肝脏脂肪性肝炎的体外模型

本发明涉及制备非酒精性脂肪性肝炎的体外模型的方法。

背景技术

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种迅速出现的公共卫生危机，影响了多达1/3的美国人口、75％的2型糖尿病个体和95％的肥胖个体。在NAFLD疾病谱系的早期，非酒精性脂肪肝(NAFL)是良性而且无症状的，其特征为肝细胞内脂肪堆积；然而，这种表型可能进展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，这是一种包括脂肪变性、炎症和肝细胞气球样变性的严重疾病。

如果不加治疗，则NASH可能进一步进展为肝硬化和或肝细胞癌，通常导致肝移植或死亡。NASH是一种复杂的疾病，其成因与多种因素有关，包括遗传、代谢综合征和/或如饮食和运动等外部因素，使得甄别新疗法具有挑战性(Dongiovanni P等人，Curr PharmDes.2018)。

正在开发的NASH疗法的作用机制千差万别并靶向疾病过程中非常不同的方面和阶段，这使得如实再现NASH的模型的开发非常具有挑战性。

尽管永生化的人细胞系如Huh7、HepG2或iPSC来源的肝细胞可以在培养中诱导成脂肪变性表型，但多项研究表明，这些细胞几乎不能反映天然肝脏代谢功能。

对于共培养方法，使用分化或功能不良的细胞系、缺乏对构成肝脏的不同肝细胞类型的数量和细胞比率的控制(Hurrell T等人,Cells.2020)不能完全重现NASH表型(InSphero肝脏显微组织，Mukherjee S等人,Am J Transl Res.2019)。

为了充分模拟这种疾病的复杂病理，需要仔细地选择体内条件并转化为体外设置。因此，对提供一种模拟该病过程中肝脏发生的生理行为的NASH体外模型的需求仍然未得到满足。

发明内容

本发明涉及含有以精确受控的量接种的多种人肝细胞类型的体外球体设置。

因此，本发明涉及一种充分模拟NASH表型的肝球体以及制备其的方法。

在第一方面，本发明涉及一种制备肝球体的方法，所述方法包括一起接种和培养10至60份人肝细胞(HH)、4至30份人星状细胞(HSC)、1至10份人肝内皮细胞(LEC)和1至10份库弗细胞(KC)，以及在允许形成肝球体的条件下培养所述细胞。在一个特别的实施方式中，所述方法包括一起接种和培养500至3000个HH、200至1500个HSC、50至500个LEC和50至500个KC。

优选地，本发明涉及一种制备肝球体的方法，所述方法包括一起接种和培养20至50份HH、5至20份HSC、3至7份人LEC和3至7份KC。

在另一方面，本发明涉及一种诱导NASH体外模型的方法，其中所述方法包括在适合诱导NASH表型的条件下培养本文所述的肝球体。

本发明还涉及本发明的NASH体外模型的使用方法。

本发明是用于NASH体外建模，从而模拟从脂肪变性到更严重疾病状态如纤维化NASH的NASH发病机制的相关工具。

附图说明

图1：在“NASH诱导培养基”中培养6天后球体的HES(苏木素-伊红-番红)着色，显示了典型的NASH特征：脂肪变性(箭头)和气球样变性肝细胞(圆圈)

图2：在“NASH诱导培养基”中培养6天后球体的PS(天狼猩红)染色，显示了中度纤维化(4.09％)，由红色染色的胶原纤维(星号)表明

图3：在“NASH诱导培养基”中培养6天后InSphero 3D InSight

图4：在“NASH诱导培养基”中培养6天后InSphero 3D InSight

图5：制备后24小时(A)和9天(B)时维持在培养物中的球体的形态。U和S分别表示‘未处理’和‘受刺激’的球体。刺激(S)9天后的形态变化是显著的。A、B、C和D分别对应表1提到的人肝细胞供体，编号1号和2号分别对应表2提到的HSC供体。对于所有HH和HSC组合，库弗细胞和肝内皮细胞供体都保持不变。

图6：制备后24小时(A)和9天(B)时培养物中的脂肪变性基线水平(表示为Adipored RFU，相对荧光单位)。A、B、C和D分别对应表1提到的人肝细胞供体，编号1号和2号分别对应表2提到的HSC供体。对于所有HH和HSC组合，库弗细胞和肝内皮细胞供体都保持不变(n＝6)。

