一种MRD检测产品

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是涉及一种MRD检测产品。

背景技术

多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)发病率明显增加，已成为影响人类健康的重要疾病之一，为发病率居第二位的血液肿瘤，占血液系统恶性肿瘤的10％。在过去十年，MM治疗方案不断优化，疗效显著增加，同时增加了完全缓解率和生存率，目前治疗方法除传统的化疗外，靶向药物和细胞免疫治疗已成为新的发展方向。嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptions Tcells，CAR-T)通过基因改造T细胞实现对肿瘤相关抗原特异性识别，使效应T细胞充分发挥抗肿瘤作用，是目前细胞免疫治疗的重点，是目前医学领域治疗恶性肿瘤最前沿的科学，在多发性骨髓瘤等血液系统疾病治疗上获得了显著的效果，常规治疗无效的难治复发病缓解率显著提高，改善患者预后。但是因为诸多原因，该方法达到长期缓解的比例不足50％，治疗后注意监测，早期发现微小残留病(MinimalResidue Disease，MRD)，早期进行桥接移植或者二次CAR-T治疗是重中之重。流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是一种能够对单个细胞实现定量分析的检测手段，具有快速、高精度、多参数等优点，是目前最先进的细胞定量分析方法之一。FCM在临床及科研领域得到广泛应用，尤其是临床体外诊断已有广泛和深入的应用，是白血病、淋巴瘤等恶性疾病的临床诊断的金标准。利用FCM对MM患者进行骨髓MRD检测是重要的预后变量，使用特定的抗体组合物，配合多色流式细胞仪，可以有效评估预后、检测复发，并能够指导治疗方案的选择，是MM重要的临床评价指标。

然而，检测抗体的正确选择是实现上述临床评价的关键所在，例如最为常规的分析方案是胞膜泛浆细胞标志CD38辅以SSC或者CD45(CD38/SSC或者CD38/CD138双参数)进行设门选出浆细胞，但在对于CD38单抗、CD138单抗治疗后患者，或CD38-CAR-T、CD138-Car-T细胞输注治疗后的患者上，使用CD38或CD138进行设门则不再适用，原因是治疗后部分正常或异常的浆细胞发生克隆演变，其表面CD38抗原、CD138抗原已呈现表达丢失或减弱，即CD38、CD138抗原会出现阴性表达，因此临床上尚无新的有效方案能够设门选出目的浆细胞。为解决该问题，科研人员已做过研究性的探索，包括Tembhare等研究使用CD38联合CD45/CD138/SSC设门浆细胞在单抗及CAR-T细胞输注治疗后检测MRD，但其依然存有如下缺陷：1、CD138在MM的表达率为99.5％，在EDTA抗凝血样本中，从而影响浆细胞的圈门效率，2、CD38在MM中的表达率>80％，在单核细胞上表达，在部分MM中CD38表达减弱，均会影响浆细胞的圈门效率，并且CD38抗原在正常B细胞的成熟过程中，在B细胞的前体阶段强表达，而在MM中浆细胞CD38呈强表达，从而影响了CD38设门选出浆细胞的灵敏度。3、不适用于CD38-CAR-T细胞或CD38-CD138-CAR-T双靶点细胞输注治疗的患者和CD38单抗和CD138单抗治疗后的患者。

更为重要的是，在接检到治疗后残留监测的样本时，检测申请单上缺乏详细的治疗史，比如是采用传统放化疗还是生物治疗，生物治疗具体是哪种方案，因此由于这些关键信息的缺失，会导致检测者不能在第一时间根据具体治疗方案调整或优化检测方案，所以常导致检测结果呈假阴性。为减少假阴性的发生，提高检测准确率，作为检测者来说，迫切的需要寻找更好的检测方案来弥补现有检测手段的不足，满足临床的需求。尽管有文献报道CD56等抗原在浆细胞上表达，可用于检测浆细胞，但目前检测方案一般不将很多个指标纳入多发性骨髓瘤患者治疗后残留检测方案里面，不同的检测机构检测方案也不同，目前并没有统一的检测方案，常用的以4到8个抗体的组合居多，有的仅检测浆细胞膜抗原的，有的仅检测浆细胞胞浆轻链，这些检测方案均不能解决假阴性的问题。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种MRD检测产品，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供抗CD38抗体、抗CD45抗体、抗CD229抗体、抗CD269抗体和抗CD138抗体在制备多发性骨髓瘤微小残留病(MRD)检测产品中的用途。

