一种鲐鱼源自组装多肽-钙纳米载体的制备方法

(一)技术领域

本发明涉及一种鲐鱼源自组装多肽-钙纳米载体的制备方法。

(二)背景技术

鲐鱼系一种鲭科鲐属鱼，主要分布在我国的东海和黄海，是我国近海捕捞的主要经济鱼类之一。根据《2021年中国渔业年鉴》报道，2020年鲐鱼年捕捞量约为40万吨，它物美价廉，营养丰富，具有丰富的蛋白质，富含人体必需氨基酸；同时，鲐鱼蛋白中的谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸以及组氨酸又是钙离子结合活性密切相关的基团，是钙离子结合肽的潜在来源。因此，鲐鱼作为新型功能食品的优质蛋白原料，具有较大的开发潜力。但是我国对鲐鱼加工与利用程度有限，鲐鱼资源的利用主要以鱼粉、冷冻鲐鱼片、鲐鱼腌制品等初级产品为主，缺乏高附加值的产品，限制了鲐鱼的增值空间。

钙是人体中含量最丰富的矿物元素，不仅是构成机体完整性不可缺少的组成部分，而且在机体各种生理和生化过程中起着极为重要的作用，钙是构成机体骨骼和牙齿的主要成分，也是神经传递、肌肉收缩、血液凝结、激素释放等所必需的元素。在日常的膳食中摄入不足以及摄入钙的生物利用度低都会导致钙缺乏症的出现，生长期婴幼儿可表现出生长发育迟缓，严重时发生佝偻病，中老年时期则会导致骨质疏松症、骨质软化症等。缺钙在全世界都很普遍，影响着全世界超过7500万人，因此提高钙在人体的生物利用度和吸收率尤为重要。

目前，市面上常见的钙补充剂是离子钙，主要包括无机钙和有机酸钙制剂和氨基酸螯合钙制剂等。无机钙对胃有很大的刺激作用并且在肠道环境下易沉淀，有机钙溶解度大，易流失且成本高，而氨基酸螯合钙虽然有较高的生物利用度，但是价格高昂且存在潜在的安全问题，长期服用可能会导致人体的负氮平衡。越来越多的研究表明，多肽可以通过螯合钙离子自组装成为钙纳米载体，递送钙元素。这种钙纳米递送系统能够促进机体对于钙的吸收，提高钙在机体的消化稳定性和生物利用度，在吸收通道和吸收速度上也具有氨基酸无可比拟的优越性。对于钙补充剂而言，这种钙纳米递送系统引起了研究者的极大关注，成为当前补钙制剂领域研究的热点。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种鲐鱼经模拟胃肠道消化水解物中获得的，具有自组装形成肽-钙纳米复合物和促进钙离子吸收功能的鲐鱼源自组装多肽-钙纳米复合物的制备方法，可应用于功能性保健食品、营养强化食品等领域。

本发明采用的技术方案是：

一种鲐鱼源自组装多肽-钙纳米载体的制备方法，所述方法包括：

(1)鲐鱼预处理：将鲐鱼粉进行萃取脱脂获得鲐鱼脱脂粉；

(2)鲐鱼源自组装多肽制备：鲐鱼脱脂粉加入水混匀配制成蛋白浓度为10～50mg/mL的酶解反应液，90～100℃加热10～30

min，调节pH至2.0～5.0，添加3000～10000U/g蛋白的胃蛋白酶，30～40℃、200～400rmp搅拌酶解2～5h，后调节pH至7.0～9.0，再加入3000～10000U/g蛋白的胰酶，30～40℃、

