一种四倍体裂叶桦的高效创制方法

技术领域

本发明涉及林木育种领域，特别是涉及一种四倍体裂叶桦的高效创制方法。

背景技术

裂叶桦(Betula pendula'Dalecarlica')是欧洲白桦的一个变种。树皮白色，树干通直，叶片深裂，是很好的用材及绿化树种，但适应性及抗旱耐盐性弱。研究团队前期对白桦四倍体研究显示，与其它林木多倍体一样，具有叶片、花序、果序形态均表现巨大性以及较强的抗性、适应性等特点。借鉴白桦倍性育种经验，裂叶桦多倍体育种途径有望突破其适应性及抗旱耐盐性弱的问题。

虽然利用秋水仙碱诱导染色体加倍选育四倍体在白桦等林木中都已成功应用，但在裂叶桦中利用该方法选育四倍体尚未见报道。

鉴于此，本发明提供了一种四倍体裂叶桦的创制方法，以解决目前二倍体裂叶桦适应性及抗旱耐盐性弱的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种四倍体裂叶桦的高效创制方法，以解决上述现有技术存在的问题，能够成功培育四倍体裂叶桦，为目前二倍体裂叶桦适应性及抗旱耐盐性弱的问题解决提供新方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种四倍体裂叶桦的高效创制方法，采用固体混培法或者浸渍法诱导培养二倍体裂叶桦外植体，得到四倍体裂叶桦；

其中，所述固体混培法包括以二倍体裂叶桦无菌叶片、叶柄或幼茎为外植体，接种于含有质量浓度0.03％-0.1％秋水仙素的固体培养基中处理2-6d，得到四倍体裂叶桦；

所述浸渍法包括以二倍体裂叶桦无菌叶片、叶柄或幼茎为外植体，浸泡于含有质量浓度为0.2％-0.6％的无菌秋水仙素溶液中，常温黑暗下振荡处理12-36h，摇床转速90r/min，得到四倍体裂叶桦。

优选的是，1L所述固体培养基包括如下组分：1.99g/LWPM+20g/L蔗糖+5-5.5g/L琼脂+164mg/L硝酸钙+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5mg/L GA

首先配制1％秋水仙素母液：秋水仙粉末1g+二甲基亚砜10mL+蒸馏水90mL。(细菌滤器过滤后，分装与50mL离心管中，4度冰箱冻存)。母液是配置的秋水仙素的原始浓度,因为秋水仙素见光分解，所以秋水仙素母液配好要用锡纸包着放在冰箱里。

所述固体培养基配制步骤如下：

(1)配制1L的固体培养基，其包含1.99g/LWPM+20g/L蔗糖+5-5.5g/L琼脂+164mg/L硝酸钙+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5mg/L GA

