一种茶黄素衍生物的制备方法

技术领域

本发明涉及有机合成领域，具体为一种茶黄素衍生物的制备方法。

背景技术

茶黄素由不同儿茶素单体在多酚氧化酶或过氧化物酶作用下氧化耦合生成，是一类具有苯骈卓酚酮结构的多酚类化合物，是茶叶发挥健康疗效的主要有效成分。

目前已发现并鉴定的茶黄素类化合物有28个，其中茶黄素(TF1)、茶黄素-3-没食子酸酯(TF2A)、茶黄素-3'-没食子酸酯(TF2B)、茶黄素-3,3’-双没食子酸酯(TF3)是4种最主要的茶黄素类物质。茶黄素具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌及抗增殖等作用，是一类极具开发潜力的天然产物，对茶黄素进行结构修饰获得具有更多功效的茶黄素衍生物已经成为目前的研究重点。

发明内容

发明目的：针对上述技术趋势，本发明提出了一种茶黄素衍生物的制备方法。

所采用的技术方案如下：

一种茶黄素衍生物的制备方法，包括以下步骤：

S1：对表没食子儿茶素没食子酸酯上的羟基进行保护，得到中间体A；

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S2：对中间体A的酯键进行水解，得到中间体B；

S3：向中间体B中引入六酚基间三联苯结构，得到中间体C；

S4：对中间体C脱保护得到中间体D；

S5：中间体D与儿茶素在PPO催化下反应得到所述茶黄素衍生物。

进一步地，S1具体如下：

保护性气体氛围下，将表没食子儿茶素没食子酸酯用DMF溶解，再加入溴化苄和碳酸钾，60-80℃搅拌反应3-5h，反应产物纯化得到中间体A。

进一步地，S2具体如下：

将中间体A用DMF溶解，加入氢氧化钠，升温至回流反应3-8h，反应产物纯化得到中间体B。

进一步地，S3具体如下：

将中间体B和3,3”，4,4'，5,5”-六羟基-[1，1':3'，1”-三苯基]-5'-羧酸加入DMF中，以浓硫酸为催化剂，升温至70-90℃反应5-10h后减压浓缩除去溶剂，加入乙酸乙酯和水萃取、分液后，取乙酸乙酯相柱层析提纯得到中间体C。

进一步地，S4具体如下：

将中间体C、醋酸加入甲醇中，加入铂炭催化剂，通入氢气升温至60-65℃反应8-15h，反应结束后冷却至室温，过滤，滤液减压浓缩除去溶剂，加入乙酸乙酯和水萃取、分液后，取乙酸乙酯相柱层析提纯得到中间体D。

进一步地，S5具体如下：

将中间体D与儿茶素加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中，加入乙醇帮助溶解，振荡30-50min后，加入PPO，摇匀，30-40℃反应2-5h，期间间歇振荡，反应结束后离心，取上清液，减压浓缩除去乙醇后用乙酸乙酯萃取，柱层析提纯即可得到所述茶黄素衍生物。

进一步地，所述PPO提取自梨中，优选为秋月梨。

进一步地，所述PPO的制备方法如下：

将秋月梨切碎，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，捣碎匀浆，2-5℃浸提10-15h，离心取上清液，加入固定化载体，30-40℃搅拌吸附3-5h后过滤，所得固体用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液洗涤后真空冷冻干燥即可。

进一步地，所述固定化载体为氨基化介孔二氧化硅。

进一步地，所述氨基化介孔二氧化硅的制备方法如下：

将十六烷基三甲基溴化铵、椰油酰甘氨酸钠、水混合，搅拌均匀，加入硫酸，继续搅拌50-80min后，滴加正硅酸乙酯，滴毕后搅拌24-48h，加入氨水，搅拌1-5min，升温至75-85℃老化24-48，分离出固体，水洗后干燥再升温至580-660℃煅烧3-5h，煅烧产物加入无水甲苯中，再加入氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌均匀，升温至回流反应10-15h，反应产物洗涤后干燥即可。

本发明的有益效果：

茶黄素体外酶法合成工艺已经比较成熟，发明人从表没食子儿茶素没食子酸酯出发引入了六酚基间三联苯结构，所制得的茶黄素衍生物相比于茶黄素DPPH自由基清除能力有较大的程度的提高，PPO广泛存在于茶鲜叶及其他植物和微生物中，发明人通过体外模拟氧化系统，以植物源PPO进行酶促氧化，以氨基化介孔二氧化硅为固定化载体制备了固定化PPO，使其具有更高的活性、pH耐受性及热稳定性，具有更高的反应产率。