图7：刺激9天后的脂肪变性水平。A、B、C和D分别对应表1提到的人肝细胞供体，编号1号和2号分别对应表2提到的HSC供体。对于所有HH和HSC组合，库弗细胞和肝内皮细胞供体都保持不变(n＝6)。

图8：在培养第0天(A)和第9天(B)时的白介素-8浓度。IL-8浓度以pg/mL表示。A、B、C和D分别对应表1提到的人肝细胞供体，编号1号和2号分别对应表2提到的HSC供体。对于所有HH和HSC组合，库弗细胞和肝内皮细胞供体都保持不变(n＝6)。

图9：NASH培养条件下9天后的白介素-8浓度。IL-8浓度以pg/mL为单位，相对于未处理的样品归一化(模拟样品的浓度-未受刺激的样品的浓度；n＝6)。A、B、C和D分别对应表1提到的人肝细胞供体，编号1号和2号分别对应表2提到的HSC供体。对于所有HH和HSC组合，库弗细胞和肝内皮细胞供体都保持不变。

具体实施方式

尽管对NASH非常感兴趣，但仍然缺乏普通治疗策略，目前正在开发的30多种不同的靶标(PPAR调节剂、抗纤维化/抗炎调节剂、葡萄糖途径调节剂、脂质调节剂)证明了这一点。这可能源于缺乏对疾病的理解以及用于鉴定和验证靶标的实验模型。

本发明描述了用于NASH建模的可再现且可控的肝球体形成。

定义

如本文所用，术语“约”用于细胞培养天数时表示与所述天数完全对应的时间段，例如对于一天是24小时、对于2天是48小时等，但也表示有+/-4小时容许偏差的时间段。例如，约1天指20至28小时，约2天指44至52小时，约6天指140至148小时，约7天指164至172小时等。

此外，术语“约”用于浓度值时指该浓度值的+/-10％，如该浓度值的+/-5％。

在本发明的上下文中，术语“份”用于细胞类型时是指所述细胞类型的比例。例如，表述“10份细胞A和1份细胞B”指所用的细胞A是细胞B的10倍。该信息与细胞的培养体积无关。因此，仍以“10份细胞A和1份细胞B”为例，该表述可以指：

-10个细胞A和1个细胞B；

-200个细胞A和20个细胞B；

-1000个细胞A和100个细胞B；

-...

制备肝球体的方法

在第一方面，本发明涉及一种制备肝球体的方法，所述方法包括一起接种和培养10至60份HH、4至30份HSC、1至10份人LEC和1至10份KC，以及在允许形成肝球体的条件下培养所述细胞。

细胞

根据本发明的制备肝球体的方法实现了培养四种不同的细胞类型，即HH、HSC、人LEC和人KC。

在一个特别的实施方式中，所述细胞是原代细胞。在另一个实施方式中，所述细胞是人原代细胞。在另一个特别的实施方式中，所述肝球体是由原代HH、原代HSC、原代人LEC和原代人KC制备。

在另一个实施方式中，每一种细胞类型都来源于单个供体。在本发明的上下文中，表述“每一种细胞类型都来源于单个供体”指对于指定的细胞类型，所述细胞类型是获自单个供体，如单个人，而不是来源于不同供体的细胞池，如来源于不同供体的HH池。仍然在本发明的上下文中，两种或更多种细胞类型可以来源于或并非来源于单个供体。例如，本文实现的四种细胞类型中的每一种都可以来源于四个不同的供体。在另一个变体中，所述四种细胞类型中的两种可能来源于第一单个供体，另外两种细胞类型可能来源于第二单个供体，或来源于第二供体和第三供体。

