一株冠菌素高产菌株、发酵方法及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株冠菌素高产菌株、发酵方法及其应用。

背景技术

冠菌素(coronatine，COR)是茉莉酸(JA)的结构类似物，是全球第一个实现产业化的茉莉酸类分子信号调控剂，它是由一个含聚酮的冠菌酸(2-甲酸基,4-乙基,7-羰基二环[4.3.0]壬烷，coronafacic acid，CFA)和一个含α-氨基酸的冠烷酸(1-氨基,1-甲酸基,3-乙基环丙烷，coronamic acid，CMA)通过酰胺键连接而成的新型植物生长调节物质，其分子式为C

1971年Ichihara发现杂草经常发生黄化枯萎。1976年Ichihara发现，杂草发黄枯萎是由一种微生物导致的，并从这种微生物中提取了一种物质，其是导致杂草黄化的主要物质。该物质由成都新朝阳作物科学股份有限公司牵头，经全国农药标准化技术委员会审定，于2013年5月3日首次命名为‘冠菌素’，至此，正式获得冠菌素的全球通用名。研究表明，冠菌素信号分子参与植物生长发育众多生理过程的调控，尤其是作为环境信号分子能有效地诱导植物对病原菌、食草动物及非生物胁迫等的防御反应，促进一系列防御基因的表达和防御反应化学物质的合成，并调节植物的“免疫”和“应激”反应。

目前，关于冠菌素的生理作用研究已经取得了一定的研究进展，它具有促进细胞分化，提高叶绿素含量，调控植物生长，抑制细胞衰老等生理功能。冠菌素是茉莉酸的结构模拟物，但在某些功能上比茉莉酸效果更显著，活性可高达茉莉酸类物质的100～10000倍，用量少且效果显著，使用后无残留，对环境和农产品更安全，广泛适用于有机和绿色农业生产，是一种潜力极大的环境友好型植物生长调节剂。

冠菌素合成有两种方法，一种是化学合成法，但目前费用较高，且产量始终停留在较低水平，难以达到工业化生产的要求；另一种是生物合成法，即微生物发酵法，许多丁香假单胞菌属的一些致病变种能够产生冠菌素，如丁香假单胞菌绛红致病变种、丁香假单胞菌大豆致病变种、丁香假单胞菌番茄致病变种等，最初日本北海道大学市原荻民(1998)用发酵法从250升发酵液中得到的冠菌素、冠菌酸和冠烷酸共200毫克，其中冠菌素只有60毫克。因此市原狄民认为冠菌素产量如此之低，不可能通过发酵法生产，因此，限制冠菌素产业化的最重要因素就是缺少高产的优良菌株。

申请人在2005年07月22日申请了专利CN100396773C，该专利涉及一种用于生产冠菌素的丁香假单孢菌大豆致病变种(P.syringaepv.Glycinea)基因工程菌株及其构建方法，该工程菌株是利用亚硝基胍诱变处理出发菌株，使其产生基因突变，从而筛选冠菌素产量高的菌株；试验证实该发明基因工程菌株可在发酵温度为18℃的条件下用于工业化发酵生产冠菌素，产量可达84.7mg/L～112mg/L。

经过不断的研究，冠菌素产量得到进一步提升，申请人在2008年08月28日申请的专利CN101338291B中公开了一种制备冠菌素的方法及其专用菌株，所提供的菌株为丁香假单胞菌大豆致病变种MW123，用该发明菌株MW123制备冠菌素，产量可达180mg/L发酵液～200mg/L发酵液，与出发菌株相比，产量提高了3～4倍。

COR-冠菌素作为生物发酵产品，具有较高的环境安全性，若能进一步提升冠菌素的产量，将对农业绿色、健康、可持续发展具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一株冠菌素高产菌株、发酵方法及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明发明人针对野生菌株因冠菌素发酵产量低导致生产成本高的问题，经过深入研究，采用紫外诱变法选育最终得到了一株丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)XZY01，该菌株保藏编号为CGMCC No.26277。

本发明还提供了一种冠菌素高产的发酵方法，其特征在于，利用前述的菌株进行发酵，得到冠菌素。

在本发明的一个具体实施方式中，所述菌株经平板培养基培养，摇瓶种子培养及通气发酵，获得含有冠菌素的发酵液。

在本发明的一个具体实施方式中，所述平板培养基为YPG培养基。

所述YPG培养基成分为：酵母粉4～5.5g/L，蛋白胨4～5.5g/L，葡萄糖4～5.5g/L，琼脂13～17g/L，pH调至6.5～6.9。

在本发明的一个具体实施方式中，所述平板培养基培养的条件为23～30℃培养0.5～2天。

在本发明的一个具体实施方式中，使用YPG培养液进行种子培养；所述培养条件为23～30℃振荡培养0.5～2天。

进一步的，是将摇瓶种子培养液里的菌株接种到GC培养液里进行通气发酵。

所述GC培养液成分为：甘油28～30.5g/L，磷酸二氢钾4.8～6g/L，三水磷酸氢二钾2.5～3.5g/L，大豆饼粉4～6g/L，异亮氨酸0.60～0.68g/L，七水硫酸镁0.1～0.3g/L，大豆油0.4～0.6g/L，pH调至6.5～6.9。

