一种桉树精油突变酶制剂及其在家畜养殖中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种桉树精油突变酶制剂及其在家畜养殖中的应用。

背景技术

甘露聚糖是自然界中含量仅次于木聚糖的半纤维素，以β-1,4糖苷键链接形成主链，由半乳糖、葡萄糖等参与形成侧链，其广泛存在于自然界中，是多种植物、微生物细胞壁的主要组成成分。但在植物性饲料原料中也和木聚糖一起被视为抗营养因子，难以被动物消化。甘露聚糖的彻底降解需要甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶和脱乙酰酯化酶的协同作用，其中内切β-1,4甘露聚糖酶在这一类酶中发挥主要作用。

畜禽不具有分泌甘露聚糖酶的消化酶系，在饲料中添加甘露聚糖酶是解决这一问题的主要途径。甘露聚糖酶降解含有β-1,4糖苷键的甘露聚糖，具有降解一般非淀粉多糖(NSP)的作用，可以降解豆类籽实中的多糖成分，生成低聚糖如甘露寡糖。甘露寡糖可以促进动物肠道中双歧杆菌、乳杆菌增殖、肠道表皮细胞分化，调节相关代谢通路，提高机体免疫力和抗氧化能力。

随着市场需求量的增加，提高甘露聚糖酶的表达量，改善其酶学性质和在饲料中的使用效果是急需解决的问题。借助于基因工程和酶的体外定向进化手段，从酶的基因和结构入手，改良酶学特性，筛选得到优良性质的酶制剂，同时利用合适的表达系统，进行高效的表达生产，对降低目前的饲用生产成本，提高其利用效率，以及对产品的开发和应用具有重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种桉树精油突变酶制剂及其在家畜养殖中的应用。本发明通过突变改良得到了甘露聚糖酶突变体，将其与多苞桉桉树精油制得的突变酶制剂，能够提高仔猪的生长性能。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种甘露聚糖酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示、或者如SEQ ID NO：5所示、或者如SEQ ID NO：7所示。

进一步的，所述甘露聚糖酶突变体具体为由氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的甘露聚糖酶的第313位的丝氨酸变为脯氨酸得到的甘露聚糖酶突变体MANH1；由氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的甘露聚糖酶的第313位的丝氨酸变为脯氨酸、第58位的甘氨酸变为谷氨酸得到的甘露聚糖酶突变体MANH2；由氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的甘露聚糖酶MAN第313位的丝氨酸变为脯氨酸、第58位的甘氨酸变为谷氨酸以及第155位的苏氨酸变为谷氨酸得到的甘露聚糖酶突变体MANH3。

本发明提供了一种所述的甘露聚糖酶突变体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示、或者如SEQ ID NO：6所示、或者如SEQ ID NO：8所示。

本发明提供了一种包含所述的编码基因的表达载体。

本发明提供了一种包含所述的编码基因的基因工程菌。

本发明提供了一种桉树精油突变酶制剂，其中包含甘露聚糖酶突变体和多苞桉桉树精油。

进一步的，所述桉树精油突变酶制剂是由含甘露聚糖酶突变体的基因工程菌经发酵制得的发酵液与多苞桉桉树精油以5:2的体积比混合而成的。

本发明提供了所述的甘露聚糖酶突变体或者所述的桉树精油突变酶制剂在家畜养殖中的应用。

进一步的，所述甘露聚糖酶突变体或者桉树精油突变酶制剂的用量为家畜动物基础日粮重量的0.01％～0.05％.

进一步的，所述家畜动物为仔猪、母猪、奶牛和羊。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：

本发明将来源于黑曲霉的甘露聚糖酶MAN(GenBank:ADK88903.1)作为基础进行突变改良，通过筛选获得了突变位点分别为单点突变S313P的甘露聚糖酶突变体MANH1，双点突变S313P/G58E的甘露聚糖酶突变体MANH2，以及三点突变S313P/G58E/T155E的甘露聚糖酶突变体MANH3。和原始基因相比，甘露聚糖酶突变体酶活力分别提高了45％、53％、85％。本发明还利用含甘露聚糖酶的工程菌发酵得到的发酵液与胆汁酸进行混合，制得突变酶制剂，并将其用于仔猪养殖中，能够明显提高仔猪的采食量和日增重，降低料重比，提高仔猪养殖中的饲料转化率以及生产性能，进而促进了本发明的甘露聚糖酶突变体在饲料领域的开发和应用。

