一种与小麦苗期侧根数目基因座紧密连锁的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种与小麦苗期侧根数目主效QTL紧密连锁的分子标记、其检测引物及其在作物选种培育中的应用。

背景技术

小麦（Triticum aestivum L.）是我国第二大口粮作物，其产量和品质直接关系到国家粮食安全和人民生活水平。小麦根系是植株生长发育的基础，也是吸收矿质元素和水分的重要器官，其形态数量性状、活力与地上部生长发育及产量和品质具有密切关系。小麦能否获得高产优质很大程度取决于根系生长发育情况。而侧根作为决定小麦整体根系结构构成的主要因素之一，是小麦根系吸收网络的重要组成部分，在固定植株、扩大根系吸收面积及增强根系生理功能等方面具有重要意义。

侧根是一个受多基因控制的复杂数量性状，而QTL定位是侧根性状育种中常用的研究方法，可以将不同的等位基因导入优良品种，通过分子育种产生所需要的根系表型。因此，研究小麦主效QTL定位及开发其紧密连锁的分子标记，发掘侧根数目的优异等位基因并将其利用于育种中，将有助于培育出根系活力较强的高产优质小麦新品种，保障我国粮食安全。

迄今，利用多个不同遗传背景以及多个作图群体在小麦不同染色体上已检测到一些侧根相关性状QTL位点。但是研究所用遗传群体和分子标记的差异，定位的侧根相关性状QTL置信区间较大，其连锁标记距离目标基因较远，加上遗传背景等因素的影响，导致与侧根性状QTL连锁的分子标记不能有效用于小麦根系育种。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种与小麦苗期侧根数目基因座紧密连锁的分子标记及其应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种分子标记，以苗期的小麦基因组 DNA 为模板，以SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的人工核苷酸序列为引物对经 PCR 扩增得到。

一种分子标记，与小麦苗期侧根数目的数量性状基因座紧密连锁，所述分子标记包含SEQ ID NO：1所示的序列。

一种分子标记，其核苷酸如SEQ ID NO：1所示。

上述的分子标记，所述数量性状基因座为小麦苗期侧根数目主效QTL 

包含上述分子标记的载体同样在本发明的保护范围之内。

包含上述分子标记的重组细胞同样在本发明的保护范围之内。

包含上述载体的重组细胞同样在本发明的保护范围之内。

一种引物对，用于扩增与小麦苗期侧根数目主效QTL紧密连锁的分子标记。

所述引物对的引物1的核苷酸为SEQ ID NO：2所示序列，引物2的核苷酸为SEQ IDNO：3所示序列。

一种检测试剂盒，包含上述引物对当中的一条或两条。

一种辅助鉴定小麦苗期侧根数目性状的方法，包括以下步骤：根据上述分子标记的核苷酸序列设计引物，以被检测小麦基因组 DNA 为模板进行扩增，并判断扩增产物中是否存在该分子标记。

制备上述引物对的方法，包括将上述的两条单链DNA分别单独包装的步骤。

用于鉴定或辅助鉴定小麦苗期侧根数目性状的产品，所述产品含有上述的引物对。

用于鉴定或辅助鉴定小麦苗期侧根数目性状的方法，检测待测小麦种质资源中是否携带小麦苗期侧根数目QTL 

（1）提取待测小麦叶片的基因组DNA；

（2）以待测小麦叶片的基因组DNA为模板，采用权利要求4所述的引物对进行PCR扩增；

（3）将上述PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，若电泳产物存在大小为227bp的DNA片段，说明待测小麦携带苗期侧根数目增多的

作为本发明的一种优选技术方案，在步骤（2）中所述PCR扩增的体系为10μL，包括：1μL浓度为2μmol/L的SEQ ID NO:2所示的上游引物；1μL浓度为2μmol/L的SEQ ID NO:3所示的下游引物；2μL浓度为100ng/μL以上的DNA模板；5μl 2×3G Taq Master Mix；1μl ddH

作为本发明的一种优选技术方案，所述PCR扩增程序如下：95℃预变性3min；95℃变性15s，59℃退火15s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

作为本发明的一种优选技术方案，在步骤（3）中，选用10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，每100mL凝胶溶液中含有9.75g丙烯酰胺和0.25gN,N´-亚甲基双丙烯酰胺。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明开发的分子标记

附图说明

图1为分子标记

图2为利用Join Map4.0和WinQTLCart进行QTL-

图3为182个RIL家系基于

具体实施方式

以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。

在以下实施例的描述中，为了说明而不是为了限定，提出了诸如特定系统结构、技术之类的具体细节，以便透彻理解本申请实施例。然而，本领域的技术人员应当清楚，在没有这些具体细节的其它实施例中也可以实现本申请。

应当理解，当在本申请说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素和/或其集合的存在或添加。

还应当理解，在本申请说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。

另外，在本申请说明书和所附权利要求书的描述中，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本申请说明书中描述的参考“一个实施例”或“一些实施例”等意味着在本申请的一个或多个实施例中包括结合该实施例描述的特定特征、结构或特点。由此，在本说明书中的不同之处出现的语句“在一个实施例中”、“在一些实施例中”、“在其他一些实施例中”、“在另外一些实施例中”等不是必然都参考相同的实施例，而是意味着“一个或多个但不是所有的实施例”，除非是以其他方式另外特别强调。术语“包括”、“包含”、“具有”及它们的变形都意味着“包括但不限于”，除非是以其他方式另外特别强调。

