一种改性细菌纤维素及其培养基和制备方法

技术领域

本发明是一种改性细菌纤维素及其培养基和制备方法，属于原位改性方法生产改性细菌纤维素技术领域。

背景技术

细菌纤维素(BC)是指在不同条件下，由醋酸菌属、土壤杆菌属、根瘤菌属和八叠球菌属等中的某种微生物合成的纤维素的统称，是一种生物大分子聚合物，具有众多优良性能如高纯度、高结晶度、高机械强度和良好的生物相容性的独特优势使其在食品、生物医学等行业广泛应用。

细菌纤维素的性能虽然优良，但为更好地应用于不同的场景中，还需有针对性的、通过原位改性的方法侧重提高细菌纤维素的某方面或某几方面的性能，或使细菌纤维素增加新的功能。原位改性，是指在细菌纤维素产生菌株的发酵过程中通过改变培养条件或向培养基中添加额外的改性剂来改变细菌纤维素的形态、机械性能、结晶度、再水化率和其他重要性能，成本较低、步骤简便。

但现有的细菌纤维素的原位改性方法局限较多：第一，细菌纤维素产生菌株大多为好氧菌，而好氧菌只能在其与培养基或空气的接触面产生细菌纤维素，因此细菌纤维素的生产条件受限；第二，受细菌纤维素产生菌株的限制，改性剂大多为可溶性而非不溶性的，这些不溶性的改性剂无法得到很好的利用，无法获得拥有更佳、更多性能的改性细菌纤维素；第三，不溶性的改性剂难以均匀悬浮分散于液体培养基中，导致无法获得均匀改性的细菌纤维素。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种改性细菌纤维素、及其所应用的HS-XGK-Mag培养基、和该改性细菌纤维素的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现。

本发明第一方面提供一种用于培养改性细菌纤维素产生菌株的HS-XGK-Mag培养基，以质量浓度计，在HS-XGK发酵培养基的基础上添加0.1g/L～2.5g/L的水不溶性改性剂厚朴酚。

根据本发明的一个实施例，以质量浓度计，HS-XGK-Mag培养基包括1.5g/L的厚朴酚、1.0g/L的黄原胶、7.5g/L的酵母粉、10g/L的蛋白胨、10g/L的Na

本发明第二方面提供一种HS-XGK-Mag培养基的配制方法，用于配制上述HS-XGK-Mag培养基，包括：

将葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、Na

向基础混合液中缓慢加入黄原胶，并于25℃-50℃温度下充分搅拌至其完全溶解，以得到基础悬浮体系；

向基础悬浮体系中缓慢加入厚朴酚，混匀，以得到HS-XGK-Mag培养基。

本发明第三方面提供一种改性细菌纤维素，改性细菌纤维素为FY-07菌株于上述HS-XGK-Mag培养基中培养得到的膜结构物质，改性细菌纤维素的的表面均匀且密集分布大量白色颗粒状厚朴酚，改性细菌纤维素中存在黄原胶和细菌纤维素的典型官能团，改性细菌纤维素的结晶度为60.6％、持水率大于17000％、溶胀率最高为4160.6％，改性细菌纤维素对革兰氏阳性菌和真菌的抑菌率最高至100％、对革兰氏阴性菌的抑菌率最高至72％，在改性细菌纤维素上培养的细胞活性大于94％。

本发明第四方面提供一种改性细菌纤维素的制备方法，包括：

扩大培养细菌纤维素产生菌株FY-07，以获得同时含有菌株FY-07和其产物细菌纤维素的种子液；

将种子液以0.1％～10％的接种量接种至液态的HS-XGK-Mag培养基中，25℃～37℃内培养18h～48h，以获得改性细菌纤维素膜；

将改性细菌纤维素膜从HS-XGK-Mag培养基中捞出，清理掉附着在改性细菌纤维素膜表面的细菌、残留培养基以及杂质，以得到改性细菌纤维素湿膜。

根据本发明的一个实施例，获得种子液的步骤中，包括：

将细菌纤维素产生菌株FY-07的菌液划线培养于含有0.1％(w/v)刚果红的LB固体培养基中，于25℃～37℃温度下培养24h，以获得FY-07单菌落；

挑取FY-07单菌落密集划线于LB固体斜面培养基中，于25℃～37℃下培养24h，以获得含有FY-07活菌株的细菌纤维素膜；

挑取含有FY-07活菌株的细菌纤维素膜，再次密集划线于LB固体斜面培养基中，于25℃～37℃下培养24h，以获得含有大量FY-07活菌株和细菌纤维素膜的培养基表面；