在另一个实施方式中，本发明方法所用的不同细胞类型是获自商业来源。

本发明所实现的细胞可以来源于不同背景的供体，如与NAFLD或NASH向更严重表型进展相关或不相关的背景。已经证明，遗传背景和代谢紊乱可以在NAFLD和NASH进展中起关键作用。例如，特定的遗传多态性表现出发展NAFLD的增加倾向，如单核苷酸多态性(SNP)含马铃薯糖蛋白样磷脂酶结构域蛋白3(PNPLA3)rs738409变体，它不仅与从简单脂肪变性向NASH进展相关，而且与这些患者的脂肪变性和纤维化的严重程度相关。(Romeo S等人,Nat Genet.2008 40(12):1461-1465)。跨膜6超家族2(TM6SF2)rs58542926可能也涉及疾病进展。TM6SF2基因是代谢综合征的主调节因子。据报告，携带SNP TM6SF2 rs58542926突变的NASH患者的VLDL(极低密度脂蛋白)输出减少，从而通过降低甘油三酯输出到血流中来促进脂肪变性和减少斑块形成(Kozlitina J等人,Nat Genet.2014,46(4):352-356)。因此，在一个特别的实施方式中，本发明实现的细胞，特别是HSC，来源于具有与NAFLD或NASH疾病进展不相关的遗传背景的供体。在另一个实施方式中，本发明实现的细胞，特别是HSC和/或HH，来源于具有与NAFLD或NASH疾病进展相关的遗传背景的供体，如来自具有PNPLA3rs738409SNP或TM6SF2 rs58542926SNP的供体。在另一个实施方式中，本发明实现的细胞可以来源于患有至少一种代谢病症，如2型糖尿病的供体。

细胞的共培养

在适合制备肝球体的条件下培养本发明的方法所用的细胞。

根据本发明，将本文所述的四种细胞类型以所限定的量一起接种在相同的培养基中以形成肝球体。更具体地，本发明的方法包括一起接种10至60份HH、4至30份HSC、1至10份LEC和1至10份KC。优选地，本发明涉及一种制备肝球体的方法，所述方法包括一起接种和培养20至50份HH、5至20份HSC、3至7份人LEC和3至7份KC，以及在允许形成肝球体的条件下培养所述细胞。

在一个特别的实施方式中，所述方法包括一起接种和培养500至3000个HH、200至1500个HSC、50至500个人LEC和50至500个KC。在另一个特别的实施方式中，所述方法包括一起接种和培养1000至2500个HH、250至1000个HSC、150至350个LEC和150至350个KC。在另一个特别的实施方式中，所述方法包括一起接种并培养1500至2500个HH、700至1100个HSC、100至200个LEC和100至200个KC。在另一个实施方式中，所述方法包括一起接种并培养1800至2200个HH、810至990个HSC、135至165个LEC和135至165个KC。在另一个实施方式中，所述方法包括一起接种并培养1900至2100个HH、850至950个HSC、140至160个LEC和140至160个KC。在另一个特别的实施方式中，所述方法包括一起接种并培养2000个HH、900个HSC、150个LEC和150个KC。在此实施方式的特定变体中，所述细胞在50μL至500μL培养基中，特别是75μL至200μL，如约100μL培养基中培养。

所述细胞在合适的板中，如96孔板，特别是具有超低附着表面的板中培养。在一个特别的实施方式中，所述板具有接近透明的底。这样的板容易得自许多制造商，如Corning。

在适合形成肝球体的细胞培养基中培养细胞。细胞培养基可以来源于本领域众所周知的细胞培养基(本文也称为“基础培养基”)，任选地补充有合适的组分。例如，所述基础培养基可以是威廉姆氏E细胞培养基或杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)或高级DMEM或适用于培养肝细胞和肝非实质细胞的任何其它细胞培养基。所述基础培养基还可以是已知培养基的混合物。所述基础培养基可以补充有可用于细胞培养，特别是肝细胞培养的普通组分如抗生素、缓冲剂、营养物和生长因子(如表皮生长因子(EGF)和/或肝细胞生长因子(HGF)，优选两者兼有)。可用的补充剂包括但不限于青霉素、链霉素、胰岛素、转铁蛋白、硒、谷氨酰胺、HEPES、庆大霉素。

