一种甘蓝型油菜SNP分子标记组合及其应用

技术领域

本发明属于分子植物育种领域，具体涉及一种甘蓝型油菜SNP分子标记组合及其应用。

背景技术

油菜是重要的油料作物之一，是食用植物油的主要来源。油菜栽培利用历史十分悠久，但产量水平较低，品质较差。

在油菜的种业育种发展上，现有的育种方法的效率很低，需要一些高效的，低成本的育种方法和工具实现高效快速的育种。而现有的支持油菜育种的技术主要为测序和固相芯片检测，测序是将样品的整个基因组序列检测出来，成本较高一般一个样品价格在500元以上，周期较长为30天，并且产生的数据量大，需要专业的分析人员处理，难以普及应用到种业育种生产。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种甘蓝型油菜SNP分子标记组合。

本发明还提出一种具有上述甘蓝型油菜SNP分子标记组合的基因芯片。

本发明还提出一种上述甘蓝型油菜SNP分子标记组合和基因芯片的应用。

根据本发明的一个方面，提出了一种甘蓝型油菜SNP分子标记组合，所述甘蓝型油菜SNP分子标记组合由1407个SNP分子标记组成，所述1407个SNP分子标记如BN0001-1407所示；所述1407个SNP分子标记的物理位置是基于油菜的参考基因组Brana_Dar_V10进行序列比对确定的，位点信息具体如下：

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在本发明的第二方面，提出了一种甘蓝型油菜SNP芯片，所述甘蓝型油菜SNP芯片包括用于检测所述甘蓝型油菜SNP分子标记组合的探针和/或引物。

在本发明的一些实施方式中，所述SNP芯片包含用于检测上述的甘蓝型油菜SNP分子标记组合的液相探针。通过制备SNP芯片，结合液相探针杂交的靶向基因型分型技术，容易实现标准化自动化检测和分析。

在本发明的第三方面，提出了一种试剂盒，所述试剂盒包含用于检测甘蓝型油菜SNP分子标记组合的探针和/或引物。

在本发明的第四方面，提出了上述甘蓝型油菜SNP分子标记组合、试剂盒或甘蓝型油菜SNP芯片的应用，所述应用为在甘蓝型油菜基因分型中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在甘蓝型油菜全基因组关联分析中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在甘蓝型油菜聚类分析中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在甘蓝型油菜亲缘关系鉴定中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在甘蓝型油菜育种或辅助育种中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述育种或辅助育种包括辅助的主效基因选择、回交育种及其背景选择、全基因组选择育种、分子辅助育种、种子纯度检测、转基因成份鉴定、QTL分析、物种进化分析和种质资源鉴定中的至少一种。

一种甘蓝型油菜育种方法，包括如下步骤：利用上述甘蓝型油菜SNP分子标记组合、试剂盒或甘蓝型油菜SNP芯片对待测甘蓝型油菜DNA进行检测，选择甘蓝型油菜进行后续育种。

在本发明的一些实施方式中，所述检测基于多重PCR和测序进行。

根据本发明的一些实施方式，至少具有以下有益效果：本发明通过筛选出一套共1407个高质量和高多态性的SNP标记(在354份油菜品种中的MAF值都高于>=0.15)，标记为共显性标记，特异性、灵敏度、分辨力高，具有广泛的应用普适性；标记不受环境条件影响，能够使用种子或任何类型的植物组织，检测结果准确、重复性和稳定性好；不同检测实验室和不同的数据结果可以相互比较验证，数据具有普适的可比性。将其制备得到1,5K SNP芯片，能够快速、高通量、低成本实现对油菜样品全基因组SNP的检测，可以有效用于甘蓝型油菜育种或辅助育种。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例1中的位点开发流程图；

图2为本发明实施例1中的油菜SNP位点在染色体上的分布图；

图3为本发明实施例2中的基于多重PCR及二代测序的检测流程图；

图4为本发明实施例2中的聚类分析图；

图5为本发明实施例2中的进化树图；

图6为本发明实施例3中的染色体差异图结果图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供了一种甘蓝型油菜SNP分子标记组合，包括1407个SNP位点，每个SNP位点包含两个不同碱基变异位点，用于检测该位点的等位基因变化，所述1407个SNP位点的物理位置是基于油菜的参考基因组（Brana_Dar_V10）序列比对确定的，所述1407个SNP分子标记如发明内容部分BN0001-1407（具体信息如表格中）所示。其筛选过程如图1所示，具体如下：