200～400rmp搅拌酶解2～5h后加热灭酶，离心取上清液、真空冷冻干燥，获得鲐鱼源自组装多肽；

(3)鲐鱼源自组装多肽-钙纳米载体的制备：鲐鱼源自组装多肽与CaCl

步骤(3)中鲐鱼源自组装多肽与CaCl

具体的，步骤(1)鲐鱼预处理方法如下：向鲐鱼粉中按料液比1g：10～30mL加入正己烷/无水乙醇混合液，萃取脱脂；萃取条件为：温度30～60℃、100～200rpm搅拌4～6h，抽滤取沉淀，共萃取1～3次；将所述沉淀自然风干、粉碎，得鲐鱼脱脂粉；其中，所述正己烷/无水乙醇混合液中正己烷与无水乙醇体积比为1～5：1。

优选的，所述鲐鱼脱脂粉的目数为80～100目；所述风干具体为干燥至所述沉淀的含水重量百分含量为5～10％。

具体的，步骤(2)中冷冻干燥分为三个阶段，具体为：第一阶段预冷温度-40～-10℃，2～3h；第二阶段抽真空段温度-40～-10℃，压强0～20Pa，1～2h；第三阶段冻干在0～25℃，压强0～20Pa的条件下进行，冻干总时长为40～50h。

优选的，步骤(3)中冷冻干燥为：冷阱-50～-70℃，真空度1～20Pa，冻干时间48～72h。

本发明以Caco-2单层细胞转运模型来评价鲐鱼源自组装多肽-钙纳米载体递送钙离子的功能。本发明制得的鲐鱼源自组装多肽-钙纳米载体，在90min时可转运61.26±3.10μg/well钙离子，促钙吸收效果均优于消化后的CaCl

本发明的有益效果主要体现在：

1、本发明方法制备的钙纳米递送系统能够促进机体对于钙的吸收，可以提高钙在机体的消化稳定性和生物利用度，为钙补充剂、功能性保健品、营养强化食品等领域的开发提供了新的理论依据。

2、本发明获得了一种兼具自组装功能与钙离子螯合活性的鲐鱼多肽，提高了鲐鱼蛋白的利用率，对鲐鱼资源的高值化利用提供了新思路。

3、本发明制得的具有一定纳米尺度的肽-钙复合物具有较高的钙结合能力，能够有效的提高钙在人体肠道中的吸收率，具有良好的促钙吸收效果。

4、本发明涉及的操作过程简单，不需要复杂的设备，具有良好的促钙吸收能力，提高了生产效率，适合工业化生产。

(四)附图说明

图1A为鲐鱼蛋白水解物(MPH)及其钙复合物(MPH-Calcium)的进行晶体结构分析；图1B为MPH-Calcium的原子力显微镜分析。

图2A为LC-MS/MS检测到的肽链长度分布图；图2B为LC-MS/MS检测到的肽段分子量分布图。

图3为CaCl

(五)具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。

实施例1：

(1)、鲐鱼预处理：向鲐鱼粉(购买自德清县泰源农贸市场)中按料液比1：20g/mL(w/v)加入正己烷/无水乙醇混合液，萃取脱脂；所述萃取条件为：温度30～60℃、100～200rpm搅拌4～6h，抽滤取沉淀，共萃取3次；将所述沉淀自然风干、粉碎，得鲐鱼脱脂粉，用凯氏定氮法测定鲐鱼脱脂粉中蛋白质含量；其中，所述正己烷/无水乙醇混合液中正己烷与无水乙醇的体积比为3：1；

(2)、鲐鱼胃肠道消化酶系：将步骤(1)所述的鲐鱼脱脂粉加入水混匀，配置成蛋白浓度为30mg/mL的酶解反应液，90～100℃加热20min；调节pH至2.0～5.0，以所述酶解反应液中的蛋白含量为基准，每克蛋白添加5000U胃蛋白酶，30～40℃、200～400rmp搅拌酶解2～5h，后调节pH至7.0～9.0，再加入5000U胰蛋白酶30～40℃、200～400rmp搅拌酶解2～5h后加热灭酶，离心取上清液即为鲐鱼酶解液，真空冷冻干燥，获得鲐鱼活性肽。