在一个特别的实施方式中，胰岛素可以以0.05μM至4μM，特别是1至3μM，如约2μM的浓度使用。

在一个特别的实施方式中，转铁蛋白可以以1至15μg/mL，如约5μg/mL的浓度使用。

在一个特别的实施方式中，EGF可以以1至10ng/mL，特别是3至4ng/mL，如约3.33ng/mL的浓度使用。

在一个特别的实施方式中，HGF可以以0.1ng/mL至10ng/mL，如1.5至8ng/mL的浓度使用。

在一个说明性实施方式中，细胞培养以两步法实现。在此实施方式的第一步，将所述细胞接种在第一含血清培养基中，然后接种在无血清培养基中。在一个特别的实施方式中，所述第一培养基包含浓度为1至10％，如5至8％的血清，更特别地，所述血清浓度为约7％。在一个特别的实施方式中，第一培养基和第二培养基都含有HGF，其浓度为0.5ng/mL至10ng/mL，如1至7.5ng/mL。在一个特别的实施方式中，所述第二培养基包含的HGF浓度高于所述第一培养基中的HGF浓度。在另一个实施方式中，所述第二培养基中的HGF浓度是所述第一培养基中的HGF浓度的1.5倍、2倍、3倍或4倍。在一个特别的实施方式中，所述第二培养基中的HGF浓度是所述第一培养基中的HGF浓度的约3倍。在另一个实施方式中，所述第一培养基中的HGF的浓度为0.5ng/mL至2.5ng/mL，如1至2ng/mL，更特别地，HGF的浓度为约1.67ng/mL。在另一个特别的实施方式中，所述第二培养基中的HGF浓度是所述第一培养基中的HGF浓度的约3倍。在另一个实施方式中，所述第二培养基中的HGF的浓度为0.75ng/mL至10ng/mL，如1.5至8ng/mL，更特别地为4至6ng/mL，更特别地，HGF的浓度为约5ng/mL。

在另一个特别的实施方式中，所述第一培养基和所述第二培养基的基础培养基相同或不同。在一个特别的实施方式中，所述第一培养基和所述第二培养基的基础培养基相同。在一个特别的实施方式中，所述基础培养基包含DMEM和威廉姆氏培养基的混合物。在另一个特别的实施方式中，所述基础培养基包含高级DMEM、DMEM和威廉姆氏培养基的混合物。在另一个特别的实施方式中，所述基础培养基包含2/3的高级DMEM培养基和1/3的DMEM:威廉姆氏培养基1:1。

在一个特别的实施方式中，所述第一含血清培养基和所述第二无血清培养基包含胰岛素。

在另一个特别的实施方式中，所述第一培养基和所述第二培养基中的胰岛素的浓度为约1至3μM，如约2μM。

在一个特别的实施方式中，所述第一含血清培养基和所述第二无血清培养基包含EGF。

在另一个特别的实施方式中，所述第一培养基和所述第二培养基中的EGF的浓度为约3至4ng/mL，如约3.33ng/mL。

在一个特别的实施方式中，所述第一含血清培养基和所述第二无血清培养基包含HGF。在此实施方式中，HGF可以以上文限定的浓度包含在所述培养基中。

在一个特别的实施方式中，所述第一培养基包含7％血清、青霉素/链霉素100U/mL/100μg/mL、胰岛素2μM、谷氨酰胺2mM、HEPES5mM、转铁蛋白5μg/mL、牛血清白蛋白(BSA)0.27mg/mL(如通过加入富脂质BSA制剂如AlbuMAX而引入培养基中的BSA；Gibco)、亚硒酸钠3.33ng/mL、EGF 3.33ng/mL和HGF 1.67ng/mL。在此实施方式的第二步中，然后在含有青霉素/链霉素100U/mL/100μg/mL、胰岛素2μM、GlutaMax 2mM、HEPES 5mM、转铁蛋白6.25μg/mL、亚硒酸5.26ng/mL、BSA 1.25mg/mL、亚油酸5.35μg/mL、EGF 3.33ng/mL、HEPES 15mM和HGF5ng/mL的无血清培养基中培养所述细胞。

所述第一培养步骤可以进行至少5天，如至少6天或至少7天。在一个特别的实施方式中，所述第一培养步骤进行了约7天。所述第二培养步骤可以进行至少4天，如5、6、7、8或9天。在一个特别的实施方式中，所述第二培养步骤可以进行9天。

在一个特别的方面，本发明涉及能根据上述方法获得的肝球体。

在肝球体中诱导NASH样表型的方法

本发明的另一个方面涉及在根据本发明的肝球体中诱导NASH样表型的方法。

诱导NASH样表型的方法包括在适合诱导所述NASH样表型的条件下培养根据本发明的肝球体。在一个特别的实施方式中，在包含可用于诱导NASH样表型的组分的细胞培养基中培养本发明的肝球体。例如，可以在NASH诱导培养基，特别是不含血清的NASH诱导培养基中培养肝球体。所述NASH诱导培养基可以选自市售培养基，如InSphero销售的NASH诱导培养基(商品号：ID CS-07-212-01)。在另一个实施方式中，所述NASH诱导培养基包含：胰岛素，浓度为100nM至2μM；至少2种游离脂肪酸(FFA)(1种饱和与1种不饱和)的FFA混合物，饱和/不饱和比率为0.5至2且最终浓度为300μM至1mM；至少2种糖，最终浓度为10mM至50mM；以及胆固醇，浓度为5μg/mL至500μg/mL。或者，可以使用包含以下各物的组合物：