用100mL的无菌蒸馏水冲洗培养基表面，直至培养基表面上的FY-07活菌株和细菌纤维素膜脱离到无菌蒸馏水中，将含有FY-07活菌株和细菌纤维素膜的蒸馏水混匀，以获得种子液。

根据本发明的一个实施例，获得改性细菌纤维素湿膜的步骤中，包括：

将改性细菌纤维素膜从HS-XGK-Mag培养基中捞出，用无菌水进行冲洗；

用0.5M的NaOH溶液于100℃条件下浸泡处理冲洗后的改性细菌纤维素膜0.5h，以除去改性细菌纤维素膜中的菌体和残留培养基；

重复水洗步骤和浸泡步骤，直至改性细菌纤维素膜的pH值为中性，以得到改性细菌纤维素湿膜。

根据本发明的一个实施例，获得改性细菌纤维素湿膜后，进行干燥操作，以得到改性细菌纤维素干膜。

根据本发明的一个实施例，获得改性细菌纤维素干膜的操作中，干燥操作为烘干或真空冷冻干燥。

本发明的有益效果：

(1)本发明涉及一种用于培养改性细菌纤维素产生菌株的HS-XGK-Mag培养基，该培养基为稳定的悬浮体系，选用的悬浮剂为黄原胶，以此悬浮体系对细菌纤维素生产菌株进行原位改性法深层发酵生产改性细菌纤维素时，可使不溶性的改性剂厚朴酚稳定的悬浮分散于液态的培养基中，该培养基有助于获得性能均匀的原位改性细菌纤维素产物。

(2)本发明涉及一种HS-XGK-Mag培养基的配制方法，该配制方法主要通过在配制HS-XGK发酵培养基过程中，以黄原胶为悬浮剂，使不溶性的改性剂厚朴酚悬浮分散在液态培养基中以形成稳定的悬浮体系，该配置方法操作简便快捷，可快速获得稳定的HS-XGK-Mag培养基。

(3)本发明涉及一种改性细菌纤维素，该种改性细菌纤维素由FY-07菌株在HS-XGK-Mag培养基中进行深层发酵得到，具有优异的的抗菌性、较好的生物相容性，可在食品、生物医学等行业广泛应用。

(4)本发明涉及一种改性细菌纤维素的制备方法，利用该制备方法生产出的改性细菌纤维素具有较好的抗菌性和生物相容性，且该制备方法操作简单，可控性强。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为二甲基亚砜(a-c)和厚朴酚溶液(d-f)分别对木醋杆菌(A)和FY-07(B)的抑菌圈检测结果示意图；

图2为木醋杆菌(A)和FY-07菌株(B)在含有厚朴酚溶液培养基中的生长曲线图，以不添加厚朴酚溶液培养基中的生长曲线为对照(control)；

图3为不添加和添加黄原胶时厚朴酚在培养基中的悬浮情况示意图；

图4为厚朴酚在有无黄原胶的培养基中的悬浮情况和稳定性，图4-A、图4-B、图4-C图中厚朴酚的添加量分别为0.5g/L、1g/L、1.5g/L；

图5为不同厚朴酚添加量下所得FY-07细菌纤维素产物对金黄色葡萄球菌(A)和大肠杆菌(B)的抑制作用示意图，a-f的厚朴酚添加量分别为0g/L、0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L；

