一种产磷脂酶D的SBT5工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种产磷脂酶D的SBT5工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

磷脂酶D(Phospholipase D，简称PLD，EC 3.1.4.4)是作用于磷脂分子中磷酸与有机碱间磷酰氧键(P-O)的一类酶。磷脂酶D的作用是水解磷脂，催化磷脂分子中磷酸与取代基团(如胆碱等)间的酯键，释放其他脂蛋白中的胆固醇和游离胆固醇。PLD分布在从细菌到高等动植物的许多生物类群中，其在生物体内的主要生理功能是参与细胞脂质代谢，信号转导及生物膜形成等。在体外，PLD也已成为合成和改造磷脂质的重要工具酶，基于PLD所特有的碱基交换活性可对磷脂进行改性，制备高纯度的单一磷脂、稀有磷脂及系列功能性磷脂，使其在食品和医药工业中具有极大的应用价值。因此，开发有工业应用价值的PLD具有重要的战略意义和发展前景。然而，虽然磷脂酶D广泛分布于病毒、动物、植物和微生物中，动物脑组织中亦有，但含量并不高，所以提取工艺较为复杂，这就造成磷脂酶D的价格较为昂贵。

目前，国内用基因工程技术制备PLD的研究方面，相较于其他类型酶蛋白(蛋白酶、脂肪酶等)，还处于起步阶段，基本上都停留在实验室最初级水平。而国外对微生物PLD的研究已较为成熟，一些酶制剂公司已筛选出高产PLD的链霉菌菌株，如Sigma-Aldrich公司的Streptomyces sp.PLD酶制剂，而商品化PLD的价格非常昂贵，每毫克售价约一千元人民币左右。对进口酶源的高度依赖严重影响了我国生化产业的发展，其中也包括体外诊断试剂的自主研发。

对此，本申请单位研发了多种产磷脂酶D的基因工程菌，并就其中的一种“产磷脂酶D的毕赤酵母工程菌”申请了专利(专利名称为“一种产磷脂酶D的基因工程菌及其构建方法与在sdLDL-C检测试剂盒开发中的应用”，授权公告号为CN 112899178B)，该工程菌能够高效表达PLD蛋白，将其替代现有sdLDL-C检测试剂盒中的进口PLD，可降低生产成本。然而，上述工程菌仍存在一些不足之处，例如，表达的PLD蛋白水解酶活仍有提升空间，造成检测用量无法精简，无法最大化地降低应用成本。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种产磷脂酶D的SBT5工程菌及其构建方法与应用，利用该基因工程菌生产的PLD蛋白具有更高的水解酶活，将其替代现有sdLDL-C检测试剂盒中的进口PLD，可最大程度地降低成本。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

一种产磷脂酶D的SBT5工程菌，所述工程菌包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

一种产磷脂酶D的SBT5工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)磷脂酶D基因的定点突变

选择S.chromofuscus色褐链霉菌来源的磷脂酶D作为野生型磷脂酶D的目的基因，基因序列如SEQ ID NO.1所示；

对所述目的基因进行定点突变，将目的基因中的连续两个丙氨酸Ala利用人工诱导突变为两个甘氨酸Gly，以获得适合在变铅青链霉菌SBT5中高效表达的基因序列，突变后的基因序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)突变体的筛选

剔除掉突变不完全、诱变不彻底的基因，选择突变完全、序列清晰的目的基因进行下一步操作；

(3)磷脂酶D基因突变体的糖基化位点分析

将定点突变后的磷脂酶D基因利用相关软件分析蛋白的糖基化位点；

(4)糖基化位点定点优化及全基因合成

为了消除潜在的被糖基化修饰位点影响，将潜在的糖基化位点的脯氨酸Pro优化为精氨酸Arg，并将糖基化位点改造后的序列进行全基因合成；最终改造后的基因序列如SEQ ID NO.3所示；

(5)初步工程菌的获得

将步骤(4)完成的序列连接在pMS82载体上，且基因上下游分别插入NotI和EcoRI酶切位点，接着转化入SBT5菌获得初步工程菌；

(6)pMS82-PLDAnti质粒的抽提

对步骤(5)得到的初步工程菌进行质粒提取，并采用琼脂糖凝胶电泳检测提取质粒的质量，检测合格的pMS82-PLDAnti质粒继续用于后续实验；

(7)重组链霉菌菌株的构建

将检测合格的pMS82-PLDAnti质粒转入变铅青链霉菌SBT5，即得目标所需的产磷脂酶D的SBT5工程菌。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，采用定量PCR或荧光免疫原位杂交检测目的基因的突变情况，剔除掉突变不完全、诱变不彻底的基因，选择突变完全、序列清晰的目的基因进行下一步操作。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，利用NetNGlyc 1.0 Server在线软件分析蛋白的糖基化位点。