-至少一种碳水化合物；

-至少一种游离脂肪酸；

-胰岛素；以及

-胆固醇来源。

在一个特别的实施方式中，所述至少一种碳水化合物对应于葡萄糖与果糖的混合物。在另一个特别的实施方式中，所述培养基包含葡萄糖，浓度为0.2g/L至20g/L，特别是0.5g/L至10g/L，如浓度为约2g/L。在另一个特别的实施方式中，所述培养基包含果糖，浓度为0.3g/L至30g/L，特别是1g/L至10g/L，如浓度为约3g/L。

在另一个特别的实施方式中，所述至少一种游离脂肪酸对应于脂肪酸的混合物，如一种不饱和脂肪酸与一种饱和脂肪酸的混合物。在一个特别的实施方式中，所述至少一种游离脂肪酸对应于油酸与棕榈酸的混合物。在另一个特别的实施方式中，所述培养基中包含油酸，浓度为50μM至1mM，特别是100μM至500μM，特别是200至300μM，如约265μM；所述培养基中包含棕榈酸，浓度为25μM至500μM，特别是50μM至250μM，特别是100μM至200μM，如135μM。

在一个特别的实施方式中，胰岛素的浓度为10nM至10μM，特别是50nM至500nM，如约100nM。

在另一个特别的实施方式中，所述胆固醇来源是胆固醇。在另一个特别的实施方式中，胆固醇的浓度为5至500μg/mL，特别是10至100μg/mL，如约50μg/mL。

在另一个特别的实施方式中，可以使用包含胰岛素100nM、油酸/棕榈酸265μM/135μM混合物、葡萄糖2g/L、果糖3g/L和胆固醇50μg/mL的基础威廉姆氏培养基/DMEM 50％/50％。

根据一个特别的方面，本发明涉及一种培养基，所述培养基包含：

-葡萄糖，浓度为0.2g/L至20g/L，特别是0.5g/L至10g/L，如浓度为约2g/L；

-果糖，浓度为0.3g/L至30g/L，特别是1g/L至10g/L，如浓度为约3g/L；

-油酸，浓度为50μM至1mM，特别是100μM至500μM，特别是200至300μM，如约265μM；

-棕榈酸，浓度为25μM至500μM，特别是50μM至250μM，特别是100μM至200μM，如135μM；

-胰岛素，浓度为10nM至10μM，特别是50nM至500nM，如约100nM；以及

-胆固醇，浓度为5至500μg/mL，特别是10至100μg/mL，如约50μg/mL。

在一个特别的实施方式中，本发明的培养基包含：

-胰岛素100nM；

-油酸265μM；

-棕榈酸135μM；

-葡萄糖2g/L；

-果糖3g/L；以及

-胆固醇50μg/mL。

在NASH诱导培养基中培养肝球体，持续时间足以诱导目标NASH样表型，如包括脂肪变性、气球样变性和炎症但不包括纤维化(NASH样表型)或还包括纤维化(纤维化NASH样表型)的表型。在一个特别的实施方式中，在NASH诱导培养基中培养肝球体持续至少4天，如至少5天或至少6天。在另一个实施方式中，在NASH诱导培养基中培养肝球体持续6天以上，如至少7、8或9天。培养基更换可以定期进行，如在上一次加入或更换培养基后约24、48或72小时后。

有利地，本发明适合于从肝球体产生NASH样表型，从而将简单的脂肪变性与中度纤维化NASH相关联。与仅再现严重肝硬化样表型，不适于NASH病因或进展研究和筛选对NASH或纤维化NASH具有潜在治疗效果的分子的其它肝球体如InSphero公司销售的3DInSight

本发明还涉及具有NASH样表型如纤维化NASH样表型的肝球体，所述肝球体能根据上述诱导方法获得。所述具有NASH样表型的肝球体可以用作NASH或纤维化NASH的模型。