本发明还提供一种MRD检测产品，所述MRD检测产品中包括MRD检测试剂，所述MRD检测试剂包括抗CD38抗体、抗CD45抗体、抗CD229抗体、抗CD269抗体和抗CD138抗体。

本发明还提供一种MRD治疗药物的筛选方法，所述筛选方法包括用所述MRD检测产品检测离体样本，所述离体样本来自经备选药物作用后的受试对象。

如上所述，本发明的MRD检测产品，具有以下有益效果：本发明采用2管8色方案，可以有效设门圈出CD38-的浆细胞和CD38+的浆细胞，覆盖了浆细胞膜抗原和胞浆轻链，即覆盖最完整的浆细胞群，尤其是CD229、CD269指标，这两个指标目前在多发性骨髓瘤残留的检测中鲜少采用，可大幅降低假阳性率和漏诊概率。

附图说明

图1显示为正常浆细胞分析结果图；

A管设门策略为：P1：去黏连细胞门P1；P2：设置活细胞门，得到单个活细胞。P2门内使用CD45/SSC抗体设置各血细胞门；P2门内多标志组合设门观察浆细胞、淋巴细胞、单核细胞、粒细胞，以及是否存在明显的肿瘤细胞或者异常细胞；浆细胞门使用CD45/CD38、CD38/CD138、SSC/CD38抗体设门(P8、P9、P11)；

B管设门策略为：P1：去黏连细胞门P1；P2：设置活细胞门，得到单个活细胞；P2门内使用CD45/SSC抗体设置各血细胞门；P2门内多标志组合设门观察浆细胞、淋巴细胞、单核细胞、粒细胞，以及是否存在明显的肿瘤细胞或者异常细胞；浆细胞门使用CD45/CD38、CD38/CD229、SSC/CD38抗体设门(P8、P9、P10)，B细胞设门采用CD45/CD19抗体设门(CD19+Bcells)，作为内对照，判断胞浆抗体染色情况。

图中可通过上述设门策略区分A管和B管。

图2显示为多发性骨髓瘤患者传统化疗之后MRD检测结果图。

图3显示为多发性骨髓瘤患者CD269单抗治疗之后MRD检测结果图。

图4显示为多发性骨髓瘤患者CD38单抗治疗之后MRD检测结果图。

图5显示为用传统方法检测MM-MRD样本的检测结果图。

图6显示为用本发明的方法检测MM-MRD样本的检测结果图。

具体实施方式

本发明提供抗CD38抗体、抗CD45抗体、抗CD229抗体、抗CD269抗体和抗CD138抗体在制备多发性骨髓瘤微小残留病(MRD)检测产品中的用途。

CD38在正常浆细胞中的表达强度明显高于其他造血细胞，在多发性骨髓瘤中CD38出现强表达或部分呈弱表达。

CD45一般呈阳性表达，正常骨髓中存在少量CD45-/dim的浆细胞，肿瘤性浆细胞出现CD45-/dim，伴少量CD45+亚群。

CD229在正常浆细胞、T细胞上表达，在B细胞单核细胞上弱表达，在异常浆细胞上表达的平均荧光强度明显高于正常浆细胞，可以作为浆细胞设门的可靠指标，可用于CD38、CD138生物治疗后残留评估。

CD269是B细胞成熟抗原(即BCMA)，仅表达于生发中心B细胞、恶性及正常浆细胞表面，呈相对特异性的高表达与骨髓瘤细胞表面，在骨瘤患者中的表达率70％-80％，是多发性骨髓瘤免疫治疗的靶点。

CD138仅表达于浆细胞和骨髓瘤细胞，为相比CD38而言更为特异的浆细胞标志，绝大部分在多发性骨髓瘤患者表达，CD138在非造血系统中的上皮细胞、间充质细胞和肿瘤细胞。