附图说明

图1为本发明实施例1中茶黄素衍生物的制备方法路线图。

具体实施方式

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本发明未提及的技术均参照现有技术。

实施例1：

一种茶黄素衍生物的制备方法：

S1：在氮气保护下，取45.8g表没食子儿茶素没食子酸酯用500mLDMF溶解，再加入171g溴化苄和110g碳酸钾，升温至60-80℃搅拌反应3-5h，反应液冷却至室温后加入硅胶拌样柱层析(石油醚：乙酸乙酯：甲醇＝5:2:1)，得到中间体A，收率53.5％；

S2：取50g中间体A用500mL DMF溶解，加入8.5g氢氧化钠，升温至回流反应3-8h，反应液冷却至室温后加入硅胶拌样柱层析(石油醚：乙酸乙酯：甲醇＝5:2:1)，得到中间体B，收率80.3％；

S3：将20g中间体B和7.2g 3,3”，4,4'，5,5”-六羟基-[1，1':3'，1”-三苯基]-5'-羧酸加入200mL DMF中，加入5mL浓硫酸作为催化剂，升温至70-90℃反应5-10h后减压浓缩除去溶剂，加入乙酸乙酯和水萃取、分液后，取乙酸乙酯相加入硅胶拌样柱层析(石油醚：乙酸乙酯：甲醇＝2:1:1)得到中间体C，收率37.2％；

S4：将200mL甲醇加入加氢反应釜中，再将10g中间体C、60mL醋酸、1g铂炭催化剂加入，先用氮气置换置换空气后再用氢气置换氮气，维持氢气氛围，升温至65℃反应8-15h，反应结束后冷却至室温，过滤，滤液减压浓缩除去溶剂，加入乙酸乙酯和水萃取、分液后，取乙酸乙酯相加入硅胶拌样柱层析(乙酸乙酯：甲醇＝1:2)得到中间体D，收率85.5％；

S5：将十六烷基三甲基溴化铵、椰油酰甘氨酸钠、670mL水混合，搅拌均匀，加入5mL浓硫酸，继续搅拌50-80min后，滴加33.5mL正硅酸乙酯，滴毕后搅拌24-48h，加入150mL氨水，搅拌1-5min，升温至75-85℃老化24-48，分离出固体，水洗后干燥再升温至580-660℃煅烧3-5h，煅烧产物加入5倍于其质量的无水甲苯中，再加入氨丙基三乙氧基硅烷(氨丙基三乙氧基硅烷与煅烧产物的质量比为1:1)，搅拌均匀，升温至回流反应10-15h，反应产物洗涤后干燥得到氨基化介孔二氧化硅，取10g秋月梨切碎，加入100mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，捣碎匀浆，2-5℃浸提10-15h，离心取上清液，加入5g氨基化介孔二氧化硅，30-40℃搅拌吸附3-5h后过滤，所得固体用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液洗涤后真空冷冻干燥即可得到PPO，取1.3g中间体D与0.87g儿茶素加入10mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中，加入5mL乙醇帮助溶解，振荡30-50min后，加入1g PPO，摇匀，30-40℃反应2-5h，期间间歇振荡，反应结束后离心，取上清液，减压浓缩除去乙醇后用乙酸乙酯萃取，加入硅胶拌样柱层析(乙酸乙酯：甲醇＝1:2)即可得到茶黄素衍生物，收率45.7％，纯度95.5％。

对比例1：

与实施例1基本相同，区别在于，S5中用市售介孔二氧化硅(北京中科科优科技)代替制备的氨基化介孔二氧化硅，S5收率30.6％，纯度94.3％。

对比例2：

与实施例1基本相同，区别在于，S5中煅烧产物不经过氨丙基三乙氧基硅烷处理，S5收率33.2％，纯度94.8％。

性能测试：

DPPH是一种很稳定的氮中心自由基，在溶液中呈深紫色，并且在517nm下具有强烈的吸收。在抗氧化试验中，抗氧化剂能直接清除DPPH，随着该自由基的减少，溶液的颜色也逐渐由深紫色变为无色，因此，可由吸光度的变化值来计算抗氧化剂的抗氧化能力。

DPPH母液的配制：精确称取7.2mg DPPH溶于25ml甲醇中，置于-20℃条件下避光保存，使用前取少量母液稀释5倍即的DPPH工作液，于517nm检测吸光值(A

分别取实施例1及对比例1-2所制备的茶黄素衍生物及市售茶黄素溶于甲醇中，配置成浓度为0.01μmol·mL

DPPH自由基清除率(％)＝[(A

测试结果如下表1所示：

表1：

由上述测试可知，本发明所制备的茶黄素衍生物相比于茶黄素DPPH自由基清除能力有较大的程度的提高。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。