筛选治疗物质的方法

本发明还涉及一种筛选测试物质的潜在抗NASH效果(如抗纤维化NASH效果)的方法，所述方法包括：

培养根据本发明的具有NASH样表型(如纤维化NASH样表型)的肝球体与所述测试物质；以及

测定所述肝球体中或所述培养基中至少一个参数的变化。

在一个特别的实施方式中，所述方法包括：

i.根据本文所述的方法在肝球体中诱导NASH样表型，或根据本发明提供具有NASH样表型的肝球体；

ii.使所述具有NASH样表型的肝球体与所述测试物质接触；以及

iii.在步骤ii后测定所述肝球体中或所述培养基中至少一个参数的变化。

然而，应当理解，步骤i.和ii.还可以同时进行，或者步骤ii.可以在步骤i.之前实施，即，肝球体与测试物质接触未必在诱导NASH样表型后发生。

测试物质可以属于任何类型，如小分子、大分子或更复杂的物质，如病毒或寄生虫。大分子包括但不限于肽、蛋白质和核酸。测试物质可以是物质库，例如小分子库或大分子库的一部分。本发明的方法还可以用于评估物质组合的效果。

所述测试物质的效果可以通过测定所述肝球体中或所述肝球体培养的培养基中至少一个参数的变化来评估。所述至少一个参数可以选自与所述模型所用于的特定疾病相关的标志物。特别地，所述至少一个参数可以选自脂肪变性、纤维化和炎症标志物。可评估的说明性脂肪变性标志物包括但不限于：脂肪生成增加、去饱和酶、LOX活性、过氧化物酶体多不饱和脂肪酸(PUFA)代谢受损。可评估的说明性纤维化标志物包括但不限于：胶原蛋白、弹性蛋白、糖蛋白、透明质酸、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)、软骨低聚基质蛋白(COMP)。可评估的说明性炎症标志物包括但不限于：白介素-8(IL-8)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)、趋化因子(C-C基序)配体5(CCL-5)。特别地，所述至少一个参数可以选自蛋白质标志物、RNA标志物、肝球体大小和肝球体完整性。其它参数包括肝球体的脂质含量、趋化因子产生、细胞因子产生和胶原蛋白产生。

实施例

实施例1：本发明的球体的制备

a-球体的建立

在球体形成前若干天，将星状细胞(HSC，Innoprot)和肝内皮细胞(LEC，Innoprot)分别在补充有1％ SteCGS补充剂、1％青霉素/链霉素和2％胎牛血清的SteCM(Innoprot)(Innoprot，商品号P60126)中和补充有1％ECGS补充剂、1％青霉素/链霉素和5％胎牛血清的ECM(Innoprot，商品号P60104)中解冻以便对其进行扩增。

原代人肝细胞(HH，来自KalyCell)和库弗细胞(KC，Lifenethealth)分别在UCRM(In Vitro ADMET Labatories，商品号81015)和RPMI(Corning，商品号10-040-CVR)中解冻，两种培养基都补充有1％青霉素/链霉素和10％胎牛血清。将细胞接种在96孔ULA板(超低附着表面；Corning)中的100μL自制聚集培养基(2/3高级DMEM培养基+1/3DMEM/威廉姆氏1:1)中，所述聚集培养基含有7％血清和青霉素/链霉素100U/mL/100μg/mL、胰岛素2μM、GlutaMax 2mM、HEPES 5mM、转铁蛋白5μg/mL、AlbuMAX 0.27mg/mL、亚硒酸钠3.33ng/mL、表皮生长因子(EGF)3.33ng/mL和肝细胞生长因子(HGF)1.67ng/mL。

然后，将四种细胞类型按以下量一起接种：2000个HH、900个HSC、150个LEC和150个KC。在所述自制聚集培养基中培养7天(D-1)后，在24小时内以含有青霉素/链霉素100U/mL/100μg/mL、胰岛素2μM、GlutaMax 2mM、HEPES 5mM、转铁蛋白6.25μg/mL、亚硒酸5.26ng/mL、牛血清白蛋白(BSA)1.25mg/mL、亚油酸5.35μg/mL、EGF 3.33ng/mL、HEPES 15mM和HGF 5ng/mL的DMEM/威廉姆氏1:1培养基进行两次50％培养基更换。

所获得的肝脏显微组织是具有上述4种细胞类型的受控细胞组成的基于原代人细胞的3D球体。

由与NPC(非实质细胞)一起共培养的10个供体集合的原代人肝细胞和肝星状细胞组成的3D InSight

b-NASH表型诱导

将InSphero 3D InSight

c-组织包埋、染色和组织学检查

将InSphero模型和实施例1的球体保存在70％乙醇-伊红溶液中，并包埋在Histogel(Thermo Scientific，HG4000)中。然后，球体在乙醇溶液(70％和100％乙醇浴)中脱水，在两个异丙醇浴中孵育，然后在两个液体石蜡浴中孵育(60℃)。