一种上述产磷脂酶D的SBT5工程菌在sdLDL-C检测试剂盒开发中的应用，利用所述产磷脂酶D的SBT5工程菌所产生的磷脂酶D作为催化剂生产sdLDL-C检测试剂盒。

作为本发明的优选方式之一，利用所述SBT5工程菌获得磷脂酶D的方法为：

(1)重组PLD蛋白的摇瓶发酵

①将SBT5工程菌菌株，接种至5mL BMGY试管中，27℃，250～280rpm过夜培养；

②将过夜培养的菌液按2％的接种量转接至含有50mL ISP2培养基的摇瓶中，27℃，250～280rpm培养至OD

③用无菌的离心管，1500～3000×g离心收集细胞。诱导表达时，去除上清，用牛肉膏蛋白胨培养基重悬细胞至OD

④每24小时，加甲醇至最适终浓度诱导蛋白的表达，同样取出与加入甲醇量相同体积的菌液，用于链霉菌生物量的测定；

⑤48小时后分别取6mL菌液，离心获取上清液，进行浓缩；SDS-PAGE检测PLD蛋白是否成功表达；

(2)纯化PLD蛋白的获取

①蛋白上清液的制备

将摇瓶发酵6天的菌液分装在离心瓶中，6000×g离心30min收集上清液，把得到的上清液置于4℃冰箱保存，以备后续实验利用；

②PLD蛋白上清液的超滤

将储存在4℃冰箱的上清液，分装于500mL的离心瓶中，配平后于4℃，6000×g离心30min，取上清；将部分上清置于超滤杯中，在4℃冰箱中进行超滤，在超滤之前进行检漏，确保蛋白不会大量损失；

③PLD蛋白上清液的透析

将超滤得到的浓缩液，分装于50mL离心管中，4℃条件下，12000×g离心30min，获得上清液；

取上清装入透析袋中，将透析袋放入40mM、pH 7.4的Tris-HCl缓冲液中每隔3小时更换缓冲液，共透析3次；

将透析液分装于50mL离心管中，4℃条件下，12000×g离心30min，获得上清液，用离心管将透析液浓缩至10～15mL；

④阴离子交换层析

柱高15cm，填充材料的高度为10cm；先用2个柱体积的40mM、pH 7.4的Tris-HCl缓冲液平衡DEAE-Spharose Fast Flow柱子，然后进行上样；用0～1mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为1mL/min，每管收集8mL；SDS-PAGE检测蛋白的纯度；其中，所述0～1mol/L NaCl溶液含40mM、pH 7.4的Tris-HCl；

⑤凝胶过滤层析

先用1个柱体积的40mM、pH 7.4的Tris-HCl溶液平衡Superdex-200柱子，然后将经过离子交换层析的PLD蛋白溶液上样，上样的体积为5mL；以40mM pH 7.4、Tris-HCl的溶液进行洗脱，流速为1mL/min，每管收集1mL；根据峰图进行SDS-PAGE检测蛋白的纯度，并将纯化的磷脂酶D蛋白浓缩后备用；其中，所述40mM、pH 7.4的Tris-HCl溶液含500mM NaCl，所述40mM、pH 7.4的Tris-HCl的溶液含500mM NaCl。

作为本发明的优选方式之一，将纯化获得的磷脂酶D蛋白按照2.1KU/L的浓度添加到sd LDL-C检测试剂盒。

本发明相比现有技术的优点在于：

(1)本发明将S.chromofuscus色褐链霉菌来源的野生型PLD基因进行定位突变、突变筛选、糖基化位点优化后进行基因合成，将基因序列加入合适的酶切位点后与pMS82质粒连接，并转化变铅青链霉菌SBT5菌株，通过培养及诱导条件的优化，制得可以高效表达具有优良酶学特性的PLD蛋白的突变体菌株；

(2)本发明对野生型磷脂酶D基因进行定点突变在链球菌中能够高效表达PLD蛋白，经过简单纯化后计算其水解酶活可达130.5U/mL，且实现了其对sd LDL-C检测试剂盒中进口PLD的替代，实现了sd LDL-C检测试剂盒生产成本的最大程度降低，具有重要的发展应用价值。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例用以说明产磷脂酶D的SBT5工程菌的构建方法，包括如下步骤：

