甘氨酸/谷氨酰胺富集序列在提高木聚糖酶活性中的应用

技术领域

本发明属于植物保护领域，涉及甘氨酸/谷氨酰胺富集序列(G/Q-rich motif)在提高木聚糖酶活性中的应用。

背景技术

木聚糖酶是专一性水解木聚糖主链的酶，它将大分子木聚糖降解成低聚木糖、木二糖及少量的木糖。很多有益微生物产生的木聚糖酶，已广泛地应用于面包焙制、淀粉加工、饲料、纸浆生物漂白等领域。提高木聚糖酶活性，对于解决能源问题具有重要意义。木聚糖酶的活性与所处环境的温度和PH值有关，一些激活剂和抑制剂也能影响酶的活性。将环境温度和pH值分别调到最适温度和最适pH值，同时加入一些增强剂，可增强木聚糖酶的活力。然而，有效的增强剂较少。因此，目前缺少增强木聚糖酶活力的有效方式。

禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病严重威胁我国小麦安全生产。病麦粒中产生的玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)等毒素，严重威胁着人类和动物健康。禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)的毒力因子BCG1，具有极高的木聚糖酶活性，其C端含有一个由54个氨基酸组成的未知功能的甘氨酸/谷氨酰胺富集序列(G/Q-rich motif)，目前没有报道过甘氨酸/谷氨酰胺富集序列的具体功能。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供甘氨酸/谷氨酰胺富集序列(G/Q-rich motif)在提高木聚糖酶活性中的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

SEQ ID NO.1所示的甘氨酸/谷氨酰胺富集序列在提高BCG1同源蛋白木聚糖酶活性中的应用。

作为本发明的一种优选，所述的BCG1同源蛋白为C端不含甘氨酸/谷氨酰胺富集序列的BCG1蛋白。

作为本发明的一种优选，在没有甘氨酸/谷氨酰胺富集序列的BCG1蛋白的C端，融入SEQ ID NO.1所示的甘氨酸/谷氨酰胺富集序列以提高出发BCG1蛋白的木聚糖酶活性。

甘氨酸/谷氨酰胺富集序列在调控BCG1同源蛋白木聚糖酶活性中的应用。

作为本发明的一种优选，通过在没有甘氨酸/谷氨酰胺富集序列的BCG1蛋白的C端，融入SEQ ID NO.1所示的甘氨酸/谷氨酰胺富集序列以提高BCG1蛋白的木聚糖酶活性。

作为本发明的一种优选，通过敲除具有木聚糖酶活性的BCG1蛋白的甘氨酸/谷氨酰胺富集序列以降低BCG1蛋白的木聚糖酶活性。

有益效果：

禾谷镰刀菌(F.graminearum)中的毒力因子FgBCG1及其同源蛋白，来自尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的FoBCG1、轮枝镰刀菌(F.verticillioides)的FvBCG1均具有很高的木聚糖酶活性，表明镰刀菌属的BCG1具有保守的木聚糖酶活性。同时我们也检测了不具有G/Q-rich motif的BCG1同源蛋白的木聚糖酶活性，包括稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的MoBCG1、黄曲霉(Aspergillus flavus)的AfBCG1。与FgBCG1、FoBCG1和FvBCG1相比，这些没有G/Q-rich motif的MoBCG1、AfBCG1蛋白表现出较弱的木聚糖酶活性。我们进一步检测了缺失G/Q-rich motif的截断蛋白FgBCG1

我们在不含有G/Q-rich motif的两个蛋白MoBCG1、AfBCG1的C端，分别融入一个Fg中的G/Q-motif。结果显示，其木聚糖酶活性显著增加，更好的降解植物细胞壁侵染植物。说明G/Q-rich motif可以作为一个增强子，显著提高蛋白的木聚糖酶活性。该发现表明G/Q-rich motif在农业生产中具有显著提高木聚糖酶活性的应用前景。

