AnnexinV-mCherry融合蛋白及细胞凋亡试剂盒

技术领域

本发明涉及细胞检测技术领域，具体涉及AnnexinV-mCherry融合蛋白及细胞凋亡试剂盒。

背景技术

磷脂结合蛋白Annexin V是检测细胞凋亡的灵敏指标之一，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA碎片检测比较，使用Annexin V可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料合并使用，来区分凋亡细胞与死亡细胞。

常规Annexin V和荧光蛋白mCherry通过化学偶联反应的方式制备，需要进一步采用特定纯化工序对没有发生偶联反应的蛋白进行去除，也会导致原料的浪费，工艺稳定性较差，无法大规模生产。

另外，Annexin V偶联藻红蛋白PE也常用来检测细胞凋亡，但是在Annexin V与PE化学偶联过程中，Annexin V与PE连接位点随机，纯化后，也存在部分偶联产物因为连接位点阻碍Annexin V与磷脂酰丝氨酸结合。

PE在流式检测应用中会同时被488nm和561nm激光器激发，造成偶联蛋白与7-AAD或者PI等经典核染料搭配时出现串色严重的问题，数据补偿难度较大。

发明内容

基于此，有必要提供一种AnnexinV-mCherry融合蛋白及细胞凋亡试剂盒，该AnnexinV-mCherry融合蛋白无需采用工艺复杂的化学偶联反应制备，且AnnexinV与磷脂酰丝氨酸结合位点不被阻碍，大规模工业化生产的成本更低，稳定性更好，且能够替代PE偶联蛋白与7-AAD或者PI等经典核染料搭配用于流式细胞仪检测解决488nm荧光补充难度大的问题。

本发明采用如下技术方案：

一种AnnexinV-mCherry融合蛋白，依次包括AnnexinV蛋白序列、柔性接头序列以及mCherry荧光蛋白序列。柔性接头序列为包含10～29个氨基酸的接头序列，优选含15个氨基酸的(G

在其中一些实施例中，AnnexinV-mCherry融合蛋白还包括与AnnexinV蛋白序列连接的N端组氨酸标签序列，组氨酸标签氨基酸数量少，对目的蛋白的结构影响较小，且组氨酸有利于后续的亲和纯化。

本发明还提供编码上述AnnexinV-mCherry融合蛋白的基因，序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种包含序列如SEQ ID NO.1所示的基因的大肠杆菌工程菌。

本发明还提供一种制备AnnexinV-mCherry融合蛋白的方法，包括如下步骤：构建包含SEQ ID NO.1所示序列的大肠杆菌工程菌；诱导表达，破碎菌体，纯化，即得AnnexinV-mCherry融合蛋白。

在其中一些实施例中，所述诱导表达的工艺条件为：0.1～1mM IPTG，37℃诱导表达3～6h。

在其中一些实施例中，在破碎菌体之前，还包括去除培养基并采用PBS缓冲液重悬菌体的步骤，所述破碎菌体的工艺参数为：超声破碎仪超声3s，停1～3s，功率20％～40％。

在其中一些实施例中，纯化的工艺步骤为：将破碎后的菌液离心，收集上清液；将所述上清液上样于Ni Focurose 6FF(IDA)填料柱，采用不同浓度的氯化钠磷酸溶液进行梯度洗脱，收集包含目标蛋白的洗脱成分；将包含目标蛋白的洗脱成分再上样Focudex G-25柱进行脱盐，将脱盐后的洗脱成分再上样HiTrap Q HP柱再次进行纯化，得纯化后的AnnexinV-mCherry融合蛋白。

本发明还可以提供一种细胞凋亡试剂盒，包含核酸染料以及上述AnnexinV-mCherry融合蛋白。

在其中一些实施例中，所述核酸染料为7-AAD。

本发明的有益效果是：

与现有的化学偶联技术相比，本发明首次提供具有氨基酸序列明确、单一、稳定性好的AnnexinV-mCherry融合蛋白，可以利用大肠杆菌高效表达，大规模工业化生产的成本更低。该AnnexinV-mCherry融合蛋白的AnnexinV与磷脂酰丝氨酸结合位点不被阻碍，批间应用时荧光信号均匀性好，488nm激发时荧光信号弱，便于进行荧光补偿，使下游结果分析更便捷可信。

