一种检测2,6-二氧杂螺4,5癸烷类化合物或其盐中杂质的方法

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及采用高效液相色谱方法检测2,6-二氧杂螺[4,5]癸烷类化合物或其盐中杂质的方法。

背景技术

阿片受体是一类以阿片样肽为配体的G蛋白偶联受体，μ、κ和δ受体是经典的三类阿片受体。阿片受体在体内分布广泛，但在神经系统的分布不均匀。在脑内、丘脑内侧、脑室及导水管周围灰质阿片受体密度较高，这些结构与痛觉的整合及感受有关。阿片类药物是目前临床上最有效的镇痛药物，但通常容易引起一些与靶点相关的副作用，如：呼吸抑制，便秘等。阿片类GPCR受体与配体结合后可以同时影响多条下游信号通路，包括Gi蛋白信号通路及β-Arrestin信号通路。目前研究表明，阿片类药物的镇痛作用来源于μ受体的Gi蛋白信号通路，而相关的副作用，如：呼吸抑制，便秘等，则与μ受体下游的β-Arrestin信号通路相关。与野生型小鼠相比，在β-Arrestin-2基因敲除的小鼠上注射吗啡后镇痛作用增强，且药效时间延长，而相关不良反应减弱。因此，Gi蛋白偏向性μ受体激动剂可以选择性激活Gi信号通路，而对β-Arrestin通路没有影响，或影响较小。因此，可以预期Gi蛋白偏向性μ受体激动剂在临床上有更好的镇痛作用，而阿片类相关不良反应则大大减少。

中国发明专利CN111148515 B公开了一系列Gi蛋白偏向性μ受体激动剂，其中包括式（I）所示的2,6-二氧杂螺[4,5]癸烷类化合物。

按照CN111148515B公开的制备方法得到的式（I）化合物含有多种杂质，且结构类似，因此大大增加了同时检测原料药中多种杂质的难度。而药物中含有杂质会降低其疗效和影响其稳定性，甚至对人体健康有害或产生其他副作用。因此，对杂质进行检测，控制药物纯度，以控制药物质量至关重要。

为了有效控制式（I）化合物及其盐的杂质含量，提高药物安全性，有必要开发一种专属性好、分离度高的检测方法。

发明内容

本发明提供了一种检测式（I）化合物或其盐中杂质的方法。

本发明采用的技术方案如下。

采用高效液相色谱技术，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为辛烷磺酸钠及磷酸二氢钾的缓冲盐溶液，流动相B为乙腈。

在一些实施方式中，所述杂质包括杂质A、B、C、D、E、F、G和/或H，其结构式如下所示：

在一些实施方式中，上述任意一种检测方法所述的色谱柱为Waters SymmetryShield RP18或Inertsil ODS-2，优选为Waters Symmetry Shield RP18。

在一些实施方式中，上述任意一种检测方法所述的流动相A中还含有三乙胺。

在一些实施方式中，上述任意一种检测方法所述的流动相A中含有0.0025 mol/L辛烷磺酸、0.01 mol/L磷酸二氢钾、0.1%三乙胺。

在一些实施方式中，上述任意一种检测方法所述的流动相A的pH为2.5 ± 0.05，优选以磷酸调节pH。

在一些实施方式中，上述任意一种检测方法所述的流动相采用等度洗脱，流动相A与流动相B比例为76:24。

在一些实施方式中，上述任意一种检测方法所述的流动相采用梯度洗脱，梯度条件如下：

在一些实施方式中，上述任意一种检测方法所述的流动相A的制备方法包括：称取辛烷磺酸钠、磷酸二氢溶于水中，加入三乙胺，用磷酸调节pH至2.5±0.05，混匀，超声过滤脱气，即得。

在一些实施方式中，上述任意一种检测方法所述的流动相流速为0.9 ~ 1.1 mL/min，优选为1.0 mL/min。

在一些实施方式中，上述任意一种检测方法所述的色谱柱的柱温为33 ~ 37 ℃，优选为35 ℃。

在一些实施方式中，上述任意一种检测方法所述的盐为马来酸盐、盐酸盐、硫酸盐、醋酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、硫酸盐、苹果酸盐、富马酸盐或柠檬酸盐。所述盐可采用本领域技术人员常规的方法进行制备，例如在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与式（I）化合物接触的方式获得酸加成盐。