在本发明的某些实施方式中，所述MRD检测产品中还包括以下中的任一种或多种：抗CD81抗体、抗CD117抗体、抗CD20抗体、抗CD200抗体、抗CD56抗体、抗CD19抗体、抗CD27抗体、抗Kappa轻链抗体或抗Lambda轻链抗体。

CD117、CD20和CD200正常浆细胞均不表达，在肿瘤性浆细胞中部分表达。

CD56通常在正常浆细胞中不表达，常表达于肿瘤性浆细胞中。

CD19在大部分浆细胞中表达，表达强度低于B细胞，部分亚细胞群CD19阴性表达，肿瘤性浆细胞一般不表达CD19。

CD27在正常浆细胞中表达，多发性骨髓瘤患者CD27不表达，是逃避机体免疫系统的重要指标。

Kappa和Lambda在正常和异常浆细胞基本都不表达，在鉴别浆细胞克隆性时需要检测胞内Kappa和Lambda抗原，恶性浆细胞多为单克隆，正常浆细胞为多克隆表达。如果出现与正常表达模式不同，可疑为恶性，排除其他因素影响后诊断MRD阳性。

所述MRD检测产品为MRD诊断产品。所述MRD检测产品为利用流式细胞术检测的产品。

本发明还提供一种MRD检测产品，所述MRD检测产品中包括MRD检测试剂，所述MRD检测试剂包括抗CD38抗体、抗CD45抗体、抗CD229抗体、抗CD269抗体和抗CD138抗体。

在一种实施方式中，所述MRD检测试剂还包括抗CD81抗体、抗CD117抗体、抗CD20抗体、抗CD200抗体、抗CD56抗体、抗CD19抗体、抗CD27抗体、抗Kappa轻链抗体或抗Lambda轻链抗体中的任一种或多种。

在一种实施方式中，所述MRD检测试剂包括第一MRD检测试剂和第二MRD检测试剂，所述第一MRD检测试剂中包括抗CD38抗体、抗CD45抗体、抗CD229抗体，所述第二MRD检测试剂中包括抗CD38抗体、抗CD45抗体、抗CD138抗体。

所述第一MRD检测试剂中还包括抗CD269抗体、抗CD81抗体、抗CD117抗体、抗CD20抗体、抗CD200抗体、抗CD56抗体、抗CD19抗体、抗CD27抗体、抗Kappa轻链抗体或抗Lambda轻链抗体中的任一种或多种，第二MRD检测试剂则包括抗CD269抗体、抗CD81抗体、抗CD117抗体、抗CD20抗体、抗CD200抗体、抗CD56抗体、抗CD19抗体、抗CD27抗体、抗Kappa轻链抗体或抗Lambda轻链抗体中除第一MRD检测试剂中包含的抗体外的其余抗体。

在一种实施方式中，所述第一MRD检测试剂中还包括抗CD269抗体、抗CD81抗体、抗CD117抗体、抗CD20抗体、抗CD200抗体、抗CD56抗体、抗CD19抗体、抗CD27抗体、抗Kappa轻链抗体或抗Lambda轻链抗体中的五种抗体，第二MRD检测试剂则包括抗CD269抗体、抗CD81抗体、抗CD117抗体、抗CD20抗体、抗CD200抗体、抗CD56抗体、抗CD19抗体、抗CD27抗体、抗Kappa轻链抗体或抗Lambda轻链抗体中除第一MRD检测试剂中包含的五种抗体外的其余五种抗体。

在一种实施方式中，所述第一MRD检测试剂中包括抗CD38抗体、抗CD45抗体、抗CD229抗体、抗CD269抗体、抗CD81抗体、抗CD117抗体、抗CD20抗体和抗CD200抗体。

在一种实施方式中，所述第二MRD检测试剂中包括抗CD38抗体、抗CD45抗体、抗CD138抗体、抗CD56抗体、抗CD19抗体、抗CD27抗体、抗Kappa轻链抗体和抗Lambda轻链抗体。