附图说明

图1为实施例1的AnnexinV-mCherry融合蛋白的序列组成示意图。

图2为实施例3的亲和柱洗脱后的SDS-PAGE检测图；其中，泳道1对应破碎后沉淀，泳道2对应上样时流穿部分，泳道3对应PBS洗脱液洗脱成分，泳道4-6对应PBS+50mM咪唑洗脱液洗脱成分，泳道7-8对应PBS+100mM咪唑洗脱液洗脱成分，泳道9对应蛋白Marker洗脱成分，泳道10-12对应PBS+300mM咪唑洗脱液洗脱成分，泳道13-14对应PBS+500mM咪唑洗脱液洗脱成分。

图3为实施例3的HiTrap Q HP纯化后的A

图4为实施例3最终纯化获得目的蛋白的SDS-PAGE检测图；其中，MK对应蛋白Marker，R对应Annexin V-mCherry融合蛋白。

图5为商业FITC-AnnexinV/PI试剂盒针对细胞凋亡模型的流式检测图；其中，A对应凋亡细胞模型；B对应正常细胞模型。

图6为mCherry-AnnexinV融合蛋白的浓度滴定结果统计图。

图7为7-ADD的浓度滴定结果统计图。

图8为样本细胞数滴定结果统计图。

图9不同孵育染色时间对mCherry-AnnexinV融合蛋白和7-ADD的分离指数的影响统计图；A对应AnnexinV-mCherry染色结果；B对应：7-AAD染色结果。

图10为mCherry与PE染料染色GFP+细胞样本对比图；其中，A对应AnnexinV-PE/7-AAD染色结果；B：AnnexinV-mCherry融合蛋白/7-AAD染色结果

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。

以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

本实施例提供一种经修饰改造的目的基因(由南京金斯瑞生物公司合成)，序列如下：

CATATGGCTCAGGTTCTGCGTGGTACCGTTACCGACTTCCCGGGTTCGACGAACGTGCTGACGCTGAAACCCTGCGTAAAGCTATGAAAGGTCTGGGTACCGACGAAGAATCTATCCTGACCCTGCTGACCTCTCGTTCAACGCTCAGCGTCAGGAAATCTCTGCTGCTTTCAAAACCCTGTTCGGTCGTGACCTGCTGGACGACCTGAAATCTGAACTGACCGGTAAATTCGAAACTGATCGTTGCTCTGATGAAACCGTCTCGTCTGTACGACGCTTACGAACTGAAACACGCTCTGAAAGGTGCTGGTACCAACGAAAAAGTTCTGACCGAAATCATCGCTTCTCGTACCCCGGAAGAACTGCGTGCTATCAAACAGGTTTACGAAGAAGAATACGGTTCTTCTCTGGAAGACGACGTTGTTGGTGACACCTCTGGTTACTACCAGCGTATGCTGGTTGTTCTGCTGCAGGCTAACCGTGACCCGGACGCTGGTATCGACGAAGCTCAGGTTGAACAGGACGCTCAGGCTCTGTTCCAGGCTGGTGAACTGAAATGGGGTACCGACGAAGAAAAATTCATCACCATCTTCGGTACCCGTTCTGTTTCTCACCTGCGTAAAGTTTTCGACAAATACATGACCATCTCTGGTTCCAGATCGAAGAAACCATCGACCGTGAAACCTCTGGTAACCTGGAACAGCTGCTGCTGGCTGTTGTTAAATCTATCCGTTCTATCCCGGCTTACCTGGCTGAAACCCTGTACTACGCTATGAAAGGTGCTGGTACCGACGACCACACCCTGATCAGGGTTATGGTAAGCCGTTCTGAAATCGACCTGTTCAACATCCGTAAAGAATTCCGTAAAAACTTCGCTACCTCTCTGTACTCTATGATCAAAGGGACACCTCTGGTGACTACAAAAAAGCTCTGCTGCTGCTGTGCGGTGAAGACGACGGTGGTGGTGGTTCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTATGGTTTCTAAAGGTGAAGAAGACAACATGGCTATCATCAAAGAATTCATGCGTTTCAAAGTTCACATGGAAGGTTCTGTTAACGGTCACGAATTCGAAATCGAAGGTGAAGGTGAAGGTCGTCCGTACGAAGGTACCCAGACCGCTAAACTGAAAGTTACCAAAGGTGGTCCGCTGCCGTTCGCTTGGGACATCCTGTCTCCGCAGTTCATGTACGGTTCTAAAGCTTACGTTAAACACCCGGCTGACATCCCGGACTACCTGAAACTGTCTTTCCCAGAGGGCTTCAAATGGGAACGTGTTATGAACTTCGAAGACGGTGGTGTTGTTACCGTTACCCAGGACTCTTCTCTGCAGGACGGTGAATTCATCTACAAAGTTAAACTGCGTGGTACCAACTTCCCGTCTGACGGTCCGGTTATGCAGAAAAAAACCATGGGTTGGGAAGCTTCTTCTGAACGTATGTACCCGGAAGACGGTGCTCTGAAAGGTGAAATCAAACAGCGTCTGAAACTGAAAGACGGTGGTCACTACGACGCTGAAGTTAAAACCACCTACAAAGCTAAAAAACCGGTTCAGCTGCCGGGTGCTTACAACGTTAACATCAAACTGGACATCACCTCTCACAACGAAGACTACACCATCGTTGAACAGTACGAACGTGCTGAAGGTCGTCACTCTACCGGTGG TATGGACGAACTG TACAAATAA(SEQ ID NO.1)。