图6为FY-07菌株在实施例1、对比例1-3四种不同培养基HSK(A)、HSK-Mag(B)、HS-XGK(C)和HS-XGK-Mag(D)中的发酵产物状态示意对比图；

图7为实施例1、对比例1-3产生的改性细菌纤维素产物的X射线衍射图(A)、红外光谱(B)、热降解曲线(C)、持水率和溶胀率(D)；

图8为实施例1、对比例1-3所产生的改性细菌纤维素产物的微观结构示意图，放大倍数为20000×；

图9为实施例1、对比例1-3产生的改性细菌纤维素产物对金黄色葡萄球菌(A)、大肠杆菌(B)和白色念珠菌(C)的抑菌圈结果示意图，以及在实施例1、对比例1-3产生的改性细菌纤维素产物存在条件下金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长曲线图(D)；

图10为实施例1、对比例1-3对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的抑菌率测试结果示意图；

图11为在实施例1、对比例1-3的改性细菌纤维素产物上培养的3T3小鼠胚胎成纤维细胞的细胞活力示意图，直接在聚苯乙烯表面培养的组织(TCPS)被用作对照。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

确定细菌纤维素产生菌株

细菌纤维素(BC)是指在不同条件下，由醋酸菌属、土壤杆菌属、根瘤菌属和八叠球菌属等中的某种微生物合成的纤维素的统称，是一种生物大分子聚合物，目前常用的细菌纤维素产生菌株多为好氧菌，而好氧菌只能在培养基与空气的接触面产生细菌纤维素，不论在实验研究或工业生产中都大为受限。

申请人经大量研究发现一株特殊的细菌纤维素产生菌株FY-07，该菌株环境竞争力强、耐受力强，在有氧环境、限氧和厌氧条件下均可快速的产生大量的细菌纤维素，具有独特的深层发酵模式，生长生产速度快，具有广阔的应用前景。且该菌株基于深层发酵模式得到的细菌纤维素产品的均匀性更好。该菌株的名称为KosakoniaoryzendophyticaFY-07，分离自油田采出液，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCCNo.6103，保藏时间为2012年5月11日。

菌株FY-07的扩大培养需要用到LB培养基，菌株FY-07的普通发酵培养可以选择HSK培养基或HS-XGK发酵培养基。

LB培养基：5g/L的酵母粉、10g/L的蛋白胨、10g/L的NaCl，调节pH值在7.4-7.6范围内。

HSK培养基：7.5g/L的酵母粉、10g/L的蛋白胨、10g/L的Na

HS-XGK发酵培养基：7.5g/L的酵母粉、10g/L的蛋白胨、10g/L的Na

选择改性剂

为了更好的利用该菌株FY-07，申请人欲采用原位改性的方法使其在深层发酵方式的基础上产生性能更优异的细菌纤维素，获得更好的改性细菌纤维素产品。因此，挑选出一种适用于改性该菌株的物质作为改性剂至关重要。

申请人研究了大量物质，从中筛选出厚朴酚(Magnolol)。厚朴酚是一种从植物中分离提取出来的酚类物质，不溶于水，具有良好的生物安全性、较强的抗菌能力、抗炎特性、抗氧化性能以及保肝功能，有可能成为细菌纤维素原位改性的优良改性剂。然而，厚朴酚不溶于水的特性以及对细菌纤维素产生菌株的潜在抑制作用可能会阻碍厚朴酚作为改性剂的实现，因此对厚朴酚对细菌纤维素产生菌株FY-07的抑制作用进行研究。

1.厚朴酚对细菌纤维素产生菌株FY-07的抑制作用

S100、分别从-80℃保存的FY-07菌种甘油管和木醋杆菌甘油管中各取50μL并接种至5mL含有1％纤维素酶的LB培养基中，于30℃环境下以200rpm的转速振荡培养12h，分别获得FY-07悬浮液和木醋杆菌悬浮液；