在本发明的一个方面中，所述检测方法，包括如下步骤：

（1）制备稀释剂。

（2）制备供试品溶液：称定式（I）化合物或其盐，用稀释剂进行溶解，配制成供试品溶液。

在一些实施方式中，上述任意一种检测方法中，所述稀释剂含有乙腈和水，乙腈与水的体积比为1:1 ~ 1:4。

在一些实施方式中，上述任意一种检测方法中，采用面积归一化法或外标法计算杂质含量。

杂质A~G可按照常规方法进行制备，例如杂质A~E和杂质G可参照CN111148515B的制备方法进行制备，杂质H可采取以下方法制备：

。

本发明具有如下的优点及有益效果：

1. 具有优异的专属性，可以对多种结构类似的杂质实现有效分离；主成分与相邻杂质、各杂质之间的分离度均大于1.5。

2. 能同时检测多种杂质，效率更高，成本更低。

3. 灵敏度高，检测限和定量限低，能够对痕量的的杂质进行检测和定量分析。

附图说明

图1为实施例2中三氟乙酸体系下色谱柱Ultimate C18的色谱图。

图2为实施例2中三氟乙酸体系下色谱柱YMC-Pack Pro C18 RS的色谱图。

图3为实施例2中三氟乙酸体系下色谱柱ACE C18-PFP的色谱图。

图4为实施例2中乙酸铵体系下流动相A的pH为6.7的色谱图。

图5为实施例2中乙酸铵体系下流动相A的pH为9.0的色谱图。

图6为实施例2中乙酸铵体系下流动相A的pH为4.2的色谱图。

图7为实施例2中磷酸体系下色谱柱ACE Excel 2 C18的色谱图。

图8为实施例2中磷酸体系下色谱柱YMC Triart C18的色谱图。

图9为实施例2中辛烷磺酸钠-磷酸二氢钾体系下的色谱图。

图10 为实施例3色谱柱研究的色谱图。

图11为实施例5中梯度1的色谱图。

图12为实施例5中梯度2的色谱图。

图13为实施例6杂质混合液的色谱图。

具体实施方式

以下结合实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

实施例1 式（I）马来酸盐的制备

式（I）化合物（按照CN111148515 B的方法制备）中加入乙酸乙酯（0.63 kg）复溶，0.45μm滤膜过滤，用乙酸乙酯（0.4 kg）洗涤，滤液合并至5 L反应釜中。控温20～25 ℃，滴加马来酸（80 g）的乙酸乙酯（2 kg）溶液，滴毕，保温20～25 ℃，搅拌2～3小时。抽滤，用乙酸乙酯（0.8 kg）洗涤滤饼，干燥得白色固体，即式（I）马来酸盐207.28 g。HRMS m/z：405.1779，407.1736 [M+1]+1。H NMR(600MHz, DMSO-d6) δ8.57-8.60(q,1H), 8.50-8.70(brs，1H), 7.74-7.77 (td，J=3.0 Hz，1H), 7.61-7.63(q，J=4.2 Hz，1H), 7.49(m，1H),7.46-7.47(m，1H), 7.44(m，1H), 7.33,7.34(d，J=7.2Hz，1H), 6.03,6.04 (d，J=14.2，Hz，2H), 4.41(s，2H), 3.70-3.73(m，1H)，3.63-3.65(m，1H), 3.52-3.60(m，2H), 3.45，3.68(d，J=9.6Hz，2H), 2.77-2.82(m，1H), 2.38-2.40(m，1H), 2.28-2.32(m，1H), 1.97-2.02（m，1H），1.84, 2.39(d，J=13.8Hz，2H), 1.62-1.66（m，1H），1.28-1.32(m，1H),1.06～1.11(m，1H)。

实施例2 流动相体系的研究

2.1试验仪器：高效液相色谱仪：Agilent-1290

2.2溶液的配制

表1 强制降解样品溶液的配制

稀释剂：量取200mL乙腈，800mL水，混合均匀即得。

杂质储备液：精密称取杂质A、B、C、D、E、F、G和H各约19mg，置同一100mL量瓶中，加入适量稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。其中各杂质浓度为190μg/mL。

分离度溶液：精密称取一定式（I）马来酸盐约32mg置于25mL量瓶中，精密吸取杂质储备液0.25mL至上述量瓶中，加适量稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。其中式（I）马来酸的浓度约为1.29mg/mL；杂质A、B、C、D、E、F、G和H浓度约为1.9μg/mL。

未破坏供试品溶液：取式（I）马来酸盐约32mg，精密称定，置25mL量瓶中，加10mL稀释剂超声溶解，用稀释剂稀释定容至刻度，摇匀，即得。

2.3试验方法和试验结果

考察不同色谱条件下的分离度，三氟乙酸体系采用强制降解样品溶液和未破坏供试品溶液，乙酸铵体系、磷酸体系、辛烷磺酸钠-磷酸二氢钾体系采用分离度溶液，具体试验条件和试验结果见表2-表5和图1-图9。

