大肠杆菌表达载体及其构建方法、应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种菌类的表达载体及其构建方法。

背景技术

大肠杆菌的遗传背景清楚，经常会被用作进行大规模发酵培养，它的主要表现在表达周期短、操作相对简单且可利用的表达载体数量较多，但在基因表达的过程中，也存在表达效率不高而导致产率低等问题。影响基因表达效率的因素主要与目的基因的量、mRNA的稳定性、发酵培养条件的控制、载体的选择及启动子强度和翻译起始效率等因素有着很大的关系。

发明内容

本发明解决了现有大肠杆菌载体在基因表达过程中表达效率低，从而导致其应用于色氨酸生产中色氨酸产率低的问题。

为此，本发明提出如下技术方案：

方案一、一种大肠杆菌表达载体，所述大肠杆菌载体应用于生产色氨酸，大肠杆菌表达载体含有一个在大肠杆菌中具有功能的人工合成启动子序列，含有一段供外源基因插入表达的多克隆位点序列，含有一个人工转录终止序列，含有一个可以在大肠杆菌中进行基因克隆表达的抗性筛选标记。

优选地，所述人工合成启动子核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

优选地，所述供外源基因插入表达的多克隆位点序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

优选地，所述人工转录终止子核苷酸序列为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

方案二、一种大肠杆菌表达载体的构建方法，优选为：

(1)、以pTH18kr作为载体骨架，将人工合成的启动子与终止子连接至pTH18kr上，获得的载体序列记为XYWa0；

(2)、以野生型大肠杆菌MG1655为模板，利用Gibson Assembly方法，利用引物P1、P2扩增trpE、trpD、trpC、trpB、trpA基因序列，获得的目的片段记为P12；

(3)、以步骤(1)所述的XYWa0做为模板，使用EcoRⅠ和KpnⅠ进行酶切，酶切后回收长度为3088bp的片段，以回收产物为模板利用引物P3、P4进行PCR扩增，获得的目的片段记为P34；

(4)、将步骤(2)和(3)中所述的片段P12、P34使用Seamless Cloning Kit进行连接，连接产物转化至野生型大肠杆菌MG1655感受态细胞中，使用卡那霉素抗性LB平板进行培养，筛选出单菌落，进行菌落PCR鉴定，使用引物为P5、P6，将扩增获得的长度为6954bpPCR产物进行测序，将测序鉴定正确的重组菌保藏，记为XYWa0717。

优选地，所述步骤(2)使用的引物序列如下：

P1：ggtggtgtaggatcctctagaattcatgcaaacacaaaaaccgactctcg；

P2：ctgtgttctgtattacccgggtaccttaactgcgcgtcgccgc。

优选地，所述步骤(3)使用的引物序列如下：

P3：gatgaaagcggcgacgcgcagttaaggtacccgggtaatacag；

P4：cgagagtcggtttttgtgtttgcatgaattctagaggatcctacac。

优选地，所述步骤(4)使用的引物序列如下：

P5：agcgaaagagagactggcc；

P6：caactgttgggaagggcga。

方案三、上述大肠杆菌表达载体在发酵生产色氨酸中的应用。

本发明的有益效果：

通过本发明提供的大肠杆菌载体及构建方法，实现大肠杆菌中基因的高效表达，从而实现色氨酸的高产。

附图说明

图1是本发明实施例中XYWa0载体；

图2是本发明实施例中XYWa0717载体。

具体实施方式

实施例1

通过人工合成一段启动子(如SEQ ID No.1所示)和终止子(如SEQ ID No.3所示)；

使用pTH18kr作为载体骨架，将人工合成的启动子与终止子序列连接至pTH18kr上，记为XYWa0(如SEQ ID No.4所示)，见图1，此步骤为送基因合成公司进行人工合成。