附图说明

图1 BCG1的G/Q-rich motif仅在镰刀菌属中高度保守(A)BCG1蛋白的序列特征；(B)基于RPB2构建系统发育树；(C)Weblogo 3显示各蛋白的G/Q-rich motif序列。

图2 G/Q-rich motif的缺失导致蛋白的木聚糖酶活性降低

图3 G/Q-rich motif的增加显著提高蛋白的木聚糖酶活性

具体实施方式：

实施例1BCG1的G/Q-rich motif仅在镰刀菌属中高度保守

实验方法：

利用ClustalW对蛋白进行序列比对，通过ENDscript/ESPript 3.0网站对序列比对结果可视化。

实验结果：禾谷镰刀菌F.graminearum的BCG1包含一个新的G/Q-rich motif。我们基于RPB2蛋白序列构建了系统发育树，研究了BCG1在不同生物中的系统发育分布。结果发现，G/Q-rich motif序列高度保守，广泛存在于镰刀菌属中，如来自尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的FoBCG1、轮枝镰刀菌(F.verticillioides)的FvBCG1均存在G/Q-richmotif序列，但在其他生物中未发现含有G/Q-rich motif的同源蛋白。

实施例2G/Q-rich motif的缺失导致蛋白的木聚糖酶活性降低

实验方法：

蛋白表达与纯化：将表1蛋白NCBI登录号(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)发给南京钟鼎生物技术有限公司，委托其进行蛋白表达与纯化。

DNS法测定蛋白的木聚糖酶活性

(1)试剂配制

乙酸-乙酸钠(CH

称取40.8gCH

DNS：购买于索莱宝公司，货号为D7800。

(2)木聚糖酶活力测定

在灭菌的1.5mL EP管中，加入150μL 1％山毛榉材木聚糖乙酸-乙酸钠溶液(pH5.2)作为反应底物，在40℃金属浴中保温10min。加入30μL浓度适宜的上述纯化蛋白稀释液与反应底物混合，在40℃水浴中精确反应10min后，立即加入350μL DNS试剂来终止反应，在100℃水浴中煮沸5min，冷却后加入500μL ddH

(3)绘制木糖的标准曲线

称取1.0g木糖加水溶解后定容至100mL，配成10mg/mL的木糖溶液，用乙酸-乙酸钠缓冲液配制成浓度为0，0.2，0.4，0.5，0.6，0.8，1mg/mL木糖标准溶液，OD

根据木糖标准曲线，计算出蛋白中对应木糖的含量，进而得出各蛋白的木聚糖酶活力。在40℃，PH为5.2条件下，以每分钟催化生成1μmol木糖作为1个酶活单位，记作1个U。每个样品测定三次，取平均值。

实验结果：公司成功纯化出跟预期大小一致的蛋白。木聚糖酶活性测定实验表明，含有G/Q-rich motif的蛋白，来自禾谷镰刀菌(F.graminearum)的FgBCG1，尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的FoBCG1、轮枝镰刀菌(F.verticillioides)的FvBCG1，具有很高的木聚糖酶活性。稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的MoBCG1、黄曲霉(Aspergillus flavus)的AfBCG1，这些没有G/Q-rich motif的蛋白表现出较弱的木聚糖酶活性。缺失G/Q-richmotif的截断蛋白FgBCG1

实施例3G/Q-rich motif作为增强子，增强蛋白的木聚糖酶活性

实验方法：

蛋白表达与纯化：委托南京钟鼎生物技术有限公司在没有G/Q-rich motif的MoBCG1，AfBCG1蛋白C端分别融合FgBCG1的G/Q-motif序列(即FgBCG1序列最后的54个氨基酸)后，表达并纯化这两个蛋白。

DNS法测定木聚糖酶酶活：与实施例2方法一致。

实验结果：公司成功纯化出跟预期大小一致的蛋白。木聚糖酶活性测定实验表明，没有G/Q-rich motif蛋白的C端融入禾谷镰刀菌中的G/Q-rich motif，显著增强蛋白的木聚糖酶活性(图3)。说明G/Q-rich motif可以作为一个增强子，增强蛋白的木聚糖酶活性。