及后续的角膜组织学检测分析。

2、研究分析

2.1、角膜损伤临床评估

2.1.1方法

在指定的时间对各组小鼠进行临床检查，在评分和数据分析期间，研究人员都不知道分组情况。

采用裂隙灯显微镜(SL-D7,Topcon Inc.，Tokyo,Japan)在碱烧伤后第0、4、8、16天对角膜混浊度进行评估，按0～4分记录角膜水肿评分，结果见图2中A和B。

0＝完全清楚

1＝略朦胧，虹膜、瞳孔容易看清

2＝略不透明，虹膜，瞳孔仍可检出

3＝虹膜严重不透明，瞳孔几乎不可见

4＝完全不透明，看不到虹膜和/或瞳孔

然后，在碱烧伤后0、4、8、16天，用2％荧光素钠(Sigma-Aldrich)进行角膜荧光素染色，在钴蓝光下评价角膜上皮缺损并拍照，结果见图2中C和D。

根据国家眼科研究所/行业分级量表对角膜上皮缺损评分进行评估和分析。

2.1.2结果

从图2中A和B可知，经连续检查后，裂隙灯显微镜检查结果显示，结膜下注射ADSC

从图2中C和D可知，荧光素钠染色图像显示，ADSC

2.2、对角膜组织形态学的分析研究

2.2.1方法

小鼠于第16天处死，取眼球石蜡包埋，切成6μm切片。随后，根据制造商的说明，切片进行H&E和Masson’s三色染色(Sigma,St.Louis,MO,USA)，染色结果见图3中A。

染色后的切片在荧光显微镜下观察并拍照，然后用ImageJ分析角膜/角膜上皮厚度，结果见图3中B和C。

角膜神经染色：各组全角膜在Zamboni固定液(Solarbio,Beijing,China)中固定1h，然后用0.1％Triton X-100、2％山羊血清和2％牛血清白蛋白中封闭2h。随后，将封闭处理后的角膜与Tubulinβ-Ⅲ抗体在4℃孵育过夜，然后与Alexa Fluor 488偶联的二抗室温孵育1h。将孵育后的角膜切成花瓣状，用荧光显微镜观察并记录角膜神经形态，结果见图3中D。ImageJ计算角膜基底下神经纤维所占面积百分比，结果见图3中E。

2.2.2结果

从图3中A可知，苏木精&伊红(H&E)染色和马松(Masson’s)染色结果表明，CTR组的组织形态学在损伤后16天仍不佳，表现为角膜上皮的异常细胞形态和排列，以及角膜基质纤维的松散无序；ADSCs处理组，特别是ADSC

从图3中B和C可知，根据组织学染色结果，测量并分析了各组的角膜厚度和角膜上皮厚度，发现ADSC

从图3中D和E可知，经Tubulinβ-Ⅲ染色后，角膜外周和中央纤维各自的代表性图像显示，ADSC

从图3中D可知，ADSC

2.3、对角膜缘干细胞(LSCs)增殖的分析研究

2.3.1方法

将LSCs与modRNA修饰的ADSCs(ADSC

各组经12h培养后，细胞用PBS润洗3次，用4％PFA固定15分钟，再用PBS稀释的0.3％ Triton X-100(Sigma-Aldrich)破膜15分钟后，用5％驴血清(Sigma-Aldrich)在室温下封闭1小时。

随后，细胞利用Ki67(Cell Signaling Technology,Inc.3Trask Lane Danvers,MA,USA)，抗体在4℃孵育过夜。

然后用1:400稀释的Alexa荧光偶联二抗(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)室温孵育细胞1h。

使用EZ-press RNA纯化试剂盒(EZBioscience,MN,USA)从本实施例中步骤2.3.1的12h培养后的细胞中提取总RNA。按照说明书使用PrimeScript RT试剂盒(Takara BioInc.，Otsu,Japan)进行逆转录。采用Power SYBR Green PCR Master Mix(AppliedBiosystems,Foster,CA,USA)在7500Real-Time PCR检测系统(Thermo FisherScientific)上进行PCR检测，并采用2-ΔΔCT方法测定相对表达量，结果见图4中A。

用DAPI(Invitrogen)染色细胞核10min，然后用荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i；Nikon Instruments，Tokyo,Japan)观察记录，并用ImageJ分析荧光强度，结果见图4中B。

2.3.2结果

从图4中A可知，与ADSCs共培养可以促进LSCs的增殖，并且从Ki67基因表达水平可以看出，LSCs与转染modIGF1的ADSCs(LSC

从图4中B可知，各组LSCs的Ki67免疫细胞化学染色结果与RT-PCR结果一致，提示ADSC

2.4对角膜缘干细胞(LSCs)迁移的分析研究

2.4.1方法

采用Transwell实验研究LSCs在共培养条件下的迁移作用。

为了检测迁移能力，使用孔径为8μm的24孔聚碳酸酯膜细胞培养小室(SPL LifeSciences Co.,Ltd.,Korea)。将2×10

培养孵化24小时后，液体被丢弃，细胞用4％多聚甲醛(PFA)室温固定15分钟。用0.1％的结晶紫(Biyuntian Biotechnology Co.,Ltd.,China)在室温染色20分钟后，使用显微镜随机拍摄并统计三个视野的细胞，结果见图4中C和D。

2.4.2结果

从图4中C和D可知，ADSC

细胞载体—间充质干细胞，在组织工程和再生医学研究中发挥着重要作用，因其具有重要的免疫调节和抗炎特性，多项研究证实其经结膜下注射可促进角膜创面愈合，抑制基质炎症、新生血管和纤维化。而modRNA技术可对间充质干细胞进行基因修饰以增强其特异性功能，由于其强有力的瞬时基因表达，最小的免疫原性，以及高效且剂量可控蛋白质的提供，可以在体细胞重编程中实现多能性。本发明通过将modRNA技术与细胞治疗相结合，得到过表达IGF1的ADSCs(ADSC

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。