进一步的，所述通气发酵的条件为：在16～25℃，转速500～1000rpm，通气量12～18L/min，罐压0.03～0.07Mpa条件下发酵培养。

本发明还提供了一种前述发酵方法得到的冠菌素在包括但不限于植物抗逆、抗病虫害、生长调节、提高农产品品质中的应用。

本发明冠菌素可广泛应用于作物转色、增糖、氨基酸、蛋白质、风味物质等以提升品质，所述作物包括但不限于柑橘、葡萄、火龙果、苹果、番茄、棉花、玉米、小麦、水稻、大豆等。

进一步的，本发明提供的冠菌素在促进果实转色或增加果实糖度中的应用。

本发明冠菌素应用时，可以与其它植物生长调节剂结合，在不同浓度时呈现不同的应用效果。

市面上的着色增糖产品多数都是营养补充型，主要是通过在果实膨大期、着色期进行营养补充来达到目的，而本发明冠菌素作为新型茉莉酸类信号分子调控剂，是通过激活植物内源激素的合成以及调控作物本身基因的表达来实现对果实生长发育的调控，不会造成果实提前软果、树体早衰等不良后果，是一种高效的转色增糖生物制剂产品。

本发明的有益效果是：

(1)本发明通过对野生菌株进行诱变选育，并对发酵工艺进行优化，得到丁香假单胞菌XZY01，利用该菌株制备得到的冠菌素发酵产量大幅提升，菌株XZY01发酵液中冠菌素产量可达到365mg/L，与出发菌株相比，产量提高了18倍。

(2)本发明方法得到的冠菌素可以应用于果实的转色与糖度提升，实验表明，本发明制备得到的冠菌素可使葡萄或柑橘的着色指数增加16％左右，可溶性糖含量提高17％左右，能够促进作物早上市。

(3)本发明冠菌素发酵方法产量高、发酵周期短、能耗少、生产成本低，适于工业推广应用，具有广阔的工业与农业应用前景。

附图说明

图1是实施例1中野生菌株CK和高产菌株XZY01发酵液中冠菌素产量的液相色谱检测结果比较；

图2是实施例2中野生菌株CK和高产菌株XZY01的菌落形态比较；

图3是实施例2中野生菌株CK和高产菌株XZY01发酵液中冠菌素产量的液相色谱检测结果比较；

图4是实施例3中野生菌株CK1和高产菌株XZY01发酵液中冠菌素产量液相色谱检测结果比较；

图5是实施例4中，纯化所得冠菌素与冠菌素标品的液相色谱检测结果比较。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法或制品不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法或制品所固有的要素。

应当明确的是，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。冠菌素标品购自sigma公司。

生物材料保藏说明

本发明提供的丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)XZY01菌株已于2022年12月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.26277。

实施例1冠菌素高产菌株的选育

1.丁香假单胞菌CK的培养

1)用接种环将丁香假单胞菌CK接种至YPG培养基，28℃培养1天。

2)YPG培养液成分：酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖5g/L，琼脂15g/L，pH调至6.8。

3)将生长良好的丁香假单胞菌CK接种至5mL的YPG培养液中，于28℃，200rpm震荡培养1天。

2.丁香假单胞菌CK的紫外诱变

1)将5mL的菌液于6000rpm离心1min，弃上清，收集菌体。

2)用等体积0.5mol/L无菌磷酸缓冲液(PH＝7)洗涤并重悬菌体沉淀，获得菌悬液。

3)将5mL菌悬液倒入13cm的平皿中，用磁力转子搅拌菌液，用15W紫外灯照射诱变20s。

3.高产菌株发酵与筛选

1)将紫外诱变菌液均匀涂布至含YPG培养基的平皿上，于28℃培养3天。

2)挑取致死率超过90％的平皿中生理形态变化明显的单菌落2880株，划线至YPG培养基上并编号，于28℃培养1天。

4)将培养好的2880个诱变菌株和丁香假单胞菌CK，分别接种至对应编号的96孔板内，再分别向每个孔内加入0.2mL的YPG培养液，于28℃，200rpm震荡培养1天。

5)将2880个诱变菌株和丁香假单胞CK的菌液各取20uL，分别转接对应编号的48孔板内，再分别向每个孔内加入2mL的GC发酵液中，于18℃，200rpm震荡培养14天。

6)GC培养液成分：甘油29.8g/L，磷酸二氢钾5.3g/L，三水磷酸氢二钾3g/L，大豆饼粉5g/L，异亮氨酸0.65g/L，七水硫酸镁0.2g/L，大豆油0.5g/L，pH调至6.8。

用HPLC方法，将丁香假单胞菌CK和2880株紫外诱变菌株的发酵液中冠菌素的含量逐个检测。HPLC检测方法为C18(4.6×250mm，10μm)色谱柱，流动相A(乙腈)：流动相B(0.1％磷酸水溶液)＝67:33，流速1mL/min，检测波长220nm，柱温30℃，检测时长15min。用5％甲醇水溶液配制不同梯度(0、30、100、150、300、500mg/L的冠菌素标品绘制的标准曲线为Y＝10670X+13714，R