S200、分别取步骤S100获得的1mL的FY-07悬浮液和木醋杆菌悬浮液，各自加入100mL的融化且冷却至适宜接种温度的含1.5％琼脂的LB固体培养基中，混匀，倒入培养皿，静置待培养基凝固后，在培养基中打孔获得直径为8mm的圆孔，向圆孔中加入70μL含0.15％(w/v)厚朴酚的二甲基亚砜溶液，30℃环境下培养12h，观察厚朴酚的抑菌效果并测量抑菌圈直径，每种菌设置三个平行，阴性对照组向圆孔中加入等体积的二甲基亚砜溶液；

S300、分别取步骤S100获得的1mL的FY-07悬浮液和木醋杆菌悬浮液，接种到100mL含有1％纤维素酶和0.05％厚朴酚的LB液体培养基中，其中厚朴酚置于透析袋中并密封，以准确检测吸光度，30℃环境下振荡孵育8小时，期间，每小时测量一次OD

如图1所示：图1-A表示厚朴酚对木醋杆菌的抑菌圈检测结果，a-c为阴性对照二甲基亚砜，d-f为二甲基亚砜/厚朴酚，说明二甲基亚砜/厚朴酚(DMSO/Mag)对常用的细菌纤维素产生菌株木醋杆菌有强烈的抑制作用；图1-B表示厚朴酚对FY-07菌株的抑菌圈检测结果，a-c为阴性对照二甲基亚砜，d-f为二甲基亚砜/厚朴酚，说明DMSO/Mag对FY-07菌株仅有轻微的抑制作用。

如图2所示：木醋杆菌在含有厚朴酚溶液的培养基中几乎无法生长(图2-A)，FY-07菌株在同样的生长条件下生长状态良好(图2-B)。

综上，证明FY-07菌株具有比木醋杆菌更强的厚朴酚耐受性，因此可选择厚朴酚作为FY-07菌株生产改性细菌纤维素的改性剂。

选择悬浮剂

但由于厚朴酚不溶于水，直接添加进液体培养基后，会沉淀在培养瓶底部，导致厚朴酚无法在细菌纤维素产生过程中掺入其结构中，也会导致生成的改性细菌纤维素均匀性差。基于厚朴酚不溶于水的特性，为了更好地利用该物质进行原位改性，申请人对悬浮剂进行了进一步的研究，由于多糖类物质具有提高物系黏度的特性，可作为悬浮剂使物系保持均匀稳定的悬浮状态或乳浊状态，因此筛选黄原胶作为悬浮剂以提高厚朴酚在液体培养基中的悬浮分散状态。本发明所使用的黄原胶由梅花集团提供。

2.黄原胶对厚朴酚的悬浮作用

准备足量干净的50mL的离心管，称重，备用；配制4种液态的发酵培养基，分别为HSK培养基、HS-XGK发酵培养基、HSK-Mag培养基、HS-XGK-Mag培养基，其中HSK-Mag培养基、HS-XGK-Mag培养基的厚朴酚(Mag)添加量设置0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L这三个浓度梯度，每种培养基均设置三个平行，分装于500mL锥形瓶中并标号，每瓶中培养基含量为200mL，灭菌备用。

将上述几种培养基静置放置，每小时从液面处吸取20mL上清液移至离心管中，取样过程中保持培养液静止，以6000rpm的速度离心所吸取的上清液，离心时间为20min，收集沉淀物，于-20℃下预冷，冷冻干燥，待完全干燥后称重，以得到20mL培养基中悬浮物的质量。

各离心管中沉淀质量的计算公式为：W

其中，W

HSK-Mag培养基和HS-XGK-Mag培养基中厚朴酚的悬浮率S的计算公式为：

S

S

其中，W

如图3所示，厚朴酚在不添加黄原胶的HSK-Mag培养基中分散状态较差，几乎无法悬浮，大多都沉淀在培养基的底部，而厚朴酚在添加黄原胶的HS-XGK-Mag培养基中可以很好的悬浮。