本发明公开了来自小麦TAA10的苗期侧根数目QTL 

实施例1、与小麦苗期侧根数目

以普通小麦TAA10和人工合成六倍体小麦XX329为亲本及其杂交后自交衍生的包含182个RIL家系为供试材料，利用QTL定位分析，将侧根数目主效QTL（

分子标记

分子标记

以小麦品种TAA10的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO:2所示的上游引物和SEQ IDNO:3所示的下游引物进行PCR扩增。10uL PCR反应体系为：1uL浓度为2umol/L的SEQ ID NO：2所示的上游引物；1uL浓度为2umol/L的SEQ ID NO：3所示的下游引物；2uL 浓度为50ng/ul的DNA模板；5uL 2×3G Taq Master Mix；1uL ddH

所得扩增产物在10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶（每100mL凝胶溶液中含有9.75g丙烯酰胺和0.25g甲叉丙烯酰胺）上进行电泳、分离，最终扩增产物的分子量为208bp（如SEQID NO：1所示）。

实施例2、分子标记

与小麦苗期侧根数目QLrn-5D紧密连锁的分子标记

步骤1：构建182个家系的F

以TAA10和XX329为亲本进行杂交得到杂种F

F

步骤2：采用CTAB法提取的亲本及RIL群体叶片DNA，具体的方法和程序如下：

（1）取钢珠和幼嫩叶片0.2g左右，置于2.0ml Eppendorf管中，将Eppendorf管放入液氮中，振荡使叶片磨成细粉。

（2）在离心管中加入65℃预热的1×CTAB提取缓冲液600µl，剧烈振荡混匀， 65℃水浴30min，其间每10min小心摇匀一次。

（4）30min后取出离心管，放置于室温冷却，在通风橱中加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)并小心充分摇动离心管1min，然后静置至有机相由无色→绿色→深绿色。

（5）室温下，10000rpm离心10min，之后吸上清450µl至1.5ml离心管中。

（6）在上清中加入等体积预冷的异丙醇（-20℃），小心混匀后于-20℃放置20min。

（7）4℃，10000rpm离心10min，小心倒掉上清后加入75%乙醇600µl进行漂洗2次。

（8）小心倒掉上清并放置常温干燥，晾干DNA后，加入适量的灭菌ddH

用SEQ ID NO:2所示的上游引物和SEQ ID NO:3所示的下游引物对上述提取的所有DNA进行PCR扩增。

PCR反应体系为10uL，包括：1uL浓度为2umol/L的SEQ ID NO：1所示的上游引物；1uL浓度为2umol/L的SEQ ID NO：2所示的下游引物；2uL 浓度为50ng/ul的DNA模板；5uL 2×3G Taq Master Mix；1uL ddH

PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，59℃退火15s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存；

所得扩增产物在10.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳缓冲液为1*TBE，180V恒压3h。

硝酸银染色步骤：电泳完毕后，剥离胶块在染色液中染色20min，用去离子水冲洗3次，然后转到显影液中显影至扩增条带清晰可见，用自来水清洗2次。

将显影后的胶块放至观片灯上，拍照得到凝胶图片，记录带型，如图1所示。

带型读取结果：TAA10扩增产物大小为227bp，XX329扩增产物大小为204bp，包含182个RIL家系群体中带型与TAA10相同的有91个，带型与XX329相同的有63个。

步骤3：进行QTL定位分析和检测

将RIL群体182个家系在水培条件下通气培养，考察其发芽后第8天的苗期侧根数目，其中每个株系均设置3个生物学重复，每个生物学重复至少8株幼苗。同时结合182个RIL家系基因型资料构建高密度遗传连锁图谱，采用WinQTLCart进行加性QTL定位分析，以LOD≥ 2.5为标准。QTL分析结果如图2所示，在小麦5D染色体长臂上检测到了一个控制苗期侧根数目的主效QTL （

步骤4：基于单标记

采用

结果表明，与来自XX329等位基因减少侧根数目的效应相比，来自TAA10的等位基因可增加苗期侧根数目。这说明SEQ ID NO:2所示的上游引物和SEQ ID NO:3所示的下游引物在小麦品种TAA10的DNA中获得的分子量为227bp的扩增产物，即为与小麦苗期侧根数目QTL紧密连锁的分子标记（即分子标记

实施例3、分子标记

基于前面的试验和分析可知：

（1）由SEQ ID NO:2所示的上游引物和SEQ ID NO:3所示的下游引物组成的引物对，可以应用在鉴定或辅助鉴定小麦苗期侧根数目性状中，还可以应用在获取与小麦苗期侧根数目相关的分子标记中；

（2）分子标记

在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述或记载的部分，可以参见其它实施例的相关描述。

综上各实施例可见，本发明涉及与小麦苗期侧根数目

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本发明的保护范围之内。