附图说明

图1是甘露聚糖酶基因的扩增结果。

图2是甘露聚糖酶突变体的酶活力比较。

图3是甘露聚糖酶突变体MANH3的蛋白胶电泳结果。

图4是甘露聚糖酶突变体MANH3在50L发酵罐中的发酵数据。

具体实施方式

为了便于理解本发明，以下将结合附图及实施例对本文发明做更全面、详细地说明，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可以参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。

本发明所用培养基配方如下：

LB培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl；

MD培养基：1.34％YNB，0.4mg/L生物素，2％葡萄糖；

YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；

BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，0.4mg/L生物素，1％甘油；

BSM培养基：26.7mL 85％的磷酸，0.93g二水硫酸钙，14.9g二水硫酸镁，4.13g氢氧化钾，18.2g硫酸钾，40g甘油，4.0mL PMT1。

以上培养基为固体时加入2％的琼脂粉。

本发明中酶活力测定：《GB/T 36861-2018饲料添加剂β-甘露聚糖酶活力的测定分光光度法》中的测定方法。

实施例1：甘露聚糖酶突变体基因构建和筛选

参考黑曲霉的甘露聚糖酶MAN(GenBank:ADK88903.1)的氨基酸序列，翻译成对应的核苷酸序列，并经过基因序列优化后，由人工合成，合成的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。设计如下引物，在5’端设计EcoR I限制性酶切位点，3’端设计Not I限制性酶切位点。

MAN-F：CCGGAATTCCTGCCGAAAGCCTCCCCTGC(SEQ ID NO：9)；

MAN-R：ATAAGCGGCCGCTTAGGCGCTACCAATAGCAG(SEQ ID NO：10)。

用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒，以人工合成的基因为模版，进行随机突变，使用上述设计的引物对，PCR扩增结果如图1所示。

将扩增好的随机突变PCR产物用EcoR I和Not I双酶切，纯化回收后连接到pET-21a(+)载体上，转化大肠杆菌BL21-DE3，氨苄青霉素抗性LB平板筛选阳性克隆，得到pET-MANHx。同样方法将合成的原始基因连接到pET-21a(+)载体上并转化大肠杆菌BL21-DE3，得到pET-MAN0。

将筛选的单菌落接种到96孔深孔板。每个平板接入2个表达MAN0的单菌落为对照。每孔装入300uL LB液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)，37℃、200rpm震荡培养4小时后，转移50uL菌液到新的96孔平板保种，在平板剩余菌液中添加200uL含有IPTG的LB-Amp培养基，使IPTG终浓度为1mM，氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，37℃、200rpm摇床培养10h诱导表达甘露聚糖酶。

将诱导完成的菌液反复冻融进行破碎，将破碎后的细胞液离心取上清，然后检测甘露聚糖酶的酶活性。将酶活力高于对照的突变体基因进行测序。经过测序后获得甘露聚糖酶突变体MANH1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其对应核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；MANH1的突变位点为单点突变S313P。

实施例2：以甘露聚糖酶突变体MANH1基因为模板进行随机突变

以实施例1获得的突变体MANH1为模板，使用与实施例1相同的随机突变方法，进行第二轮突变和筛选，并以MANH1为对照，经过检测甘露聚糖酶的酶活力，获得酶活力明显提高的两株突变体MANH2和MANH3。经过测序，MANH2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；MANH3的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，核苷酸序列如SEQ IDNO：8所示。