目的基因中密码子经过优化，且5′端加入Nde I限制性酶切位点，3′端加入Xho I酶切位点。

上述目的基因用于体外合成AnnexinV-mCherry融合蛋白。

如图1所示，该AnnexinV-mCherry融合蛋白包括N端组氨酸标签序列、Annexin V蛋白序列、柔性接头序列(GGGGGS)

实施例2

本实施例提供一种包含质粒pET-28a(+)-Annexin V-mCherry的构建方法，包括如下步骤：将商业化的pET-28a(+)空载体用Nde I和Xho I两个限制性内切酶进行酶切，回收线性载体。再与合成的目的基因在粘性末端位置在DNA连接酶的作用下进行连接，形成环状的目的质粒。再转入大肠杆菌Top10中，进行扩增。提取质粒，由南京金斯瑞生物公司进行测序，与理论序列进行比对，最终确定获得构建成功的质粒pET-28a(+)-Annexin V-mCherry。

实施例3

本发明提供一种大肠杆菌工程菌制备AnnexinV-mCherry融合蛋白的方法，包括如下步骤：

S1，将实施例2构建成功的质粒转入表达菌株BL21(DE3)，形成大肠杆菌工程菌。

S2，将大肠杆菌工程菌用LB培养基，200rpm振荡培养，用0.5mM IPTG，37℃诱导4h，目的蛋白在大肠杆菌胞内进行表达，表达量约50mg/L。

S3，将步骤S2的菌液进行离心去除培养基，采用PH7.4的PBS重悬菌体，采用超声破碎仪(超声3s，停3s，功率20％)破碎菌体，继续离心，收集包含目的蛋白的上清液，利用目的蛋白的组氨酸标签与Ni Focurose 6FF(IDA)填料结合进行梯度亲和纯化，上样后，分别用PBS、PBS+50mM NaCl、PBS+100mM NaCl、PBS+300mM NaCl、PBS+500mM NaCl溶液依次洗脱，然后SDS-PAGE检测。

结果如图2所示，确定本实施例制备获得包含目的蛋白的洗脱组分。

S4，将PBS+100mM咪唑、PBS+300mM咪唑、PBS+500mM咪唑洗脱的产物收集，利用Focudex G-25脱盐柱将缓冲溶液体系替换为20mM Tris PH 8.0，然后用HiTrap Q HP预装柱进行纯化，纯化程序如下表1：

表1HiTrap Q HP纯化方法

A为A通道溶液，为平衡液20mM Tris PH 8.0。

纯化后的洗脱成分的A

将收集的目的蛋白加入包含5-8％甘露醇、2％-5％海藻糖的冻干保护剂进行冷冻干燥，置于-20℃～-80℃下保存，使用时采用无菌水溶解冻干粉，直接用于后续检测。

实施例4

本实施例建立一种细胞凋亡模型，包括如下步骤：

S1,将状态好的Jurkat细胞按照1:3进行传代，细胞按照1x10

S2，加药孔加10μL的1mM喜树碱，终浓度5uM，刺激细胞4-5h，后分别收集2孔细胞。

S3，分别对2孔细胞于300g条件下离心5min，去掉上清加200μL的1xAnnexin VBinding Buffer，涡旋。

S4，流式细胞仪计数，取合适细胞数，用商品化凋亡试剂盒(FITC-AnnexinV/PI)染色。

S5，染色结束后进行上机，结果如图5所示。凋亡细胞模型的流式检测结果如图5A所示，正常细胞模型的流式检测结果如图5B所示。

实施例5

本实施例探究不同用量的AnnexinV-mCherry融合蛋白对凋亡细胞检测结果的影响，参照实施例4的细胞凋亡模型及检测方法进行，其中检测方式中细胞数是1×10

AnnexinV-mCherry融合蛋白不同浓度分离指数统计见下表2：

表2 AnnexinV-mCherry融合蛋白不同浓度分离指数统计表

通过分离指数和生产成本来确定最佳的AnnexinV-mCherry融合蛋白的使用量，结果如图6所示，表明AnnexinV-mCherry融合蛋白的最佳工作浓度为6μg/mL。