1、磷脂酶D基因的定点突变

选择S.chromofuscus色褐链霉菌来源的磷脂酶D作为野生型磷脂酶D的目的基因，基因序列如SEQ ID NO.1所示；

对所述目的基因进行定点突变，将目的基因中的连续两个丙氨酸Ala利用人工诱导突变为两个甘氨酸Gly，以获得适合在变铅青链霉菌SBT5中高效表达的基因序列，突变后的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

2、突变体的筛选

采用定量PCR或荧光免疫原位杂交检测目的基因的突变情况，剔除掉突变不完全、诱变不彻底的基因，选择突变完全、序列清晰的目的基因进行下一步操作。

3、磷脂酶D基因突变体的糖基化位点分析

将定点突变后的磷脂酶D基因利用NetNGlyc 1.0 Server在线软件分析蛋白的糖基化位点。

4、糖基化位点定点优化及全基因合成

为了消除潜在的被糖基化修饰位点影响，将潜在的糖基化位点的脯氨酸Pro优化为精氨酸Arg，并将糖基化位点改造后的序列进行全基因合成；最终改造后的基因序列如SEQ ID NO.3所示。

5、初步工程菌的获得

将步骤4完成的序列连接在pMS82载体上，且基因上下游分别插入NotI和EcoRI酶切位点，接着转化入SBT5菌获得初步工程菌。

6、pMS82-PLDAnti质粒的抽提

对步骤(5)得到的初步工程菌进行质粒提取(参照AxyPrep

7、重组链霉菌菌株的构建

将检测合格的pMS82-PLDAnti质粒转入变铅青链霉菌SBT5，即得所需的产磷脂酶D的SBT5工程菌(转入步骤采用本领域常规方法，在此不再赘述)。

进行重组菌株的发酵培养及磷脂酶D酶活检测，通过对原始菌株和重组菌株的酶活检测，进而找到表达效果最好的菌株作为目标菌株。

实施例2

本实施例用以说明PLD蛋白在SBT5中表达条件的优化。

影响重组蛋白表达的主要因素有：温度、pH和甲醇诱导的浓度。

这里，我们随机选取一个重组链霉菌菌株进行蛋白表达条件的优化，如表1所示，培养温度为27℃，培养基为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，对pH为5、6、7及甲醇诱导浓度为1.0％，1.5％，2.0％，2.5％进行棋盘实验测定，最终选择的表达条件为培养基pH＝6，甲醇诱导浓度为1.5％。

表1优化PLD蛋白表达条件

据此，重组的PLD蛋白的摇瓶发酵的步骤：

①将SBT5工程菌菌株，接种至5mL BMGY试管中，27℃，250～280rpm过夜培养；

②将过夜培养的菌液按2％的接种量转接至含有50mL ISP2培养基的摇瓶中，27℃，250～280rpm培养至OD

③用无菌的离心管，1500～3000×g离心收集细胞。诱导表达时，去除上清，用牛肉膏蛋白胨培养基重悬细胞至OD

④每24小时，加甲醇至最适终浓度诱导蛋白的表达，同样取出与加入甲醇量相同体积的菌液，用于链霉菌生物量的测定；

⑤48小时后分别取6mL菌液，离心获取上清液，进行浓缩；SDS-PAGE检测PLD蛋白是否成功表达。

实施例3

本实施例用以说明纯化PLD蛋白的获取。

1、蛋白上清液的制备

将摇瓶发酵6天的菌液分装在离心瓶中，6000×g离心30min收集上清液，把得到的上清液置于4℃冰箱保存，以备后续实验利用；

2、PLD蛋白上清液的超滤

将储存在4℃冰箱的上清液，分装于500mL的离心瓶中，配平后于4℃，6000×g离心30min，取上清；将部分上清置于超滤杯中，在4℃冰箱中进行超滤，在超滤之前进行检漏，确保蛋白不会大量损失；