(2)取上述配制好的培养基，分装培养瓶中(3瓶97mL，3瓶95mL，3瓶90mL)，进行高压灭菌。

(3)取上述灭菌的培养基，在超净台中分别加秋水仙素母液，具体方案如下：

配制100mL的含0.03％秋水仙素的培养基：97mL培养基加秋水仙素母液3mL。

配制100mL的含0.05％秋水仙素的培养基：95mL培养基加秋水仙素母液5mL。

配制100mL的含0.1％秋水仙素的培养基：90mL培养基加秋水仙素母液10mL。

(4)混匀后立即倒平板(提前准备灭菌平板)，倒完的平板立即标记代号，不要混淆。

所述0.2％-0.6％无菌秋水仙素溶液在超净台中由母液稀释即可得到(以下方案中蒸馏水需高压灭菌)，具体方案如下：

配制100mL的0.6％秋水仙素：60mL母液+40mL蒸馏水。

配制100mL的0.4％秋水仙素：40mL母液+60mL蒸馏水。

配制100mL的0.2％秋水仙素：20mL母液+80mL蒸馏水。

优选的是，所述固体混培法包括以二倍体裂叶桦叶柄为外植体，用含有质量浓度0.05％秋水仙素的固体培养基处理6d，得到四倍体裂叶桦。

优选的是，所述浸渍法包括以二倍体裂叶桦幼茎为外植体，用含有质量浓度为0.4％的秋水仙素溶液中12h，得到四倍体裂叶桦。

优选的是，诱导培养二倍体裂叶桦外植体之前还包括如下步骤：

(1)二倍体裂叶桦腋芽的初代培养

经消毒处理的枝条上的腋芽，接种于初代培养基，每日将腋芽转接新的初代培养基，直至初代培养基上不再产生褐化为止；

(2)二倍体裂叶桦的脱分化培养

经步骤(1)培养后，带裂叶桦腋芽展叶后，取叶片转接于脱分化培养基中，获取不定芽；将所述不定芽转接于继代培养基中，继续培养，获取分化苗；

(3)二倍体裂叶桦的生根培养

待所述分化苗长至2-5cm，切取无根分化苗并将其接种于生根培养基中，获取幼苗。

优选的是，步骤(1)中，1L所述初代培养基包括如下组分：培养基中包含如下浓度的组分：1.99g/L WPM培养基+20g/L蔗糖+5-5.5g/L琼脂+164mg/L硝酸钙+0.8mg/L6-BA+0.02mg/L NAA，pH为5.8-6.2。

优选的是，步骤(2)中，1L所述脱分化培养基包括如下组分：1.99g/L WPM培养基+20g/L蔗糖+5-5.5g/L琼脂+164mg/L硝酸钙+0.8mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA+0.5mg/L GA

1L所述继代培养基包括如下组分：1.99g/LWPM培养基+20g/L蔗糖+5-5.5g/L琼脂+164mg/L硝酸钙+0.8mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA，pH为5.8-6.2。

优选的是，步骤(3)中，1L所述生根培养基包括如下组分：1.99g/LWPM培养基+20g/L蔗糖+5-5.5g/L琼脂+164mg/L硝酸钙+0.4mg/L IBA。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过实验验证，采用固体混培法诱导效果最佳处理组合为：以叶柄为外植体，在秋水仙素浓度为0.05％的固体培养基中处理6d，诱导率为40.98％。采用浸渍法诱导效果最佳处理组合为：以幼茎为外植体，在秋水仙素浓度为0.4％的溶液中处理12h，诱导率为67.20％。诱导率很高，非常容易获得四倍体裂叶桦。裂叶桦(Betula pendula'Dalecarlica')是欧洲白桦的一个变种，树皮白色，树干通直，叶片深裂，是很好的用材及绿化树种，目前在城市园林绿化中应用的裂叶桦均为二倍体。因此，通过本发明公开的方法，能够选育适应性及抗旱耐盐性强的多倍体裂叶桦，这对丰富东北地区的造林及园林绿化树种具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为裂叶桦二倍体和四倍体叶片单细胞DNA含量图；A：二倍体；B：四倍体；

图2为裂叶桦二倍体根尖染色体数目；

图3为裂叶桦四倍体组培苗根尖染色体数目；

图4为秋水仙素诱导获得的四倍体生根苗；A二倍体；B：四倍体；

图5为裂叶桦二倍体和四倍体叶片形态；图中左侧为二倍体叶片，右侧为四倍体叶片。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下实施例试验材料取自黑龙江省哈尔滨市东北林业大学白桦强化种子园的一株二倍体裂叶桦优良单株。

实施例1

1、外植体消毒

采集带有腋芽的裂叶桦枝条带回实验室，将枝条上腋芽取下后放入组培瓶中，用清水清洗1遍后，再放入含有适量的洗洁精水溶液中清洗1遍，用自来水洗2-3遍，随后在超净工作台中用无菌水清洗2遍，加入75％的酒精摇晃1min，用无菌水清洗2遍，时间在2min左右，加入30％H

2、实验药品及试剂

6-Benzylaminopurine购自Phyto Technology Laboratories公司。1-naphthlcetic acid、Gibberellic Acid、Indole-3-butyric Acid均购自Sigma公司。植物组织培养WPM粉购自Coolaber公司。