在一种实施方式中，所述MRD检测产品中还包括以下中的任一种或多种：红细胞裂解液、缓冲液或破膜剂。所述缓冲液例如为PBS、生理盐水等流式细胞术中常用的缓冲液。

所述红细胞裂解液或破膜剂均可以市购得到。

本发明还提供一种MRD治疗药物的筛选方法，所述筛选方法包括用所述MRD检测产品检测离体样本，所述离体样本来自经备选药物作用后的受试对象。

具体的，MRD治疗药物筛选方法为检测来源于经MRD治疗药物作用后的受试对象的样本，以观察MRD治疗药物的有效性。

筛选方法为按照以下方式进行方案设计和结果判断：通过监测异常浆细胞的表型，即肿瘤细胞异常获得正常不表达的标志或者丢失正常表达标志。

离体样本为多发性骨髓瘤患者治疗后的骨髓或外周血样本。治疗方法选自传统化疗、CD269单抗治疗、CD38单抗治疗、CD38单抗治疗、CD138 Car-T治疗或CD38 Car-T治疗。待测样本中有残存的少量正常浆细胞，在检测过程中残存的正常浆细胞可以作为检测的内部质控。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1流式细胞术检测多发性骨髓瘤残留病细胞

实验原理：

将标有荧光素的抗体与单细胞悬液在室温孵育，使荧光抗体与细胞表面相应的抗原结合；单细胞悬液在鞘液的包裹下形成单细胞液流并流经检测窗口；仪器产生的激光会激发抗体上标记的荧光素从而发出特定波长的光；仪器对不同波长的光进行分别检测，并转换成电信号；电信号经计算机系统处理后可进行分析。

实验仪器、试剂：

BD CantoII流式细胞仪、CD45 percp-cy5.5、CD117-BV510、CD81-FITC、CD27-BV510、CD200-APC、CD269-PE、CD38-PE-CY7、CD138-BV421、CD56-PE、CD38-FITC、CD229-BV421、CD20-APC-CY7，第1至第7个试剂厂家为Biolegend，货号分别为304028、313219、349504、302835、329208、357504、356608；第8至13抗体为BD公司产品，货号分别为562935、8308891、9217298、744901、560734；CD19-PE-CY7为贝克曼产品，货号：IM3628；Kappa-APC为Dako产品，货号：C0222；cLambda-APC-CY7为Cytogons产品，货号：CYT-LAC750；红细胞裂解液、破膜剂均为BD公司产品，货号分别为70-LSB0、641776。标本：

1)健康人外周血(含正常浆细胞)；

2)多发性骨髓瘤患者传统化疗之后的外周血标本；

3)多发性骨髓瘤患者CD269单抗治疗后的外周血标本；

4)多发性骨髓瘤患者CD38单抗治疗后的外周血标本。

实验步骤：

1.取相应数量的流式专用管，编号并注明标本编号

2.各管内加入相应抗体，抗体用量根据抗体使用说明书添加，并注意要将抗体加到管底，抗体的荧光标记顺序分别为：

A管：CD81/CD269/CD38/CD45/CD229/CD117/CD20/CD200

B管：CD38/CD56/CD19/CD45/CD138/CD27/cLambda/cKappa

3.根据标本计数加样本，按照以上顺序依次加抗体。

4.震荡，混匀，室温避光孵育20分钟。

5.加1-3ml 10×裂解液，震荡混匀，避光裂解10分钟。1500rpm，5分钟离心，弃上清。

6.加1-3mlPBS缓冲液，轻轻震荡混匀，1500rpm，5分钟离心，弃上清。Tube1加PAS重悬，带上机。

7.B管加2mlPBS，混匀，离心去上清，加破膜剂a液，于各管中分别加入100μLPBMC，室温孵育15min。

8.B管加2ml PBS，离心(5min，1500转)，去上清，加Kappa、Lamnda，加破膜剂b 100μL，混匀避光15min。

9.B管加2ml PBS，混匀，离心(5min，1500转)，去上清，加500μLPBS，待上机。

10.处理好的细胞用0.5％的福尔马林液固定(300μL/管)，可以在2-8℃保存5天。

11.应用BD FACSDive Software分析数据，首先使用前向角光散射(Forwa rd scatter，FSC)的面积(a rea,A)和高度(height,H)设置去黏连细胞门(用P1表示)。然后显示P1内细胞，使用FSC/侧向角光散射(side scatter,SSC)设置活细胞门(用P2表示)，得到单个活细胞。单个活细胞门(P2门)内首先使用CD45/SSC设置各血细胞门，大致观察淋巴细胞、单核细胞、粒细胞，以及是否存在明显的肿瘤细胞或者异常细胞。单个活细胞门(P2门)内多标志组合设门观察浆细胞，尤其是单克隆浆细胞：A管样本选择CD38/CD138、CD45/CD38、SSC/CD38共同设门，B管样本选择CD38/CD229、CD45/CD38/CD138、SSC/CD229、SSC/CD38联合cKappa和cLambda等抗原共同设门以区分浆细胞，通过浆细胞的表型来判断良恶性。