3、PLD蛋白上清液的透析

将超滤得到的浓缩液，分装于50mL离心管中，4℃条件下，12000×g离心30min，获得上清液；

取上清装入透析袋中，将透析袋放入40mM、pH 7.4的Tris-HCl缓冲液中每隔3小时更换缓冲液，共透析3次；

将透析液分装于50mL离心管中，4℃条件下，12000×g离心30min，获得上清液，用离心管将透析液浓缩至10～15mL；

4、阴离子交换层析

柱高15cm，填充材料的高度为10cm；先用2个柱体积的40mM、pH 7.4的Tris-HCl缓冲液平衡DEAE-Spharose Fast Flow柱子，然后进行上样；用0～1mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为1mL/min，每管收集8mL；SDS-PAGE检测蛋白的纯度；其中，所述0～1mol/L NaCl溶液含40mM、pH 7.4的Tris-HCl；

5、凝胶过滤层析

先用1个柱体积的40mM、pH 7.4的Tris-HCl溶液平衡Superdex-200柱子，然后将经过离子交换层析的PLD蛋白溶液上样，上样的体积为5mL；以40mM pH 7.4、Tris-HCl的溶液进行洗脱，流速为1mL/min，每管收集1mL；根据峰图进行SDS-PAGE检测蛋白的纯度，并将纯化的磷脂酶D蛋白浓缩后备用；其中，所述40mM、pH 7.4的Tris-HCl溶液含500mM NaCl，所述40mM、pH 7.4的Tris-HCl的溶液含500mM NaCl。

实施例4

本实施例用以说明PLD酶活的测定。

本实验PLD水解酶活测定采用MBTH法：

将9.9mL半脱乙酰壳聚糖溶液其浓度为4mg/mL，pH值为7.0，加入到锥形瓶中于40℃的水浴摇床中预热10min，加入待测的PLD溶液0.1mL进行水解反应；为确定合适的待测PLD浓度可以将待测的PLD溶液稀释成不同浓度梯度逐个检测，水解时间为60min以内，取水解液2mL(可在反应过程中分时间段取样检测)，迅速加入2mL 0.5当量的NaOH溶液中(做三个平行样)，混匀；取1.2mL加入到试管中，再加入MBTH试剂0.6mL于75～85℃水浴加热20～25min后趁热加入硫酸铁铵试剂1.2mL，室温冷却后于波长655nm处测定吸光度值，根据上一步骤制作的N-乙酰氨基葡萄糖浓度与测得的相应吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待测的PLD的酶解产物中所含有的相当于N-乙酰氨基葡萄糖的还原糖的量。其中，PLD的活力单位可被定义为在上述条件下，每毫升反应体系中每分钟产生1nmol相当于N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活力单位，从而根据酶活力定义来推算出PLD的活力。

通过计算，本发明改良后磷脂酶D活性为130.5U/mL(较授权公告号为CN112899178B的菌株生产的磷脂酶D活性更高，在制备检测试剂盒时的用量少，成本更低)。

实施例5

本实施例用以说明上述实施例制得的PLD在sdLDL-C检测试剂盒开发中的应用。

将纯化获得的磷脂酶D蛋白按照2.1KU/L的浓度添加到sd LDL-C检测试剂盒(代替的试剂盒是现有sd LDL-C检测试剂盒中的进口PLD)中，并对试剂盒的性能进行评测：

首先，按照表2设置两个对照组和一个实验组，对照组1为外购试剂(批号为20220101201)，对照组2为本公司在售试剂盒(已申报专利，专利申请号为202010532055.2)，实验组1为“将本发明PLD蛋白代替对对照组2中进口PLD”的试剂盒(蛋白按照2.1KU/L的浓度添加)。

表2分组说明

利用对照组1、2以及实验组1试剂进行同步检测，包括sd LDL-C定标测试数据(0小时)、质控、血清部分。结果如表3、4、5所示。

表3各组的定标测试数据结果(0小时)

表4质控部分结果

表5血清部分结果

结果显示，用重组DNA技术对野生型磷脂酶D基因进行定点突变在链球菌中能够高效表达PLD蛋白替代进口PLD结果良好，试剂各方面性能优良，可以实现替代。我们同样也对试剂进行了开瓶处理，结果显示试剂开瓶效果稳定，第28天和第0天血清和偏差在6％以内，符合产品技术要求。同样，采用本发明自制PLD等量替换sd LDL-C检测试剂盒中原采用的进口PLD，按照sd LDL-C检测试剂盒的技术要求分别测定试剂盒的空白吸光度、准确度、灵敏度、精密度及线性等。测定结果表明，采用本发明自制PLD的sd LDL-C检测试剂盒在完全符合产品技术要求的同时，大大降低了产品生产成本，具有很好的发展应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。