3、二倍体裂叶桦(2n＝2x)腋芽的初代培养

在超净工作台中，用尖镊子剥离去除芽鳞，取出白色的腋芽接种于初代培养基上(1L培养基中1.99g/L WPM培养基+20g/L蔗糖+5-5.5g/L琼脂+164mg/L硝酸钙+0.8mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA，用NaOH将pH调到5.8-6.2之间)，由于刚刚接种的腋芽释放一些代谢物，导致培养基产生褐化现象，故此需要每日将腋芽转接至新鲜的初代培养基中，直至不再褐化为止(5天左右)。其中培养条件：光照强度为6000-8000勒克斯，光照/黑暗周期为16h/8h，平均温度为25℃，相对湿度为60-70％。

4、脱分化培养

在初代培养基中，待裂叶桦腋芽展叶后，立即切取叶片转接于脱分化培养基中(1L培养基中1.99g/L WPM培养基+20g/L蔗糖+5-5.5g/L琼脂+164mg/L硝酸钙+0.8mg/L6-BA +0.02mg/L NAA+0.5mg/L GA3，用NaOH将pH调到5.8-6.2之间；琼脂优选5.5g)，25天更换一次培养基，待产生不定芽后，转接至继代培养基中(1L培养基中1.99g/L WPM培养基+20g/L蔗糖+5-5.5g/L琼脂+164mg/L硝酸钙+0.8mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA，用NaOH将pH调到5.8-6.2之间；琼脂优选5.5g)，25天更换一次培养基。

5、二倍体裂叶桦的生根培养

切取高度在2cm左右的无根苗，接种于生根培养基中(1L培养基中1.99g/L WPM培养基+20g/L蔗糖+5-5.5g/L琼脂+164mg/L硝酸钙+0.4mg/L IBA；琼脂优选5.5g)培养25-30天。

6、四倍体裂叶桦的预培养及诱导

试验以裂叶桦无菌叶片、叶柄及幼茎为受体，共设两种诱导处理方式，分别为含不同浓度秋水仙素的固体混培法以及不同浓度秋水仙素溶液浸渍法。将嫩叶切成边长1cm方块，叶柄和嫩茎切成1cm小段，接种于普通分化培养基上(1L培养基中1.99g/LWPM培养基+20g/L蔗糖+5-5.5g/L琼脂+164mg/L硝酸钙+0.8mg/L 6-BA+0.02mg/LNAA+0.5mg/L GA3)，分别预培养7d。

a、固体混培法：将预培养后的外植体接种至含0.03％、0.05％、0.1％秋水仙素的固体培养基上(1L培养基中1.99g/L WPM培养基+20g/L蔗糖+5-5.5g/L琼脂+164mg/L硝酸钙+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5mg/L GA3+不同浓度的秋水仙素)，黑暗下处理2d、4d、6d，处理组合见表1。

b、浸渍法：将预培养后的外植体浸泡于浓度为0.2％、0.4％、0.6％无菌秋水仙素溶液中，常温黑暗下振荡处理12h、24h、36h，摇床转速90r/min，处理组合见表2。

诱导处理后的外植体用无菌水冲洗5次，再用无菌滤纸擦干表面水分，接种到不含秋水仙素的普通分化培养基上(1L培养基中1.99g/L WPM培养基+20g/L蔗糖+5-5.5g/L琼脂+164mg/L硝酸钙+0.8mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA+0.5mg/L GA3)。每处理接种2瓶，每瓶内接种5个外植体。20d后统计各处理外植体存活率，40d后统计外植体出芽率，长出不定芽后转接于继代培养基中(1L培养基中1.99g/L WPM培养基+20g/L蔗糖+5-5.5g/L琼脂+164mg/L硝酸钙+0.8mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA)。剪取长至2cm的幼芽，接种至生根培养基中(1L培养基中1.99g/L WPM培养基+20g/L蔗糖+5-5.5g/L琼脂+164mg/L硝酸钙+0.4mg/L IBA)诱导生根。利用流式细胞仪进行倍性鉴定。