实施例2冠菌素高产菌株在20L发酵罐上发酵培养

1)菌种活化：将丁香假单胞菌CK和XZY01分别接种至2个装有YPG培养基的平皿上，28℃培养1天后，观察单菌落形态，圆形，淡黄色半透明，中央略隆起，胶质粘稠，边缘整齐(图2)。

2)种子培养：挑取CK和XZY01的单菌落接种至含150mL的YPG培养液三角瓶中，于28℃，200rpm震荡培养1天。

3)发酵培养：将上述菌株分别接种至20L的发酵罐内，内装有15L的GC培养液，于18℃，转速800rpm，通气量15L/min，罐压0.05Mpa条件下，发酵10天，得到冠菌素发酵液。

4)冠菌素含量测定：用HPLC法分别测定CK和XZY01发酵液中冠菌素的含量，菌株CK发酵液中冠菌素含量为16mg/L，而菌株XZY01发酵液中冠菌素含量为278mg/L，XZY01的发酵产量较CK的提高了16倍(图3)。

实施例3冠菌素高产菌株在200L发酵罐上发酵培养

1)菌种活化：将丁香假单胞菌CK和XZY01分别接种至2个装有YPG培养基的平皿上，28℃培养1天。

2)种子培养：挑取CK和XZY01的单菌落分别接种至含1.5L的YPG培养液三角瓶中，于28℃，200rpm震荡培养1天。

3)发酵培养：将上述菌株分别接种至200L的发酵罐内，内装有150L的GC培养液，于18℃，转速450rpm，通气量150L/min，罐压0.05Mpa条件下，发酵9天，得到冠菌素发酵液。

4)冠菌素含量测定：用HPLC法分别测定CK和XZY01发酵液中冠菌素的含量，菌株CK发酵液中冠菌素含量为19mg/L，而菌株XZY01发酵液中冠菌素含量为365mg/L，XZY01的发酵产量较CK的提高了18倍(图4)。

实施例4高产菌株发酵液制备获得冠菌素

1)收集实施例2的XZY01发酵液15L，经过滤离心除去菌体得到发酵上清液，再用盐酸调PH至2.0。

2)将上述发酵液，用大孔树脂吸附过柱，用蒸馏水冲洗吸附柱至洗脱液无色后，再用丙酮洗脱，收集丙酮洗脱液直至冠菌素含量低于HPLC检测限。

3)所得丙酮洗脱液于45℃，0.08Mpa进行旋蒸浓缩，干燥后即可得到2.6g冠菌素，经HPLC检测，其纯度为95％(图5)。

实施例5冠菌素在葡萄上转色增糖的应用功能开发

1)试验作物：葡萄品种为巨峰，株距0.8m，行距1.5m。

2)小区设置：共设6个处理，每个处理设置4个小区重复，每个小区面积20m

3)药剂浓度：将实施例4制备所得的冠菌素，用清水分别稀释成0.02、0.03、0.04、0.06mg/L，以200mg/L的S-诱抗素作为阳性对照，以清水为阴性对照，共6个处理，每个小区用药0.9L。

4)施药方法：采用叶面喷雾法均匀喷施药剂，在葡萄果实转色初期(整体转色10％时)，施药1次。

5)结果调查：采收时，每株随机取3-4穗，调查果实的着色指数并测定果实中的可溶性糖含量，结果表明，0.02、0.03、0.04、0.06mg/L的冠菌素处理可以显著提高葡萄果实的着色指数，效果优于阳性对照药剂S-诱抗素(如表1所示)。

表1冠菌素对葡萄果实的转色和增糖的影响

实施例6冠菌素在柑橘上转色增糖的应用功能开发

1)试验作物：柑橘品种为冰糖橙，按2.5米×3米种植规格定植，666平方米栽60棵，试验所选果园柑橘树长势基本一致，农事管理水平较高。

2)小区设置：共设6个处理，每个处理设置4个小区重复，每个小区面积22.2m

3)药剂浓度：将实施例4制备所得的冠菌素，用清水分别稀释成0.02、0.03、0.04、0.06mg/L，以200mg/L的S-诱抗素作为阳性对照，以清水为阴性对照，共6个处理，每个小区用药3L。

4)施药方法：采用叶面及果实喷雾法均匀喷施药剂；在柑橘果实转色初期(整体转色10％时)，施药1次；间隔15天再施药1次；共施药2次。

5)结果调查：采收时，每个果树随机从东南西北四个方向，上中下三个方位共取100个果实，调查果实的着色指数并测定果实中的可溶性糖含量。结果表明，0.02、0.03、0.04、0.06mg/L的冠菌素处理可以显著提高柑橘果实的着色指数与可溶性糖含量，效果优于阳性对照药剂S-诱抗素(如表2所示)。

表2冠菌素对柑橘果实的转色和增糖的影响

前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。