实施例2

生产色氨酸的大肠杆菌载体构建方法：将基因插入到EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位点中，利用Gibson Assembly方法，以野生型大肠杆菌MG1655为模板，扩增trpE、trpD、trpC、trpB、trpA基因序列。使用P1：ggtggtgtaggatcctctagaattcatgcaaacacaaaaaccgactctcg(如SEQID No.5所示)P2：ctgtgttctgtattacccgggtaccttaactgcgcgtcgccgc(如SEQ IDNo.6所示)作为上下游引物，扩增长度为6581bp(此长度为包含引物序列的长度),PCR反应在50uL总体积中进行，反应条件为95℃变性2min，然后95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸1min，共35个循环后，再于72℃延伸5min。PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳，然后回收目的片段，目的片段记为P12，片段长度为6531bp，序列信息见SEQ ID No.7。

同时以实施例1中合成好的XYWa0为模板，使用EcoRⅠ和KpnⅠ进行酶切，酶切回收大片段长度为3088bp,以胶回收产物为模板，使用P3、P4引物进行聚合酶链式反应，P3为上游引物：gatgaaagcggcgacgcgcagttaaggtacccgggtaatacag(如SEQ ID No.8所示)，P4为下游引物：cgagagtcggtttttgtgtttgcatgaattc tagaggatcctacac(如SEQ ID No.9所示)，扩增长度为3144bp反应条件为95℃变性2min，然后95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸1min，共35个循环后，再于72℃延伸5min，PCR结束后进行琼

使用Seamless Cloning Kit(购自碧云天)将P12、P34两个片段连接，调节连接的反应条件为50℃，90min。然后将连接产物转化至野生型大肠杆菌MG1655感受态细胞中，使用卡那霉素抗性LB平板进行培养，筛选出单菌落，进行菌落PCR鉴定，使用上游引物为P5：agcgaaagagagactggcc(如SEQ ID No.11所示)，下游引物为P6：caactgttgggaagggcga(如SEQ ID No.12所示)，PCR体系为20ul，反应条件95℃变性6min，然后95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸3min50s，共30个循环后，再于72℃延伸5min，PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳，选取扩增长度为6954bp的片段进行回收，将回收的PCR产物进行测序，将测序鉴定正确的重组菌保藏，记为XYWa0717，见图2，序列信息见SEQ ID No.13。

实施例3

以实施例2中获得的大肠杆菌表达载体XYWa0717置于24深孔板进行发酵培养，同时将实施例1中获得的XYWa0置于24深孔板进行发酵培养做为对照，将置于24深孔板高速震荡培养箱中，箱内转速880为rpm，湿度为85％，pH为7.15，发酵时间为16h。发酵培养基配方：磷酸二氢钾3.5g/L、磷酸氢二钾3g/L、磷酸氢二钠6g/L、硫酸铵4g/L、硫酸亚0.1g/L、一水柠檬酸2.5g/L、酵母粉3g/L、丙磺酸60g/L、微量元素混合液1mL、硫酸镁0.6/L、葡萄糖35g/L。

所述微量元素混合液各组分：CoSO4·7H2O 0.6g/L，ZnSO4·7H2O 8g/L，CuSO4·5H2O6g/L，Al2(SO4)3·18H2O 2g/L，MnSO4·H2O 5g/L，Na2MoO4·2H2O 3g/L，NiSO4·6H2O2g/L，H3BO3 1.5g/L。

发酵结束后，用比色法测量产酸量，测得载体XYWa0不产酸，载体XYWa0717产酸较高，结果如表1所示：

表1

表1可以看出，大肠杆菌载体XYWa0717在24深孔板中的产酸水平是较高的，未连入目的片的XYWa0载体是不产酸的，说明通过本申请的大肠杆菌表达载体XYWa0717应用于发酵生产色氨酸的生产中，能够有效提高色氨酸的产量。

对比例1

在发酵培养上述两种载体的同时，本申请将另一大肠杆菌载体也置于相同的24深孔板进行发酵培养，培养条件与实施例3相同，此大肠杆菌载体与XYWa0717启动子序列不同，其他序列信息均相同，启动子序列见SEQ ID No.14，此大肠杆菌载体进行深孔板发酵培养后获得的产酸指标如表2所示：

表2

该表数据与表1相比较可以看出，该对比例中使用的大肠杆菌载体产酸量明显低于本申请中的大肠杆菌表达载体XYWa0717，进一步说明XYWa0717载体的启动子强度和翻译起始效率较好，在产酸方面具有显著优势。