实验结果：

结果如图1所示，浆细胞全表达CD19、CD27st、CD38、CD45dim、CD81、CD138、CD229，不表达CD20、CD56、CD117、CD200，cLambda、cKappa呈多克隆表达，此标本为MRD阴性。

结果如图2所示，此标本为传统化疗后的标本。浆细胞全表达CD20dim、CD27、CD38、CD45dim、CD56、CD138、cLambda，部分细胞表达CD200、CD269dim，不表达CD19、CD81、cKappa。

结果如图3所示，浆细胞全表达CD27、CD38、CD45dim、CD138、CD229、cKappa，部分细胞表达CD20dim、CD81，少数表达CD19，不表达CD56、cLambda。本标本中CD269治疗后，CD269阴性表达。

结果如图4所示，浆细胞全表达CD229、cKappa，部分CD27和CD138弱表达，CD19、CD38、CD45、CD56、CD117、CD81、CD20、CD200、CD269、cLambda均阴性表达。本标本中CD45/CD229、cKappa在捕捉单克隆浆细胞起到关键性作用。

本发明的方案具有以下优势：

(1)使用多种标志组合设门，可以避免CD38和/或CD138治疗后因为CD38和/或CD138表达减弱或者丢失造成的漏诊。本发明的方案发现，CD38、CD138、CD56、CD19均阴性的病例，均表达CD229和cKappa或cLambda，六个标志可以覆盖100％的病例，覆盖最完整浆细胞群；

(2)多种标志组合设门，除了防止漏诊以外，还有助于发现特殊克隆及弱势克隆，虽然大多数肿瘤是单一克隆，少部分肿瘤可以同时存在2-3个克隆，一般情况下，小克隆很容易被忽视。而这些小克隆对于将来复发、表型改变甚至某一时刻主要克隆的演化，是否诊断二次肿瘤，以及揭示肿瘤发生发展规律并针对性治疗，有非常重大的意义；

(3)组合设门不同于传统的CD38设门，不会受到嗜碱性粒细胞、浆细胞样树突细胞、肥大细胞、粒细胞等的干扰，避免枸橼酸钠对CD138的影响；

(4)本组合设门不会受到生物靶向治疗的影响。本发明的组合设门中，CD229表达在浆细胞、T和B细胞上表达，胞浆Kappa和Lambda表达在胞内，针对此类抗原开展的靶向治疗具有可预见的毒副作用，或靶向胞浆抗原具有较大技术难度，是未来针对新靶点的CAR-T等靶向生物治疗很难选择的标志，该组合设门几乎不受到治疗方案选择或改变的影响，是目前多发性骨髓瘤靶向治疗所急需的，适合广泛应用推广的MRD检测和分析方案。

实施例2两种方法检测多发性骨髓瘤残留病治疗后的样本

1)用传统方法检测MM-MRD

使用的抗体为抗CD38抗体、抗CD45抗体、抗CD56抗体、抗CD138抗体、抗CD27抗体、抗CD19抗体、抗Kappa轻链抗体、抗Lambda轻链抗体，其他步骤与实施例1相同。

如图5所示，浆细胞全表达CD38、CD138、CD27、CD19dim，不表达CD56，ckappa/cLambda＝0.7，为多克隆表达，浆细胞未见轻链限制性表达，结果为MRD阴性。

2)用本发明的方法检测MM-MRD

实验步骤同实施例1。

结果如图6所示，0.008％的异常浆细胞(图示墨绿色)表达CD200、CD27、CD38、CD138、CD117、CD229、cKappa，部分表达CD56，不表达CD19、cLambda、CD269。

综上，传统方法检测为假阴性，而使用本发明的方法成功捕捉到异常细胞，检测结果为MRD阳性。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。