图4为厚朴酚在有无黄原胶的培养基中的悬浮情况和稳定性，图4-A、图4-B、图4-C图中厚朴酚的添加量分别为0.5g/L、1g/L、1.5g/L，如图4所示：不同厚朴酚添加量下，在1～4小时内，添加黄原胶时的厚朴酚悬浮率都显著高于不添加黄原胶，说明黄原胶对厚朴酚有明显的悬浮作用，并且悬浮作用可以稳定持续4小时以上。

确定用于培养改性细菌纤维素产生菌株的培养基

在一些实施例中，用于培养改性细菌纤维素产生菌株的HS-XGK-Mag培养基，以质量浓度计，HS-XGK-Mag培养基包括1.5g/L的厚朴酚、1.0g/L的黄原胶、7.5g/L的酵母粉、10g/L的蛋白胨、10g/L的Na

在一些实施例中，HS-XGK-Mag培养基的配制方法，用于配制上述HS-XGK-Mag培养基，包括：

(1)将葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、Na

(2)向基础混合液中缓慢加入黄原胶，并于25℃-50℃温度下充分搅拌至其完全溶解，以得到基础悬浮体系；

(3)向基础悬浮体系中缓慢加入厚朴酚，混匀，以得到HS-XGK-Mag培养基。

确定改性细菌纤维素的制备方法

申请人以FY-07菌株作为细菌纤维素产生菌株，以液态的、添加有一定浓度厚朴酚作为改性剂的HS-XGK发酵培养基为发酵培养基，利用原位改性方法进行深层发酵生产改性细菌纤维素。发酵培养基中不溶性的改性剂厚朴酚通过悬浮剂黄原胶保证其在发酵液中的悬浮分散状态，生产出的改性细菌纤维素具有较好的抗菌性和生物相容性。

改性细菌纤维素的制备方法包括：

S1.扩大培养细菌纤维素产生菌株FY-07，以获得同时含有菌株FY-07和其产物细菌纤维素的种子液；

S2.将种子液以0.1％～10％的接种量接种至液态的HS-XGK-Mag培养基中，25℃～37℃内培养18h～48h，以获得改性细菌纤维素膜；

S3.将改性细菌纤维素膜从HS-XGK-Mag培养基中捞出，清理掉附着在改性细菌纤维素膜表面的细菌、残留培养基以及杂质，以得到改性细菌纤维素湿膜。

在一些实施例中，获得种子液的步骤S1中，包括：

S11.将细菌纤维素产生菌株FY-07的菌液划线培养于含有0.1％(w/v)刚果红的LB固体培养基中，于25℃～37℃温度下培养24h，以获得生长状况良好的FY-07单菌落；

S12.挑取红色且较大的FY-07单菌落密集划线于LB固体斜面培养基中，于25℃～37℃温度下培养24h，以获得含有FY-07活菌株的细菌纤维素膜；

S13.挑取含有FY-07活菌株的细菌纤维素膜，再次密集划线于LB固体斜面培养基中，于25℃～37℃温度下培养24h，以获得含有大量FY-07活菌株和细菌纤维素膜的培养基表面；

S14.用100mL的无菌蒸馏水冲洗培养基表面，直至培养基表面上的FY-07活菌株和细菌纤维素(薄)膜脱离到无菌蒸馏水中，将含有FY-07活菌株和细菌纤维素膜的蒸馏水混匀，以获得种子液。

在一些实施例中，获得改性细菌纤维素湿膜的步骤S3中，包括：

S31.将改性细菌纤维素膜从HS-XGK-Mag培养基中捞出，用无菌水进行冲洗；

S32.用0.5M的NaOH溶液于100℃条件下浸泡处理冲洗后的改性细菌纤维素膜0.5h，以除去改性细菌纤维素膜中的菌体和残留培养基；

S33.重复水洗步骤和浸泡步骤，直至改性细菌纤维素膜的pH值为中性，以得到改性细菌纤维素湿膜。

在一些实施例中，获得改性细菌纤维素湿膜的步骤S3后，还可包括步骤S4：

S4.对改性细菌纤维素湿膜进行干燥操作，以得到改性细菌纤维素干膜。

在一些实施例中，获得改性细菌纤维素干膜的步骤S4中，干燥方式包括但不限于烘干、真空冷冻干燥。

确定培养基中厚朴酚的最佳添加量

3.厚朴酚添加量对FY-07细菌纤维素产物的影响

配制液态的含有不同浓度厚朴酚的HS-XGK-Mag发酵培养基，其中厚朴酚的添加量分别设置为0g/L、0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L，每瓶发酵培养基中含90mL的HS-XGK-Mag培养基和10mL无菌的25％葡萄糖碳源，备用。