然后将球体放入槽中，轻缓地填充

对于苏木素/伊红/番红染色，将所述球体切片脱蜡，再水合，在Mayer苏木素(Microm，目录号F/C0303)中孵育3分钟。然后，将所述球体切片在水中冲洗，在含有0.5％醇溶性伊红Y(VWR，目录号1.02439.0500)和0.5％藻红(VWR，目录号1.15936.0010)的溶液中孵育1分钟，并用乙醇冲洗。然后将切片在番红中孵育2分钟，最后脱水并使用CV固定培养基(Leica，目录号046430011)固定。

对于天狼猩红和固绿染色，将球体切片脱蜡，再水合，在0,04％固绿溶液(Sigma，F7258)中孵育15分钟。然后，将球体切片在乙酸溶液中和水中冲洗。切片在0.1％天狼猩红(Alfa Aesar，B21693；Sigma P6744)-0.04％固绿溶液中孵育30分钟，用乙醇冲洗。然后对切片进行脱水，使用CV固定培养基(Leica，目录号046430011)固定。

组织学检查和评分以盲法进行。使用Panoramic 250Flash II数字幻灯片扫描仪(3DHistech)采集图像。对每一个切片进行检查，在QuantCenter软件(3DHistech)中分析。

对于用苏木素/伊红/番红染色的每一个显微组织，根据NASH临床研究网络对由于NASH(脂肪变性和气球样变性)引起的组织学病变进行归因。对于用天狼猩红染色的每一个微组织，通过相对于球体切片面积的天狼猩红(PS)阳性面积进行形态计量定量来评估纤维化百分比。

d-结果：

InSphero模型和本发明的球体都在‘NASH诱导培养基’(商品号：ID CS-07-212-01，InSphero)中按照相同的方案进行培养。所获得的表型是图1、图2、图3和图4所描绘的那些。

在本发明的球体的情况下(图1和图2)，呈现了肝细胞所表现的主要NASH特征：脂肪变性、气球样变性(图1)和胶原纤维(4.09％纤维化，图2)。

在InSphero

关于胶原纤维所占的表面和纤维化评分可以形成平行关系(Tsochatzis E等人,JHepatol.2014年5月；60(5):948-54)，可以看出，在InSphero肝脏模型中，胶原纤维在各处形成了重要的网络(图4)。

在InSphero

在与本发明的球体相同的培养条件下，3D InSight

相反，本发明的实施例1的球体导致了模拟纤维化NASH表型的模型：脂肪变性、少量气球样变性细胞和中度纤维化。因此，本发明的球体代表了更相关的纤维化NASH模型。

实施例2：包括携带特定突变和/或代谢紊乱的细胞的球体的构建。

材料和方法

表1：实施例2所用的肝细胞供体的健康状况、NAS评分、BMI(体重指数)、PNPLA3和TM6SF2基因型。NAFLD：非酒精性脂肪性肝病；T2D：2型糖尿病；NAS：NAFLD活性评分；BMI：体重指数

表2：实施例2所用的星状细胞供体的PNPLA3和TM6SF2基因型。

为了制备所述球体，根据实施例1将4种细胞类型按以下量一起接种：2000个HH(供体A、B、C或D)、900个HSC(供体1号或2号)、150个LEC和150个KC(参见实施例1)。聚集7天(D-1)后，以无FBS+青霉素/链霉素100U/mL/100μg/mL、胰岛素2μM、GlutaMax 2mM、HEPES 5mM、转铁蛋白5μg/mL、AlbuMAX 0.27mg/mL、亚硒酸钠3.33ng/mL、EGF 3.33ng/mL和HGF 1.67ng/mL的DMEM/威廉姆氏1:1培养基进行两次50％培养基更换。

在补充有胰岛素100nM、油酸/棕榈酸265μM/135μM、葡萄糖2g/L、果糖3g/L和胆固醇50μg/mL的DMEM:威廉姆氏1:1混合物中刺激球体。

基因分型

针对PNPLA3 I148M和TM6SF2 K167E突变对细胞进行基因分型。简而言之，使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen，商品号69506)从细胞分离总DNA。在CFX96热循环仪(BioRad)上，使用具有针对PNPLA3的SNP ID rs738409和针对TM6SF2的rs58542926的Taqman探针(Thermofisher，商品号4351379)进行实时qPCR。