1、甘蓝型油菜种质资源数据的获取

用浙江大学276份油菜核心种质材料提取重测序数据加上78份湖南省内的核心种质资源进行重测序获取到的数据一起形成构建甘蓝型油菜种质资源数据库

2、甘蓝型油菜SNP位点的提取和筛选

用得到的354份核心种质资源的数据进SNP提取，并对位点进行多态性分析，最后得到53584个SNP位点。对收集到的53584个SNP位点，在参考油菜基因组Brana_Dar_V10上进行标记位点比对，设置长度约500K位点选择，得到2088个匹配位点良好位点。

3、1600个甘蓝型油菜全基因组标记的合成和精选

进一步对2088个设计的标记在油菜的参考基因组（Brana_Dar_V10）进行序列比对，得到1600个特异性最好的标记位点进行合成，对1600位点进行引物设计及拷贝数分析，并且选取78份油菜资源进行基因分型验证，精选出1407个高多态性、数据检出率>97%的标记，能够用于油菜样品的全基因组SNP检测，本发明的SNP位点在油菜染色体的分布图如图2所示。

以上述获得的1407个SNP位点为基础，设计引物并制备检测所述1407个SNP位点的1.5K全基因组液相基因芯片。

实施例2

本实施例提供一种基于甘蓝型油菜SNP标记分子标记组合在甘蓝型油菜聚类分析及亲缘关系鉴定中的应用。

对77个甘蓝型油菜样本进行检测，具体方法如图3所示，具体为：DNA提取、目标区段扩增、接头连接、文库质检与测序分析。

1.DNA提取

按照华智生物技术有限公司自主研发方法进行DNA的提取并采用酶标仪质控，合格后进入下一阶段。

2.目标区段扩增

(1)利用华智生物技术有限公司自主研发的1.5K油菜液相基因芯片对DNA样品进行PCR扩增；

(2)对扩增产物进行片段大小质控，片段达到300bp左右后进入下一阶段实验。

3.接头扩增

将获得的目标区段产物加入接头进行第二轮PCR扩增，获得最终文库。

4.文库质检

QubitFluorometric Quantitation(Thermo Fisher)对文库的DNA浓度进行测定，然后用琼脂糖凝胶电泳检测文库DNA的片段大小是否在300-400bp之间。

5.DNA杂交捕获文库测序

将构建好的DNA文库由华智生物技术有限公司测序组进行测序。

6.基因型数据分析

测序数据经过：FastQC(www.bioinformatics.babraham.ac.uk/project)质控后，用BWA(bio-bwa.sourceforge.net)的默认参数将测序数据比对到参考基因组上，用GATK(software.broadinstitute.org/gatk)软件对测序数据进行SNP鉴定，对77份材料进行聚类分析。

结果如图4-5所示，从图4中可以看出，在2的时候K值最优，材料的分类效果最好，分为两类，从图5中可以看出，两类的材料中对应的样品有明显的遗传背景差异，并且随着分类树的增多，差异越大；根据以上结果，可以选择出遗传差异较大的材料株系作为核心亲本用于后续育种选择。

结果表明本发明方案的甘蓝型油菜SNP标记分子标记组合可以有效用于甘蓝型油菜聚类分析及亲缘关系鉴定。

实施例3

一种基于甘蓝型油菜SNP标记分子标记组合亲缘关系鉴定中的应用。包括如下步骤：

已知亲缘关系的2份甘蓝型油菜材料：一份为受体亲本，一份为多世代的轮回株系。

（1）将2份材料进行测序后（检测方法同实施例2一致）得到的数据采用1.5K芯片分析；

（2）比对位点统计结果回复率为97.41%；

（3）对位点进行染色体作图分析，可视化分析差异位点在染色体位置；

可视化分析差异位点在染色体位置的结果图结果如图6所示，从图6中可以看出：

A、两个材料之间相似度很高，只有少量位点存在差异；

B、明显的两个材料在C03和C09上存在较多区段差异，其他的很少；

C、针对回复的区段可以重点考虑以上染色体区段进行标记检测，从而高效的实现目标区段改良。

结果表明本发明方案的甘蓝型油菜SNP标记分子标记组合可以有效用于亲缘关系鉴定。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。