按照步骤S11至S14进行操作，获得种子液备用：取步骤S100中获得的FY-07悬浮液划线于含有0.1％刚果红的LB固体培养基平板，30℃扩大培养24小时，以获取生长状况良好的FY-07单菌落。再从中挑取红色且较大的单菌落密集划线于LB斜面培养基，30℃继续扩大培养24小时。再从LB斜面培养基中挑取含有大量菌体的细菌纤维素(薄)膜密集划线于LB斜面培养基，30℃继续扩大培养24小时。用100mL无菌蒸馏水反复冲洗斜面培养基的表面，直至斜面培养基上包含大量FY-07活菌株的细菌纤维素膜从培养基表面脱离，将无菌蒸馏水中的FY-07及细菌纤维素膜混匀作为种子液，备用。

将该种子液以1％的接种量接种于上述HS-XGK-Mag发酵培养基中，于30℃培养箱中培养发酵24小时，以获得足够多的改性细菌纤维素膜。

将产生的改性细菌纤维素膜捞出，无菌水冲洗以去除夹杂的大部分菌体和杂质，再用0.5M的NaOH溶液于100℃条件下浸泡处理0.5小时，以除去改性细菌纤维素膜中的菌体和残留培养基，多次水洗并浸泡，直至pH为中性，从而得到改性细菌纤维素湿膜。

对改性细菌纤维素湿膜进行烘干或真空冷冻干燥处理获得改性细菌纤维素干膜。

用金黄色葡萄球菌ATCC29213代表革兰氏阳性细菌，用大肠杆菌K-12MG1655代表革兰氏阴性细菌，确定利用HS-XGK发酵培养基和HS-XGK-Mag培养基分别培养得到的细菌纤维素(BC)的抗菌性，并确定厚朴酚的最优添加量：分别从-80℃保存的金黄色葡萄球菌甘油管和大肠杆菌甘油管中吸取50μL菌液各自接种于5mL的LB培养基中，37℃环境下以200rpm的转速振荡培养12h，得到菌悬液；分别吸取1mL菌悬液加入100mL融化且冷却至适宜接种温度的含1.5％琼脂的LB固体培养基中，混匀后倒入培养皿，静置等待凝固；待含有革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌的培养基凝固后，取上述在不同条件下培养得到的改性细菌纤维素干膜，将其置于培养基表面，37℃环境下培养12h，观察改性细菌纤维素干膜的抑菌效果，并测量抑菌圈直径，其中，改性细菌纤维素干膜统一裁剪为直径为8mm的圆片。

如图5所示，厚朴酚的添加赋予了细菌纤维素一定的抗菌活性，随着厚朴酚添加量的增加，所得细菌纤维素膜对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用增强，当添加量大于1.5g/L后抑菌效果几乎不再增加，因此厚朴酚的最优添加量为1.5g/L。

在一些实施例中，以质量浓度计，HS-XGK-Mag培养基包括1.5g/L的厚朴酚、1.0g/L的黄原胶、7.5g/L的酵母粉、10g/L的蛋白胨、10g/L的Na

实施例1

一种改性细菌纤维素的制备方法：

S11.将细菌纤维素产生菌株FY-07的菌液划线培养于含有0.1％刚果红的LB固体培养基中，于30℃下培养24h，以获得生长状况良好的FY-07单菌落；

S12.挑取红色且较大的FY-07单菌落密集划线于LB固体斜面培养基中，于30℃下培养24h，以获得含有FY-07活菌株的细菌纤维素膜；

S13.挑取含有FY-07活菌株的细菌纤维素膜，再次密集划线于LB固体斜面培养基中，于30℃下培养24h，以获得含有大量FY-07活菌株和细菌纤维素膜的培养基表面；