2.3.1三氟乙酸体系

表2 三氟乙酸体系色谱条件和试验结果

2.3.2 乙酸铵体系

表3乙酸铵体系色谱条件和试验结果

2.3.3 磷酸体系

表4 磷酸体系色谱条件和试验结果

2.3.4 辛烷磺酸钠-磷酸二氢钾体系

表5 辛烷磺酸钠-磷酸二氢钾体系体系色谱条件和试验结果

试验结果表明，由于杂质多且结构相似，多种流动相体系下主成分与杂质，或各杂质之间的分离度无法满足基本要求，仅辛烷磺酸钠-磷酸二氢钾体系的分离度较高，符合要求。

实施例3 色谱柱的研究

3.1色谱条件

流动相A：0.0025mol/L辛烷磺酸钠（0.01M磷酸二氢钾、0.1%三乙胺，磷酸调pH2.5）溶液；

流动相B：乙腈；

检测波长：210 nm；

流速：1 mL/min；柱温：35℃；进样体积：10μL。

色谱柱：见表6

表6 色谱柱型号

梯度洗脱：见表7

表7 流动相梯度

3.2 试验方法和试验结果

采用实施例2中的分离度溶液，按3.1所述色谱条件，考察三款色谱柱的分离度，试验结果见表8和图10。

表8 三款色谱柱的筛选结果

* RT指保留时间

结果显示：从三款色谱柱的筛选结果可知，杂质A和杂质B、杂质E和主成分化合物（I）较难分离。色谱柱2中杂质E和主成分化合物（I）的分离度小于1.5，色谱柱3可基本实现分离，色谱柱1对两组的分离度均为2.4，较另外色谱柱2和3分离效果好。

实施例4 波长的选择

采用实施例3的色谱条件，色谱柱为Waters Smmetry Shield RP18( 4.6 × 150mm, 3.5μm )。

采用实施例2中的分离度溶液，使用DAD检测器，采用全波长扫描，考察主成分及杂质的最大吸收波长，结果见表9，主成分及杂质的吸收峰均在210nm附近及268nm附近。

表9 主成分、已知杂质波长汇总表

选择主成分和杂质的吸收峰附近210nm和268nm波长考察溶液高温降解及酸降解测定结果，结果对比见表10和表11。

表10 不同波长下溶液高温降解测定结果

RRT：相对保留时间，RT：保留时间

表11 不同波长下酸降解测定结果

结论：杂质在210nm波长下的紫外吸收较268nm强，酸降解样品在210nm的杂质检测个数较268nm的多，优选210nm。

实施例5 洗脱梯度的研究

流动相的梯度洗脱条件如表12所示，色谱柱为Waters Smmetry Shield RP18(4.6 × 150 mm, 3.5μm )，其他色谱条件与实施例3相同，分析强制降解样品溶液（按照实施例2的方法配制）。试验结果见图11和图12。

表12 流动相梯度条件

结论：梯度1的条件下，碱破坏、固体高温及溶液高温条件下的样品30min后仍有降解杂质洗脱出来，分析时间过长。梯度2的条件下，主成分与相邻杂质及各杂质峰之间均能有效分离，且相对于梯度1可以缩短分析时间。

实施例6 专属性试验

6.1 杂质A~H混合液的色谱分析

色谱柱为Waters Smmetry Shield RP18( 4.6 × 150 mm, 3.5μm )，其他试验条件与实施例3相同。

按照实施例2的方法配制分离度溶液，考察分离度。测定结果见表13，色谱图见图13。

表13 杂质A~H混合溶液测定结果

结论：相邻杂质以及各杂质与主成分间的分离度均大于1.5，表明方法对于已知杂质分离度良好。

6.2降解杂质专属性试验

分别在酸、碱、氧化、高温、高湿、光照条件下处理样品供试品，测定其分析结果。

6.2.1 强酸解试验

分别取酸破坏空白、未破坏样品及酸破坏样品进样分析，结果见表14。

表14 酸降解试验样品测定结果

结论：酸降解条件下新增杂质RRT0.21和RRT0.35，已知杂质与相邻杂质、主成分与相邻杂质的分离度均大于1.5，该方法对酸降解样品分离良好。

6.2.2碱解试验

分别取碱降解空白、未破坏样品、碱破坏样品进样分析，结果见表15。

表15 碱降解试验样品测定结果

结论：碱降解条件下新增杂质RRT0.20、RRT0.75、RRT2.12和RRT2.29共4个杂质，已知杂质与相邻杂质、主成分与相邻杂质的分离度均大于1.5，该方法对碱降解样品分离良好。

6.2.3氧化试验

分别取氧化降解空白、未破坏样品、氧化破坏样品进样分析，结果见表16。

表16 氧化试验样品测定结果

结论：氧化降解出12个杂质，已知杂质与相邻杂质、主成分与相邻杂质的分离度均大于1.5，该方法对氧化降解样品分离良好。

6.2.4高温试验

分别取空白、未破坏样品、高温破坏样品进样分析，结果见表17。

表17 高温试验样品测定结果

结论：固体高温下无新增杂质产生，溶液高温下新增杂质RRT2.13。各杂质与相邻杂质、主成分与相邻杂质间的分离度均大于1.5，该方法对高温样品的分离良好。

6.2.5高湿试验

分别取空白、未破坏样品、高湿破坏样品进样分析，结果见表18。

表18 高湿试验样品测定结果

结论：高湿破坏条件下，新增杂质RRT0.25。各相邻杂质、主成分和相邻杂质间的分离度均大于1.5，该方法对高湿降解样品分离良好。

6.2.6光照试验

分别取空白、未破坏样品、光照破坏样品进样分析，结果见表19。

表19 光照试验样品测定结果

结论：已知杂质与相邻杂质、主成分与相邻杂质间的分离度均大于1.5，该方法对各种降解条件的样品分离良好。