(3)、鲐鱼源自组装多肽-钙纳米载体的制备：取步骤(2)所述鲐鱼活性肽100mg与CaCl

实施例2：

鲐鱼蛋白的氨基酸组成的测定方法，包括步骤：

1、取50mg鲐鱼粉，加入摩尔浓度为6mol/L的HCl 5mL，充氮气后，热融密封，110℃烘箱中水解24h，脱酸后用水定容至适宜浓度，上样，用L-8900全自动氨基酸分析仪测定。

实验结果：参见表1。

表1：鲐鱼蛋白的氨基酸组成与分析

注：

实验结果表明，鲐鱼蛋白富含谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、组氨酸等与钙离子螯合活性密切相关的氨基酸，是钙离子螯合肽的潜在来源；鲐鱼蛋白中疏水性氨基酸含量占比为45.45％，必需氨基酸含量为48.14％，带负电荷的氨基酸含量为20.87％，表明鲐鱼蛋白是兼具自组装功能与钙离子螯合活性肽段的良好来源，且营养价值高，开发利用潜力巨大。

实施例3：Nano-LC-ESI-MS/MS鉴定

使用Nano-LC-ESI-MS/MS对鲐鱼蛋白水解物进行氨基酸序列和分子量鉴定，包括步骤：

1、nano LC-MS/MS分析条件：将鲐鱼蛋白水解物溶解，使用直接与MS/MS串联的Thermo Easy-nLC 425系统进行分离。色谱柱：陷阱和洗脱配置：trap cartridge(10mm×0.3mm)填充有ChromXP C18CL色谱柱(5μm，

2、样品中多肽经色谱分离后，采用有DuoSpray

3、使用Paragon

实验结果：肽组学技术用于本项目开展兼具自组装功能与钙离子螯合活性鲐鱼多肽的鉴定与筛选是高效可行的；并且鲐鱼蛋白水解物中肽段种类丰富，可以为本项目提供数量丰富的功能性多肽片段以供筛选。

实施例4：鲐鱼源自组装多肽-钙纳米载体结构表征

鲐鱼源自组装肽-钙纳米载体结构特征的测定方法，包括步骤：

1、将鲐鱼蛋白水解物(MPH)及其钙复合物(MPH-Calcium)与以0.5mg mL

2、将浓度为1mg mL

实验结果：利用XRD技术结合原子力显微镜观察证明，鲐鱼蛋白水解物可以与钙离子螯合并自组装成具有一定晶体结构的纳米复合物。利用XRD技术对鲐鱼蛋白水解物(MPH)及其钙复合物(MPH-Calcium)进行晶体结构分析，结果参见图1，发现在MPH-Calcium的XRD图谱中观察到了一些尖而窄的衍射峰，而在MPH中则没有观察到明显的衍射峰。这一现象表明，钙离子的存在增加了MPH的结晶度。

实施例5：鲐鱼源自组装多肽-钙纳米载体促钙吸收效应分析

下述步骤中所使用的Caco-2细胞来自于人结直肠腺癌细胞，购买于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号：TCHu146。

1、Caco-2细胞培养：Caco-2细胞在含有20％胎牛血清、1％青霉素/链霉素的Eagle's MEM培养基中，37℃、5％CO

2、Caco-2细胞接种：将细胞接种到10cm培养皿中，培养过夜后，细胞染色缓冲液冲洗，将细胞吹下来，转移到1.5mL离心管中，再冲洗2次；

3、钙离子荧光探针染色：以10

4、细胞内钙离子水平测定：将1×10

其中，[Ca

实验结果：本发明以CaCl

结论：本发明制备了一种鲐鱼源自组装多肽-钙纳米载体，通过模拟胃肠道消化得到鲐鱼蛋白水解物，它们可以通过螯合钙离子自组装成为钙纳米载体，且具有良好的促钙吸收能力。

以上所述仅为本发明的具体实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明作的等效交换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之中。