S14.用100mL的无菌蒸馏水冲洗培养基表面，直至培养基表面上的FY-07活菌株和细菌纤维素膜脱离到无菌蒸馏水中，将含有FY-07活菌株和细菌纤维素膜的蒸馏水混匀，以获得种子液；

S2.将种子液以1％的接种量接种至90mL液态的HS-XGK-Mag培养基中，同时向培养基中加入10mL无菌的25％葡萄糖碳源，30℃发酵24h，以获得改性细菌纤维素膜；

S31.将改性细菌纤维素膜从HS-XGK-Mag培养基中捞出，用无菌水进行冲洗，以除去大部分菌体及杂质；

S32.用0.5M的NaOH溶液于100℃条件下处理冲洗后的改性细菌纤维素膜0.5h，以除去改性细菌纤维素膜中的菌体和残留培养基；

S33.重复进行水洗操作和浸泡操作，直至改性细菌纤维素膜的pH值为中性，以得到改性细菌纤维素湿膜；

S4.对改性细菌纤维素湿膜进行干燥操作，以得到改性细菌纤维素干膜(BC/XG/Mag)。

其中，HS-XGK-Mag培养基：1.5g/L的厚朴酚、1.0g/L的黄原胶、7.5g/L的酵母粉、10g/L的蛋白胨、10g/L的Na

对比例1

一种改性细菌纤维素的制备方法，制备方法同实施例1，不同之处在于步骤S2中用HSK培养基进行发酵培养，获得细菌纤维素干膜(BC)。

对比例2

一种改性细菌纤维素的制备方法，制备方法同实施例1，不同之处在于步骤S2中用HSK-Mag培养基进行发酵培养，获得改性细菌纤维素干膜(BC/Mag)。

对比例3

一种改性细菌纤维素的制备方法，制备方法同实施例1，不同之处在于步骤S2中用HS-XGK发酵培养基进行发酵培养，获得细菌纤维素干膜(BC/XG)。

试验例1基本性能检测

观察实施例1和对比例1-3的发酵状态，利用傅立叶变换红外光谱(FTIR)、X射线衍射(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)和热重分析(TGA)对实施例1和对比例1-3中的改性细菌纤维素干膜BC/XG/Mag、BC、BC/XG、BC/Mag进行表征检测，并检测持水率和溶胀率。

图6为实施例1、对比例1-3的FY-07菌株的发酵状态示意图，图6-A为对比例1的菌株发酵状态示意图，图6-B为对比例2的菌株发酵状态示意图，图6-C对比例3的菌株发酵状态示意图，图6-D实施例1的菌株发酵状态示意图。如图6所示，从四种产物的发酵状态可以看出，实施例1的改性细菌纤维素产物BC/XG/Mag光滑致密，通体呈白色说明厚朴酚均匀地分散在了产物中。

如图7所示，实施例1的产物BC/XG/Mag的结晶度为60.6％，显著低于对比例1的产物BC，说明黄原胶和厚朴酚的存在阻碍了细菌纤维素网络结构的自组装过程；BC/XG/Mag的红外光谱表明其中同时存在黄原胶和BC的特征峰，说明黄原胶均匀填充到了细菌纤维素网络结构中；BC/XG/Mag的热降解曲线更接近线性，表明其更加均匀；BC/XG/Mag的持水率相较于BC有所下降，但仍高于17000％，而其溶胀率则显著提高，达到了4160.6％，说明黄原胶填充了BC的部分网络结构，导致表面积和孔隙体积的减少，从而导致持水能力的下降。而BC/XG/Mag更低的结晶度和大量亲水黄原胶的存在是其溶胀率显著提高的原因。