MANH2的突变位点为双点突变S313P/G58E；MANH3的突变位点为三点突变S313P/G58E/T155E。

实施例3：甘露聚糖酶突变体转化毕赤酵母GS115

将甘露聚糖酶突变体基因用EcoR I和Not I双酶切位点连接到pPIC9K质粒上并转化至大肠杆菌DH5α中，获得表达载体，测序验证。将表达载体用Sal I酶切线性化后电转入毕赤酵母GS115中，MD平板筛选得到转化子并转接到YPD平板中活化(一般挑24-48个转化子)。活化后的转化子接于摇瓶进行发酵(每瓶含20mL BMGY培养基)，30℃振荡培养18h后，加1％甲醇诱导，继续振荡培养，此后每24h添加培养体积1％的甲醇。诱导表达96h后，将培养液离心获得上清，测定发酵液上清的平均酶活性。

按照国标中甘露聚糖酶测定的方法，取发酵液离心后的上清液测定酶活力，结果如图2所示，与原始甘露聚糖酶相比，甘露聚糖酶突变体MANH1、MANH2、MANH3的酶活力分别提高了45％、53％、85％。

实施例4：甘露聚糖酶突变体MANH3在50L发酵罐中发酵和制备

将甘露聚糖酶突变体MANH3的基因工程菌分别划线于YPD平板上，30℃培养3天长出单菌落，挑取长势良好的单菌落继续在YPD平板上划线培养，如此活化三代，得到的毕赤酵母单菌落接种于20mL BMGY培养基中，30℃、200rpm培养24h。以2％的接种量接种到300mLBMGY培养基中，30℃、200rpm培养至OD600为5，用作种子液接种发酵罐。发酵生产工艺：BSM培养基，pH4.8、温度30℃、搅拌速率500rpm、通风量1.5(v/v)，溶氧控制在20％以上发酵过程分为三个阶段：(1)菌体培养阶段：按8％比例接入种子液，30℃培养20～24h，使发酵液中甘油耗尽；(2)饥饿阶段：当碳源甘油耗尽后，暂不补加任何碳源，待溶氧上升至80％饥饿阶段结束；(3)诱导表达阶段：用氨水或磷酸调节pH至所需值，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20％以上，诱导时间为160～200h；待发酵结束后，得到发酵液用于应用测试。

发酵液进行蛋白胶分析结果如图3所示，可以看到明显且较宽的蛋白条带，说明甘露聚糖酶突变体MANH3的表达量较高；发酵过程曲线如图4所示：每隔8h取样，测定产酶水平，发酵168h后酶活力水平达到最高点。

实施例5：突变酶制剂在仔猪养殖中的应用实验

按照实施例4的步骤制备分别含有甘露聚糖酶突变体MANH1、MANH2和MANH3的发酵液，其中突变体的酶活力不低于4万U/mL。

将含甘露聚糖酶突变体的发酵液与多苞桉桉树精油以5:2的体积比混合均匀，得到突变酶制剂(两者单位均为mL)。其中，多苞桉桉树精油中的有效成分包括1,8-桉树脑(83.8％)、β-甲基异丙基苯(3.43％)、柠檬烯(2.5％)、α-蒎烯(1.8％)、别香橙烯(1.08％)、松油烯-4-醇(0.88％)、α-松油醇(0.58％)、蓝桉烯(0.54％)、P-甲基异丙基苯(0.51％)等。

选用健康体重在8.5kg左右的断奶仔猪150头，随机分为5组，每组3栏，每栏10头猪，即每组3个重复。试验采用6天预饲，在预饲期间，对仔猪只进行微调整，使试验开始前，各组之间健康度保持一致。对照组饲喂普通基础日粮，精油组以0.01％的添加量将多苞桉桉树精油拌料饲喂，试验组将突变酶制剂拌料饲喂，以0.01％的添加量进行拌料。

通过检测饲喂过程中仔猪的体重、平均采食量、平均日增重和腹泻频率等指标，来评价甘露聚糖酶在仔猪养殖中的应用效果。

试验结果如下表1所示，添加精油或酶制剂后，仔猪的采食量和日增重都有所提高，但添加了甘露聚糖酶突变体的酶制剂增加的更多；料重比和对照组相比，均有所降低，并且实验组明显降低了腹泻情况。以上结果说明，添加本发明中的甘露聚糖酶突变体MANH1、MANH2和MANH3能够提高仔猪养殖中的饲料转化率，提高生产性能。

表1突变酶制剂在仔猪养殖中的应用

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。