球体成像

用Cell3iMager neo装置(CC-3000，Screen，Jp)产生球体图像

脂肪变性测量

用AdipoRed

白介素-8测量

在第0天和第9天收集球体上清液，储存在-80℃。使用ELISA试剂盒(R&D，商品号DY208)测定IL-8浓度。结果表达为相对于未处理的球体(未用分子混合液诱导NASH)。

统计分析

用Graphpad对相对于所有测试的未处理样品的结果进行非参数检验(Mann-Whitney或Kruskal-Wallis)。

结果

具有突变的稳定球体的建立

图5A示出了本发明的突变球体在第0天的形态。所述球体具有明确的组成，整合了具有表1和表2所述的突变和特征的人肝细胞和人星状细胞。

此外，具有HH供体A、B、C或D与KC、LEC和HSC供体1号或2号的组合的球体在未刺激培养条件(U)下稳定了9天。在9天的刺激(S)后，它们可以被驱动到NASH表型，与未刺激条件(U)相比，显示出了脂肪变性表型特有的典型形态改变与不规则形状。(图5B)。

第0天的球体脂肪变性

在形成过程中，当与HSC供体1号组合时，HH供体C或D的球体积累的脂肪比供体A或B少(图6A)。

当与HSC供体2号组合时，HH供体A或B的球体积累的脂肪比与HSC供体1号组合时少(图6A)。

第9天的球体脂肪变性

当与HSC 1号组合时，来自供体D的HH产生的球体积累的脂肪比来自供体A、B或C的HH产生的球体少。当与HSC供体2号组合时，HH供体B、C或D的球体积累的脂肪比HH供体A的球体少(图6B)

这种球体适合于NASH建模。此外，由于代谢紊乱和SNP对球体脂肪变性的影响，允许对表型差异进行表征。

脂肪变性诱导与NASH培养条件

具有来自供体D的HH与来自供体1号的HSC(HSC 1号)的组合的球体积累的脂肪明显多于具有来自供体A的HH与HSC 1号的组合的球体。具有来自供体B的HH与来自供体2号的HSC(HSC 2号)的组合的球体积累的脂肪多于具有来自供体A的HH与HSC 2号的组合的球体。具有来自供体D的HH与HSC 1号的组合的球体积累的脂肪比具有来自供体D的HH与HSC 2号的组合的球体多(参见图7)。

因此，观察到球体在未处理培养条件下和响应于NASH培养条件的脂肪积累都存在生理学上显著的个体间差异。

促炎性细胞因子产生

与HSC 2号组合时，来自供体C或D的HH的IL-8水平比与HSC1号组合的那些高(图8A)。培养9天后，具有来自供体C或D的HH的球体与HSC 1号和HSC 2号二者组合时的IL-8水平与具有来自供体A的HH的球体相比较低。与HSC 2号组合时，具有来自供体A或B的HH的球体的IL-8水平与HSC 1号的球体相比较低(图8B)。

具有来自供体D的HH和HSC 1号的球体产生的IL-8水平明显高于具有来自供体A的HH和HSC 1号的球体。具有来自供体A的HH和HSC 2号的球体产生的IL-8水平明显高于具有来自供体A的HH和HSC 1号的球体。具有来自供体B或C的HH和HSC 2号的球体产生的IL-8水平明显高于具有来自供体A的HH和HSC 2号的球体(图9)。

结论

本发明的球体显示了纤维化NASH表型特征性的得到组织学证实的脂肪变性、炎性和纤维化表型诱导(实施例1)。此外，可以观察到球体在它们对NASH培养条件的反应方面存在显著个体间差异(实施例2)。事实上，在本发明的球体中共培养HH、HK、LEC和HSC产生了能模拟所观察的NASH特征(脂肪变性、气球样变性、促炎性细胞因子产生)的肝球体。遗传背景的影响(I148M PNPLA3和TM6SF2 E617K突变以及代谢紊乱)表明，该NASH球体模型适合于研究遗传基础和风险因素对疾病进展的影响。可以将4种肝细胞类型(肝细胞、星状细胞、库弗细胞和内皮细胞)的确切量、不同的遗传背景以及来源于具有不同病因(如2型糖尿病、高BMI)的供体的细胞的纳入组合起来以研究这些因素对疾病表型的影响。

该模型的模块特征允许使用具有特定遗传背景的特定肝细胞类型，从而允许研究驱动NASH的分子和代谢途径。