实施例6

本实施例探究不同用量的7-ADD对凋亡细胞检测结果的影响，参照实施例4的细胞凋亡模型及检测方法进行，其中检测方式中细胞数是1×10

7-ADD不同浓度分离指数统计见下表3：

表3 7-ADD不同浓度分离指数统计表

通过分离指数和背景来确定最佳的7-AAD使用量，结果显示：7-AAD浓度越高，分离效果越好，但是浓度太高，阴性细胞背景会升高，所以选择7-AAD最适浓度为1μg/mL。

实施例7

本实施例探究不同细胞数对凋亡细胞检测结果的影响，参照实施例4的细胞凋亡模型及检测方法进行，其中检测方式中AnnexinV-mCherry的工作浓度是6μg/mL，7-ADD的工作浓度是1μg/mL，染色10min，检测结果见图8和表4。

不同细胞数量分离指数统计见下表4：

表4不同细胞数量分离指数统计表

通过分离指数来确定最佳的细胞数，结果显示：每个样本细胞数量需要在1×10

实施例8

本实施例探究不同细胞数对凋亡细胞检测结果的影响，参照实施例4的细胞凋亡模型及检测方法进行，结果见图8和表5。

不同染色时间的分离指数统计见下表5：

表5不同染色时间分离指数统计表

结合图表的结果显示：结合AnnexinV和7-AAD染色时间，染色10min以上即可，由于核染料不宜染色过长时间，所以该实验染色时间定位15～20min。

实施例9

本实施例提供一种AnnexinV-mCherry融合蛋白/7-ADD作为细胞凋亡试剂盒应用的检测方法，包括如下步骤：

S1，细胞按照实施例4的实验方案进行凋亡诱导模型试验，获得细胞凋亡模型细胞，300g离心5min，弃上清，收集细胞，pH7.4的PBS缓冲液轻轻重悬细胞并计数。

S2，取1～5×10

S3，细胞悬液中加入3μg的AnnexinV-mCherry融合蛋白和0.5μg的7-AAD染色液。

S4，轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15～20min。

S5，反应完成后样本置于冰上，在1h内用流式细胞仪检测。

本实施例同时采用AnnexinV-mCherry融合蛋白/7-AAD和AnnexinV-PE/7AAD检测同一种带绿色荧光信号样本的比较结果，结果如图10所示，表明本申请AnnexinV-mCherry/7-AAD搭配的检测结果细胞分群更好，检测效果更好。

另外，值得说明的是，本发明实际提供一种创新结合方式的AnnexinV-mCherry融合蛋白，可以利用大肠杆菌高效表达，大规模工业化生产的成本更低。

本发明还可以提供一种AnnexinV-mCherry融合蛋白/7-ADD凋亡试剂盒，包括AnnexinV-mCherry融合蛋白，其工作浓度是1～10μg/mL、7-ADD染色工作液，其工作浓度是0.5～5μg/mL。

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 伊莱瑞特（武汉）生物技术有限公司

<120> AnnexinV-mCherry融合蛋白及细胞凋亡试剂盒

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1712

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catatggctc aggttctgcg tggtaccgtt accgacttcc cgggttcgac gaacgtgctg 60

acgctgaaac cctgcgtaaa gctatgaaag gtctgggtac cgacgaagaa tctatcctga 120

ccctgctgac ctctcgttca acgctcagcg tcaggaaatc tctgctgctt tcaaaaccct 180

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tcgttgctct gatgaaaccg tctcgtctgt acgacgctta cgaactgaaa cacgctctga 300

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aacagcgtct gaaactgaaa gacggtggtc actacgacgc tgaagttaaa accacctaca 1560

aagctaaaaa accggttcag ctgccgggtg cttacaacgt taacatcaaa ctggacatca 1620

cctctcacaa cgaagactac accatcgttg aacagtacga acgtgctgaa ggtcgtcact 1680

ctaccggtgg tatggacgaa ctgtacaaat aa 1712