如图8所示，扫描电镜观察可以看到BC/XG/Mag与BC同样是典型的三维网状结构，但其大部分网络被黄原胶填充，其中还可观察到大量白色颗粒状厚朴酚的存在，表明厚朴酚成功掺入到了细菌纤维素膜中，但并没有影响细菌纤维素的基本结构。

试验例2抑菌性能检测

1.对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌的抑菌性能检测

用金黄色葡萄球菌ATCC29213代表革兰氏阳性细菌，用大肠杆菌K-12MG1655代表革兰氏阴性细菌，测试实施例1、对比例1-3得到的改性细菌纤维素干膜的抗菌性。

分别从-80℃保存的金黄色葡萄球菌甘油管和大肠杆菌甘油管中吸取50μL菌液各自接种于5mL的LB培养基中，37℃环境下以200rpm的转速振荡培养12h，得到菌悬液。

分别吸取1mL菌悬液加入100mL融化且冷却至适宜接种温度的含1.5％琼脂的LB固体培养基中，混匀后倒入培养皿，静置等待凝固；待含有革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌的培养基凝固后，取上述实施例和对比例中培养得到的改性细菌纤维素干膜，将其置于培养基表面，37℃环境下培养12h，观察改性细菌纤维素干膜的抑菌效果，并测量抑菌圈直径，其中，改性细菌纤维素干膜统一裁剪为直径为8mm的圆片。

向100mL的LB液体培养基中加入50mg或150mg实施例和对比例中培养得到的改性细菌纤维素干膜，分别用于检测改性细菌纤维素干膜对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长的影响。各吸取1mL菌悬液接种到上述培养基中，37℃下振荡培养8h，每小时测定一次OD

如图9和图10所示，改性细菌纤维素BC/XG/Mag对革兰氏阳性菌具有强烈抑制作用，对革兰氏阴性菌有弱抑制作用，改性细菌纤维素BC/XG/Mag对革兰氏阳性菌的抑菌率为100％、对革兰氏阴性菌的抑菌率为72％，表明使用悬浮剂实现不溶性改性剂对细菌纤维素的原位改性这一策略是成功的。

2.对真菌的抑菌性能检测

用白色念珠菌SC5314菌株代表真菌，测试实施例1、对比例1-3得到的改性细菌纤维素干膜的抗菌性。

将冻存的白色念珠菌SC5314菌株活化至YPD固体培养基中，30℃培养2d后挑取单菌落至YPD液体培养基中，30℃下以180rpm的转速振荡培养12h以获得白色念珠菌SC5314菌液。

向100mL的加热融化并冷却至适宜接种温度的YPD固体培养基中加入1mL的白色念珠菌SC5314菌液，混匀后倒入培养皿中，静置凝固后，将直径为8mm的实施例1、对比例1-3得到的细菌纤维素干膜置于固体培养基表面，30℃培养24h，测量抑菌圈直径，以厚朴酚/二甲基亚砜溶液为阳性对照。

其中，YPD固体培养基：1％酵母粉、2％蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂。YPD液体培养基：1％酵母粉、2％蛋白胨、2％葡萄糖。

分别向100mL的YPD液体培养基中加入50mg实施例1和对比例1-3中培养得到的改性细菌纤维素干膜，再分别吸取1mL的菌悬液接种到上述培养基中，30℃下振荡培养7h，对样品进行稀释涂布平板，静置于30℃下培养24h后计数活菌数目并计算抑菌率。

如图9和图10所示，实施例1的产物BC/XG/Mag对白色念珠菌SC5314具有强烈的抑制作用，抑菌率可达100％，说明改性细菌纤维素BC/XG/Mag对真菌也具有强烈抑制作用。

试验例3细胞毒性检测

用3T3小鼠胚胎成纤维细胞(ATCCCCL-164)评估实施例1和对比例1-3中的改性细菌纤维素干膜BC/XG/Mag、BC、BC/XG、BC/Mag的潜在细胞毒性。

将3T3小鼠胚胎成纤维细胞以每孔1.3×10

如图11所示，所有组别的细胞活性均大于94％，表明四种细菌纤维素膜均有较好的生物相容性。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。