7、统计方法

外植体存活率＝(20d后存活外植体数/接种外植体总数)x100％；

外植体出芽率＝(40d后出芽外植体数/接种外植体总数)x100％；

诱导率＝(诱导出四倍体的外植体数/接种外植体总数)x100％。

8、结果及分析

8.1不同方法处理对裂叶桦四倍体诱导效果的影响

(1)固体混培法处理对裂叶桦四倍体诱导效果的影响

含不同浓度秋水仙素的固体培养基处理对裂叶桦多倍体诱导效果的影响见表1。由表1可知，同一秋水仙素浓度处理下，叶片的存活率和出芽率均最小，其中秋水仙浓度最大0.1％，处理时间最长6d时，叶片存活率和出芽率达到最小值，分别为40％和30％，叶柄和幼茎差异不明显。三种外植体叶、柄、茎在固体混培法诱导下均获得四倍体。其中，诱导效果最佳处理组合为：以叶柄为外植体，在秋水仙素浓度为0.05％的固体培养基中处理6d，诱导率为40.98％。

表1固体混培法处理对裂叶桦四倍体诱导效果的影响

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(2)浸渍法处理对裂叶桦四倍体诱导效果的影响

不同浓度秋水仙素溶液浸渍处理对裂叶桦多倍体诱导效果的影响见表2。由表2可知，同一秋水仙素浓度处理下，叶片的存活率和出芽率均最小，其中秋水仙浓度最大0.6％，处理时间最长36h时，叶片存活率和出芽率达到最小值，分别为40％、40％，叶柄和幼茎差异不明显。三种外植体叶、柄、茎在固体混培法诱导下均获得四倍体。其中，诱导效果最佳处理组合为：以嫩茎为外植体，在浓度为0.4％的秋水仙溶液中处理12h，诱导率为67.20％。

表2浸渍法处理对裂叶桦四倍体诱导效果的影响

上述结果显示，固体混培法和浸渍法诱导均可诱导得到裂叶桦多倍体，固体混培法的总诱导率是237.09％，最高诱导率为40.98％，浸渍法的总诱导率是405.36％，最高诱导率为67.20％。针对不同诱导方法选择合适的处理浓度和处理时间下均可获得较好的多倍体诱导效果，不同诱导方法诱导率从大到小依次为浸渍法和固体混培法。诱导材料的选择对多倍体诱导效果影响较大，叶片总变异率为118.68％，最高变异率为32.26％；叶柄总变异率为268.57％，最高变异率为61.76％；嫩茎总变异率为253.2％，最高变异率为67.20％，叶片诱导率最小，叶柄和幼茎差异不明显。

8.2裂叶桦倍性鉴定及苗期性状分析

(1)流式细胞仪鉴定结果

采用流式细胞仪进行倍性鉴定，裂叶桦二倍体与四倍体新鲜叶片单细胞荧光强度如图1所示。两种倍性植株叶片单细胞荧光强度值均为单峰，未出现其他峰值，二倍体对照植株在相对荧光强度值为50时出现一个单峰(见图1A)，诱导得到的四倍体植株在相对荧光强度值为100时出现一个单峰(见图1B)，即诱导变异的裂叶桦植株叶片单细胞DNA含量为对照二倍体的2倍。综上，诱导得到的变异植株为四倍体。

(2)核型分析

对倍性细胞仪检测为四倍体的裂叶桦植株移入生根培养基中，当根长为1cm时取材固定，用醋酸洋红进行颜色后，压片，在显微镜下可以看到二倍体裂叶桦染色体数为28(见图2)，而四倍体裂叶桦的染色体数目是二倍体的二倍，为56条(见图3)。进一步证明加倍成功。

(3)组培苗的长势

四倍体的组培苗叶片明显大于二倍体，且植株长势也变强(见图4)；移栽后四倍体的叶片也是显著大于二倍体(见图5)。

二倍体和四倍体裂叶桦植株在单细胞DNA含量、组培苗生长、叶片表型特征上有显著差异。在叶片单细胞DNA含量上，变异株为二倍体的二倍，证明变异植株为四倍体；组培苗生长上，四倍体组培苗根粗壮茂盛，二倍体组培苗根细且稀疏，生长速度上四倍体更快；叶片表型上，四倍体叶片更大，叶色较深，叶面更粗糙。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。